전임상 약물 검사를 위한 난소암 환자 유래 오가노이드 모델

이 프로토콜은 환자 유래 난소암 오가노이드를 사용하여 약물 생존도 분석을 수행하기 위한 저비용 방법을 설명합니다. 이 기술의 주요 장점은 저렴하고 쉽게 구할 수 있는 재료와 실험실 장비를 사용한다는 것입니다. 이 방법은 고가의 고처리량 약물 스크리닝을 수행하기 전에 사용할 수 있습니다.

이 방법은 환자 유래 난소암 오가노이드에서 약물 생존도 분석을 수행하는 것을 다루지만, 쥐 유래 오가노이드 시스템을 포함한 모든 오가노이드 시스템에 적용할 수 있습니다. 먼저 명시야 현미경으로 오가노이드를 함유한 기저막 추출물 또는 BME를 관찰하여 70-90%의 밀도를 확인합니다. 피펫을 사용하여 1-2mL의 예열된 베이스 배지를 오가노이드가 들어 있는 웰에 추가하고 위아래로 피펫팅하여 오가노이드를 기계적으로 해리합니다.

전체 오가노이드 현탁액을 15밀리리터 원뿔형 튜브에 옮기고 튜브를 5-10초 동안 소용돌이쳐 세포를 추가로 분해합니다. 그런 다음, 실온에서 5분 동안 1, 107G에서 세포를 원심분리합니다. 단일 채널 피펫을 사용하여 상층액을 흡입하고 버립니다.

섭씨 37도로 예열된 오가노이드 해리 시약 1밀리리터에 펠릿을 재현탁시키고 현탁액을 1.5밀리리터 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. 샘플을 섭씨 37도에서 7분 동안 배양합니다. 그런 다음 실온에서 5분 동안 1, 107G에서 셀 현탁액의 결과를 원심분리합니다.

상층액을 버린 후 세포 펠릿을 예열된 베이스 배지 1밀리리터에 재현탁시킵니다. 기본적인 매체 및 BME의 혼합에 있는 세포를 재구성해, 20의 마지막 농도 의 10 마이크로리터 당 000의 세포를 유지하. 검은색 불투명 96웰 플레이트의 웰당 재현탁 세포의 3마이크로리터 방울 1개를 플레이트합니다.

섭씨 37도의 세포 배양 인큐베이터에서 15분 동안 플레이트를 배양합니다. 마지막으로, 100마이크로리터의 예열된 고급 오가노이드 배지를 각 웰에 첨가한 후 섭씨 37도에서 24-72시간 동안 플레이트를 배양합니다. 오가노이드를 도금한 후 이틀 후에 약물 처리를 수행합니다.

약물 처리 후 7일 후에 오가노이드에 대한 생존도 분석을 수행합니다. 각 웰에 100마이크로리터의 생존도 분석 시약을 추가하여 총 부피를 200마이크로리터로 만들고 플레이트를 80RPM에서 5분 동안 흔듭니다. 그런 다음 플레이트를 실온에서 추가로 25분 동안 배양합니다.

한편, 생물 발광 플레이트 리더를 켜고 아이 컨트롤 소프트웨어를 엽니다. 기기 연결로 이동"하고 Infinite 200Pro를 선택하십시오"발광 선택" 및 기본 스크립트"다음 드롭다운 메뉴에서 BD 96 FB Falcon BD Falcon 96 Flat Black"을 플레이트 유형으로 선택하여 발광 매개변수를 설정합니다. 감쇠를 none으로 할당합니다.

통합 시간은 1000밀리초이고 정착 시간은 0밀리초입니다. 마지막으로 플레이트의 뚜껑을 열고 플레이트 리더에 로드한 다음 시작"을 눌러 시작합니다. 명시야 이미지는 프로토콜에 사용된 두 개의 서로 다른 환자 유래 오가노이드(PDO)에 대해 획득되었습니다.

종양 생검에서 파생된 PDO 1과 복수에서 파생된 PDO 2. 생존도 분석의 결과는 PDO 1과 PDO 2를 다양한 농도의 카보플라틴으로 처리한 후 살아있는 세포의 비율을 밝혔습니다. 계산된 성장률 또는 GR 값은 해당 카보플라틴 농도에 대해 표시되었으며, GR 메트릭은 PDO 1의 GR50 값이 PDO 2의 GR50 값보다 훨씬 높다는 것을 보여주었습니다.

이것은 PDO one이 백금 화학 요법에 더 내성이 있음을 나타냅니다 도금하는 동안 세포 현탁액의 3 마이크로 리터 방울을 우물 중앙에 직접 배치하는 것이 중요합니다. 액적을 웰 가장자리에 가깝게 배치하면 액적이 붕괴되어 분석 결과에 영향을 미칠 수 있습니다.