OLA는 합성 생물학 커뮤니티에 유용한 다목적 미세 유체 플랫폼입니다. 특히, 인공 세포를 생명 공학합니다. OLA 기반 리포솜은 생물학의 자기 조직화 원리를 이해하고 세포 모방 어셈블리를 구성하는 데 도움이 될 수 있습니다.
OLA는 단분산, 단층, 세포 크기의 리포솜을 고처리량 방식과 우수한 캡슐화 효율로 생산합니다. 50마이크로리터 정도의 매우 작은 샘플 부피가 필요하며 형성된 리포솜은 추가 온칩 실험에 즉시 사용할 수 있습니다. OLA는 미세 감금, 소포 역학 및 생체 분자 응축수 내의 생물학적 반응과 막과의 상호 작용을 연구하는 데 유용합니다.
OLA는 또한 예를 들어 항균제의 투과성 및 막 활성을 테스트하기 위해 약물 스크리닝을 위한 고처리량 플랫폼으로 적용되었습니다. PV 처리인 표면 기능화는 프로토콜의 중요한 단계이며 PV 용액이 내부 수성 및 지질 운반 유기 채널로 들어가는 것을 방지하기 위해 신중하게 수행해야 합니다. 또한 후반 작업 채널은 옥탄올 포켓이 분리되어 리포솜을 형성할 수 있을 만큼 충분히 길어야 합니다.
내 연구실의 박사 과정 학생 인 Ketan Ganar는 Chang Chen이 절차를 시연하는 데 도움을 줄 것입니다. 시작하려면 직경 4인치의 깨끗한 실리콘 웨이퍼를 가져다가 압축 공기를 사용하여 먼지 입자를 제거합니다. 스핀 코터에 웨이퍼를 장착하고 웨이퍼 중앙에 약 5밀리리터의 네거티브 포토레지스트를 부드럽게 분배합니다.
10 마이크로 미터 두께의 포토 레지스트 층을 얻으려면 초기 확산을 위해 초당 100 RRP의 가속도로 30 초 동안 500 RPM에서 스핀 코트 설정을 설정 한 다음 초당 500 RPM의 가속도로 3, 000 RPM에서 60 초 스핀을 설정합니다. 그런 다음 웨이퍼를 스핀 코팅합니다. 웨이퍼를 섭씨 65도에서 2 분 동안 가열판 위에서 구운 다음 섭씨 95도에서 5 분 동안 굽습니다.
웨이퍼가 냉각되면 웨이퍼를 직접 오른쪽 광학 리소그래피 기계의 인쇄 챔버에 장착하고 옥탄올 보조 리포솜 어셈블리 또는 OLA 디자인을 소프트웨어에 공급합니다. 디자인이 인쇄되면 웨이퍼를 섭씨 65도에서 1분 동안 구운 다음 섭씨 95도에서 3분 동안 굽습니다. 경화되지 않은 포토레지스트를 씻어내려면 경화되지 않은 포토레지스트가 완전히 제거될 때까지 현상액이 들어 있는 유리 비커에 웨이퍼를 담그십시오.
웨이퍼를 섭씨 150도에서 30분 동안 하드 베이크하여 인쇄된 디자인이 웨이퍼 표면에 단단히 부착되고 다운스트림 제조 공정에서 벗겨지지 않도록 합니다. 미세유체 소자를 준비하기 위해, 마스터 웨이퍼를 정사각형의 알루미늄 조각 위에 놓고, 웨이퍼 주위에 알루미늄 호일을 감싼다, 웰-유사 구조를 형성한다. PDMS 혼합물을 마스터 웨이퍼에 부드럽게 붓습니다.
어셈블리를 섭씨 70도의 오븐에서 최소 2시간 동안 배양합니다. 오븐에서 마스터 웨이퍼를 꺼내 식히십시오. 응고된 폴리디메틸실록산 또는 PDMS 블록을 제거하려면 알루미늄 호일을 제거한 다음 웨이퍼 가장자리에서 PDMS 블록을 조심스럽게 떼어냅니다.
투명 유리 커버 슬립을 가져다가 약 0.5밀리리터의 PDMS를 유리 슬라이드 중앙에 붓고 유리 슬라이드를 부드럽게 기울여 커버 슬립 전체에 펼치면 PDMS로 유리 슬라이드가 완전히 덮일 수 있습니다. 스핀 코터에 유리 슬라이드를 장착합니다. 슬라이드의 중앙이 압력축의 중심과 겹치도록 중앙에 배치되었는지 확인하십시오.
그런 다음 유리 슬라이드를 초당 100RPM 단위로 15초 동안 500RPM으로 회전시키고 초당 500RPM 단위로 30초 동안 1, 000RPM으로 회전시킵니다. 코팅된 면이 위를 향하도록 하여 PDM 코팅된 유리 슬라이드를 덮개가 있는 페트리 접시에 있는 PDMS 블록과 같은 돌출된 플랫폼에 놓습니다. 섭씨 70도에서 2 시간 동안 굽습니다.
새겨진 채널이 위쪽을 향하도록 PDMS 블록을 놓고 코팅면이 위를 향하도록 PDM 코팅된 유리 슬라이드를 플라즈마 청소기의 진공 챔버에 놓습니다. 진공을 켜고 내용물을 12 메가 헤르츠의 무선 주파수에서 15 초 동안 공기 플라즈마에 노출시켜 표면을 활성화하십시오. 산소 플라즈마는 분홍빛이 도는 색조의 형태로 볼 수 있습니다.
플라즈마 처리 직후 PDMS가 코팅된 유리 슬라이드를 PDMS 면이 위를 향하도록 하여 깨끗한 표면에 놓습니다. 미세유체 패턴이 이제 PDMS 코팅된 유리 슬라이드를 향하도록 PDMS 블록을 부드럽게 배치하여 접착되도록 합니다. 접합 된 장치를 섭씨 70도에서 2 시간 동안 굽습니다.
200마이크로리터의 5% 폴리비닐 알코올 또는 OVA 용액을 1.5밀리리터 튜브에 분배하고 미세유체 저장소 스탠드에 연결합니다. 한쪽 끝이 PVA 용액에 잠기고 다른 쪽 끝이 미세유체 장치의 외부 수성 채널의 입구에 연결되도록 튜브를 삽입합니다. 외부 수성상의 압력을 100 밀리바까지 증가시켜 PVA 용액을 외부 수성 채널에 흐르게 한다.
내부 수성 및 지질 운반 유기상의 압력을 120밀리바까지 높여 이러한 채널 내부의 PVA 용액의 역류를 방지합니다. 이러한 방식으로 PVA 용액을 약 5분 동안 흐르게 하여 출구 채널의 완전한 기능화를 보장합니다. 지질 운반 유기 및 내부 수성 채널의 압력을 두 개의 막대로 증가시켜 PVA 용액을 제거하고 즉시 외부 수성 주입구에서 튜브를 분리합니다.
동시에 음압 채널에 연결된 튜브를 사용하여 출구 채널에서 과도한 PVA를 제거합니다. 장치를 섭씨 120도에서 15분 동안 굽고 식힌 후 사용하십시오. 장치는 최소 한 달 동안 주변 조건에서 보관할 수 있습니다.
용액을 3개의 1.5밀리리터 튜브에 분배하고 조립합니다. PVA 처리 된 미세 유체 칩에 연결하고 내부 수성 및 지질 운반 유기 채널에서 약 100 밀리바, 외부 수성 채널에서 약 200 밀리바의 3 개 채널에 양압을 가합니다. 세 단계가 모두 접합부에서 함께 흐르기 시작하면 이중 에멀젼 생산이 시작되는지 확인하고 품질에 따라 압력을 조정합니다.
이중 에멀젼 방울이 흐르면서 옥탄올 모든 주머니가 점점 더 두드러지고 마침내 꼬집어 리포솜을 형성합니다. 이중 에멀젼 방울의 빠른 생성에 대한 명시야 이미지가 여기에 표시됩니다. 형광 지질 채널은 부분적인 탈습윤으로 인한 옥탄올 올 포켓의 형성을 보여준다.
내부 수성 채널은 황색 형광 단백질의 캡슐화를 나타낸다. 리포솜을 형성하는 출구 채널에서 옥탄올 포켓의 탈습이 이 그림에 나와 있습니다. 이 이미지는 리포솜 내에 캡슐화된 폴리라이신과 ATP의 균질 용액이 상분리된 폴리라이신 ATP 코아세르베이트로 pH 의존적으로 전이되는 개략도를 나타냅니다.
리포솜의 초기 산성 환경은 ATP의 분자 전하를 중성으로 만들어 코아세르베이션을 억제합니다. 리포솜 내부의 pH가 외부에서 적용된 pH 증가와 평형을 이루면 ATP는 음전하를 얻어 코아세르베이션을 유발합니다. 폴리리신과 멤브레인의 공간 분포와 리포솜 내에서 폴리라이신 ATP 코아세르베이트 형성의 시간 경과 이미지가 이 그림에 나와 있습니다.
염기성 완충액의 외부 판은 몇 분 동안 리포솜 내부의 pH 수준을 높이고 코아세르베이션을 시작합니다. 0분과 같은 T는 첫 번째 코아세르베이션 이벤트가 발생하기 직전의 시간을 의미한다. 절차를 시연하는 동안 안정적인 이중 에멀젼 생산을 생성하기 위해 채널 압력을 참을성 있게 조정하는 것이 중요합니다.
OLA와 그 변이는 생체 분자 응축물의 역학을 이해하는 리포솜의 성장 및 분열, 단백질의 무세포 발현, 박테리아 캡슐화와 같은 다양한 연구에 사용되었습니다. 따라서 타박상에서 우리는 OLA가 합성 생물학을 위한 다목적 플랫폼이라고 믿습니다.
