이 프로토콜은 면역 결핍 마우스의 맹장벽에 환자 유래 암세포의 orthotopic 이식을 설명합니다. 이 모델은 진행성 대장암 전이성 질환을 재현합니다. 본 연구에서 제시된 기형외과 대장암 모델은 환자 유래 오가노이드 또는 환자 유래 이종이식 모델을 사용하여 연구할 수 없는 대장암 환자의 진행성 장 종양 및 전이성 질환의 임상 시나리오를 요약한 것입니다.
안락사된 쥐의 경우 가위와 집게를 사용하여 피부와 주변의 비종양 조직에서 종양을 조심스럽게 제거하여 종양을 추출합니다. 채취한 종양을 섭씨 4도의 PBS에 놓습니다. 칼날을 사용하여 1mm의 배지가 들어 있는 10cm 배양판에서 종양을 해리합니다.
균질한 해리된 샘플을 15밀리리터 원뿔형 튜브에 넣습니다. 그런 다음 배지를 최종 부피 5ml에 추가합니다. 그런 다음 튜브에 분해 배지를 추가합니다.
튜브를 섭씨 37도에서 1시간 동안 세포 배양 인큐베이터 내부의 45도 위치에 놓습니다. 1시간 배양 동안 15분마다 용액을 5밀리리터 피펫과 혼합합니다. 배양 후 배지 5ml를 넣고 잘 섞는다.
그런 다음 멸균 50밀리리터 튜브를 사용하여 100마이크로미터 세포 여과기로 용액을 분류합니다. 분류된 세포를 500g에서 실온에서 10분 동안 원심분리합니다. 상층액을 흡인하고 펠릿을 3밀리리터의 1x RBC 용해 완충액에 재현탁시킵니다.
실온에서 10분간 배양합니다. 그런 다음 3ml의 배지를 넣고 샘플을 혼합합니다. 실온에서 500g에서 10분 동안 원심분리하고 상층액을 흡인합니다.
5-10 밀리리터의 배지로 펠릿을 재현탁시키고 세포 계수기를 사용하여 총 세포 수를 계산합니다. 실온에서 10분 동안 500g에서 세포를 원심분리한 후 10ml의 PBS에 재현탁합니다. 원심 분리를 반복하고 PBS 10ml로 세척하십시오.
펠릿을 재현탁시켜 밀리리터당 6개 세포에 20 곱하기 10의 농도를 얻고 잘 혼합하여 균질한 세포 현탁액을 얻는다. 다음으로 맹장 주사를 위한 주사기 29g을 준비합니다. 종양 세포 현탁액 50마이크로리터를 주사기에 넣고 주사기에 기포가 남아 있지 않은지 확인합니다.
주사기를 얼음 위에 놓습니다. 먼저 소독 세제를 뿌리고 닦아 수술 부위를 소독합니다. 그런 다음 마우스 제모 기계를 사용하여 복부를 제모합니다.
마우스를 누운 자세로 놓고 클로르헥시딘 또는 포비돈 요오드로 문질러 복부를 소독합니다. 수술용 가위를 사용하여 하복부를 1cm 세로로 절개합니다. 피부를 조심스럽게 옆으로 분리하여 복막이 노출되도록 합니다.
그런 다음 복막에 0.5-1cm를 절개하여 맹장이 외부로 나오도록 합니다. 미리 절단된 멸균 거즈를 사용하여 쥐에서 맹장을 조심스럽게 분리합니다. 시중을 적시는 식염수는 시술 내내 사용되었다.
맹장을 집게로 조심스럽게 잡아 고정시킨 다음 바늘을 맹장 벽에 표면적으로 넣습니다. 천천히, 종양 세포 현탁액의 전체 50 마이크로리터 부피를 주입합니다. 이 프로세스는 약 10초가 걸립니다.
주입 후 맹장에서 바늘을 천천히 떼어내고 면 팁 어플리케이터로 주사 부위에 부드러운 압력을 가합니다. 식염수로 맹장을 세척하여 이물질을 제거하고 맹장을 동물의 복부로 되돌립니다. 5/0 봉합사를 사용하여 복막을 닫은 다음 5/0 봉합사를 사용하여 복부 피부를 닫습니다.
환자 유래 암세포를 이식한 마우스의 장에서 정형외과 CRC-PDX 종양이 관찰되었습니다. 맹장에 대한 헤마톡실린(hematoxylin) 및 에오신 염색에 의한 조직학적 분석은 종양 세포의 존재를 보여주었습니다. 조직학적 분석은 또한 이식된 마우스에서 폐 전이와 간 전이를 밝혀냈습니다.
정형외과 종양을 보유한 마우스는 비히클, 시험용 약물 또는 화학요법 약물인 이리노테칸으로 치료하였다. 마이크로 CT 스캔 이미지를 분석한 결과, 테스트 약물은 차량에 비해 종양 부피의 감소를 유도했으며, 이는 이리노테칸 치료와 병행하여 더욱 감소된 것으로 나타났습니다. 이 모델은 대장암 종양의 전이 생물학을 연구하는 데 도움이 될 것입니다.
