이 프로토콜은 전이성 암세포가 순환 계통에있는 동안 혈역학력에 어떻게 노출되는지의 특정 측면을 모방하기 위하여 액체 전단 긴장의 짧은 펄스에 현탁액에 있는 암세포를 노출합니다. 그것은 높은 수준의 유체 전단 응력의 짧은 펄스를 적용하는 비교적 간단한 기술이다. 이 프로토콜을 시도할 때는 제한되지 않은 바늘에 주의하고 이를 적용한 힘 전단 응력이 변경되기 때문에 구부리지 마십시오.
이 절차는 에어로졸을 생성할 수 있으므로 적절한 안전 조치를 사용합니다. 먼저, 성장 배지를 달아10센티미터 접시를 칼슘과 마그네슘이 없는 PBS로 세척하여 조직 배양 접시에서 70~90%의 컨컬라이트 PC3 세포를 방출한다. 그런 다음 PBS를 흡인하고 0.25 %의 트립신 1 밀리리터를 추가하십시오.
트립시화 후, 반전 된 현미경하에서 세포의 분리를 관찰한다. 트립신을 억제하려면 10%의 FBS를 함유한 DMEM/F12 배지 5밀리리터를 추가합니다. 다음으로, 세포 현탁액을 원내 튜브에 넣고 세포 농도 및 총 세포 수를 결정한다.
3분 동안 세포 현탁액을 300 x g로 원심분리한 다음, 수퍼네티티를 흡인하고 혈청이 없는 조직 배양 배지에서 펠릿을 재놓습니다. 7 밀리리터 라인에서 14 밀리리터 폴리스티렌 튜브의 바닥을 잘라 절단 튜브에 혼합 세포 현탁액을 배치합니다. 별도로 유체 전단 응력 노출 전에 세포의 정적 제어 샘플을 수집하여 해석을 수행하는 데 사용됩니다.
나머지 세포 서스펜션 샘플을 유체 전단 응력에 노출하려면 셀 서스펜션을 5 밀리리터 주사기로 끌어넣고 30 게이지 하프 인치 바늘을 부착합니다. 주사기 펌프에 캡이 없는 바늘로 주사기를 배치하고 고정하고 유량을 설정하여 원하는 수준의 유체 전단 응력에 도달합니다. 주사기 펌프를 실행하고 발포를 줄이기 위해 절단 튜브에서 식기 샘플을 약 45도 각도로 수집합니다.
주사기 펌프에서 주사기를 조심스럽게 제거하고 펜치를 사용하여 바늘을 제거하여 만지지 않도록주의하십시오. 세포 현탁액이 유체 전단 응력의 원하는 수의 펄스에 노출 될 때까지 절차를 반복하십시오. 유체 전단 응력에 세포를 노출하기 전에 정적 샘플로 생존 가능성 해석을 수행합니다.
효소 적 해석의 경우, 96 웰 플레이트로 복제된 정적 샘플에서 100개의 마이크로리터 알리쿼트를 전송합니다. 그런 다음 유체 전단 응력 노출 후 100 마이크로 리터의 샘플을 수집하고 96 웰 플레이트에 놓습니다. 각 샘플에 밀리리터 레사쥐린 용액당 0.15 밀리그램의 20 마이크로리터를 추가하고 100 마이크로리터만 함유된 웰에 첨가합니다.
섭씨 37도 조직 배양 배양 인큐베이터에서 웰 플레이트를 2시간 동안 배양한 다음 플레이트 판독기를 사용하여 형광및 흡광도를 측정하고 각 유체 전단 응력으로부터 의 평균 신호를 정적 제어 샘플에 평균으로 비교하여 실행 가능한 세포의 백분율을 얻습니다. 마찬가지로, 텍스트 원고에 설명된 바와 같이 유동 세포측정 및 clonogenic 분석법을 수행하기 위해 정적 샘플에서 알리쿼시를 수집합니다. 대표적인 분석에서, 합성 생검 유방 상피암세포의 생존가능성은 다수의 유체 전단 응력 펄스에 세포를 노출한 후 resazurin 변환을 사용하여 평가되었다.
각 세포주가 서로 다른 저항 프로파일을 표시하더라도, 유체 전단 응력 노출의 10 펄스 후에 생존가능성에 있는 유의한 다름이 없었습니다. 다양한 조직 기원으로부터의 추가 암 세포선은 유체 전단 스트레스로 인한 기계적 파괴에 대한 민감성으로 인해 10% 미만의 생존력을 보인 MIA PaCa-2 세포를 제외한 10펄스 의 유체 전단 응력 후 20% 이상의 생존가능성을 입증하였다. 유체 전단 응력 적용 전에 정적 샘플을 수집할 때 셀 서스펜션이 균질적으로 혼합되어 있는지 확인하십시오.
조심스럽게 펜치로 바늘을 제거하고 구부리거나 바늘을 만지지 않습니다. 세포 생존 가능성을 측정하는 것 외에도 유전자 발현, 세포 신호, 증식 및 마이그레이션의 변화를 평가할 수 있습니다. 유체 전단 스트레스에 노출의 모델로 이것을 사용하여, 하나는 암세포가 유체 전단 응에 의한 파괴에 저항하는 방법을 연구하고 암세포의 생물학에 액체 전단 응력의 효력을 평가할 수 있습니다.
이 기술은 순환 종양 세포에 액체 전단 긴장의 효력을 탐구하기 위하여 우리의 실험실 및 그 외에 의해 이용되었습니다. 이러한 연구는 유체 전단 스트레스가 암세포의 기계적 특성을 빠르게 변화시키고 이것이 유체 전단 스트레스에 의한 파괴에 저항하는 암세포의 능력에 기여한다는 것을 보여주었습니다.
