이 작품은 스콧 I. 사이먼과 앤서니 G. Passerini에 NIH / NHLBI 부여 R01 HL082689에 의해 지원되었다.

1. 세포 배양 및 기판 준비 <ol><li> 선반을 사용하여 100 X 20mm의 조직 배양 접시 (BD 팔콘)에서 3 인치 원형 기판을 자르고. 70 % 에탄올의 침수에 의해 기판을 소독. 상온에서 1 시간 4 ML 타입 - 나 콜라겐 (100 μg / ml) 쇼핑과 배양 접시와 코트의 장소는 다음 네 ML 1 X PBS와 린스. </li><li> 기판에 직접 한 ML을 적용하여 6.5x10 5 셀 / ML 및 종자에서 인간의 대동맥 내피 세포 (HAEC, 통로 4-6)을 일시 중지합니다. 37 ° C 5 % CO 2 배양기에서 장소와 세포가 1 시간의 기판에 충실하실 수 있습니다. </li><li> 셀 1X 항생제 - antimycotic 솔루션을 보완 내피 성장 중간 2 (EGM-2) 9 ML을 추가합니다. 세포가 90 % confluency 도달할 때까지 매 이일 미디어를 변경합니다. </li><li> 10% FBS와 항생제 1X-antimycotic 솔루션을 보완 RPMI 1640 배지에서 THP-1 세포를 유지합니다. 그들이 1 밀도에 도달 통과 세포0 6 셀 / ML. </li></ol> 2. 세포 전단 프로토콜 세포는 맞춤형 콘 및 플레이트 셀 전단 장치 (CSD)에서 조건됩니다. 장치 세부 사항 및 설계 사양은 표 1과 그림 4에 설명되어 있습니다. <ol><li> CSD를 준비합니다. 에탄올과 챔버 주택 소독과 멸균 PBS로 린스. ° C와 수준이 원추가 세포 단일층에 직각인지 확인하기 위해 37로 주택을 가열. 주택의 바닥에서 세포와 기판을 조립하고 원하는 높이로 원추형으로 설정합니다. </li><li> Leibovitz-15 (L-15) CO 2의 부재에 적절한 산도를 유지하기 위해 전단 매체로서 내피 BulletKit으로 보완 매체를 사용하십시오. , 염증을 자극 전단 매체에 종양 괴사 인자-α (TNF-α, 0.5 NG / ML)를 추가하고 입구 포트에 연결된 주사기를 통해 장치에서 6 ML 주사, 공기를 소개하지 돌보는하려면챔버에 거품. </li><li> 높은 진도 꾸준한 전단 응력에서 전단 세포 (HSS, 15 다인 / ㎝ 2) 4 시간 또는 oscillatory 전단 응력 (OSS, 0 ± 5 다인 / ㎝ 2, 1 Hz에서). 원하는 SS는 정확하게 이전에 설명한대로 마이크로 스테핑 모터로 제어되는 세포, 상기 원추형 회전에 의해 달성되는 6 표면의 벽, SS (τ W)에 의해 approximated있다. : <img src="/files/ftp_upload/4169/4169eq1.jpg" alt="등식 1" /> μ는 매체의 점도이고, ω는 원추의 각속도이며, α는 원추 각도 (0.5 °)입니다. 기판과 원뿔 정렬은 0.05 정밀 측량을 통한 °와 20에서 설정한 간격의 높이 ± 10 μm의 τ w에서 원주와 레이디얼 편차를 최소화하기 위해 깊이 게이지를 사용하여 이내로 조정됩니다. 장치는 층류 특성을 보장하기 위해 검증되었습니다. 광고 제거장치에서 ells 및 단핵구 유착의 분석을 위해 준비합니다. </li></ol> 3. PDMS Microfluidic 상공 회의소의 제작 <ol><li> 응용 프로그램에 따라 원하는 microfluidic 채널 번호와 채널 높이 마스터 몰드를 구합니다. 이 프로토콜에서 사용되는 구체적인 설계의 특성은 5000 DPI에서 1 간단히는 채널 네트워크 (오토 데스크 발명가) CAD 소프트웨어를 사용하여 설계되었습니다. 이들을 만들기위한 방법은 이미 잘 문학에 설명되어 있습니다. 표 1에서 상세하고 인쇄됩니다 투명성에. 부정적인 포토 레지스트 (SU8은) 100 μm의의 두께로 실리콘 웨이퍼에 소용된다. 투명성은 중첩 및 자외선에 노출됩니다. 비 polymerized 포토 레지스트는 긍정적인 복제 마스터를 생성하기 위해 제거됩니다. </li><li> 실리콘은 무게는 보트 무게로 에이전트 10시 1분 치료와 PDMS 솔루션 믹스 실리콘 기반을 만들고 5 ML serological pipet으로 저어합니다. 벽면을 다쳤어요하​​지 않도록주의이 솔루션에 플라스틱 부스러기를 추가하지 않도록 배 무게 때문에. </li><li> 100x15mm 배양 접시에있는 마스터 웨이퍼를 넣은 그릇에 PDMS 용액을 붓는다. </li><li> 접시를 커버하고 거품을 제거하는 15 분 동안 진공 용기에 넣습니다. 15 분 배양 접시를 꺼내 부드럽게 표면을 통해 공기를 불어하여 ​​여분의 거품을 제거한 후. </li><li> 70에서 1 시간 동안 오븐에서 페트리 접시를 놓습니다 ° C. 접시를 제거하고 날카로운 칼날을 사용하여 microfluidic 챔버를 했네요. </li></ol> 4. 현미경에 대한 장치의 조립 <ol><li> 거꾸로 현미경으로 광원의 전원을 켜고 37로 히터를 설정할 ° C를 10 ML의 주사기에 튜브를 부착하고 아무런 거품이 없다는 등의 증류수로 채운다. 한 다인 / ㎝ 2의 벽에 SS를 유도하기 위해 주사기 펌프 및 설정 유량에 주사기를 놓습니다. 채널의 중심선을 따라 생성된 벽면 전단 응력은 (τ W) 표준을 사용하여 approximated있다병렬 플레이트 흐름 챔버를위한 방정식 : <img src="/files/ftp_upload/4169/4169eq2.jpg" alt="등식이" /> μ는 체적 유량은 Q 매체의 점도이고, H는 채널의 높이이며, w는 채널 폭입니다. 참고 : 채널 유한 너비 때문에 실제 τ w는 w는 채널에 따라 같이 달라집니다 화면 비율 및 성능은 측면 벽에 가까운 25 %로 피해야합니다. 1,7 </li><li> 물에 PDMS 챔버를 삽입하고 각 채널에서 공기를 제거하는 100μl micropipette을 사용합니다. 챔버는 밸브가 해제로 설정되어 있는지 확인 만들기 위해 진공 어댑터를 연결합니다. </li><li> 목표 이상의 HAEC의 단일층과 배양 접시를 놓습니다. 페트리 접시 위에 PDMS 챔버를 삽입하고 기포가 장치와 단일층 사이에 형성 없다는 것을 확보하면서 조심스럽게 HAEC 단일층에 설정합니다. 진공이 켜져 있고 챔버에 단단히 부착되도록 밸브를 켭니다. </리&gt; <li> 19 게이지 바늘은 금속의 왼쪽에만 5mm가있다는 것을 같은 무딘 잘라. 버퍼와 플라스틱 저수지를 입력하고 PDMS 챔버 입구에 넣어. 사용되는 채널의 적절한 번호를 반복합니다. 주사기 펌프에서 PDMS 채널 출구로 튜브를 연결합니다. </li></ol> 5. 전단 응력 이하 단핵구 접착 분석 <ol><li> 2x10 6 셀 / HBSS + 칼슘 2 + / MG 2 + + 0.1 %의 HSA에 ML에서 THP-1 세포를 일시 중지합니다. 상온에서 15 분 동안 stromal 파생된 요소-1 (SDF-1, 50 μg / ml) 쇼핑과 잠복기에 의해 활성화 THP-1 세포. </li><li> 흐름을 확립하기 위해 주사기 펌프를 켜고 다음 기포를 도입하지 않고 저수지에 세포 현탁액의 50 μl를 추가합니다. 일단 흐름이 완전히 개발, 데이터 수집을 시작합니다. </li><li> 솔루션은 낮게 잡으면 저수지에 버퍼를 추가, 적절한 유속에서 5 분 동안 실행합니다. 흐름 스트림에 어떤 언바운드 세포를 씻어하기 채널로 버퍼를 흐르는 계속합니다. </li></ol> 6. 데이터 수집 및 분석 <ol><li> 사이드 가까운 즉시 입학 후 또는 출구 포트를 이전하거나 25 % 기록하지 않도록 돌보는 채널에 3 개소에서 채널의 세로 축을 따라 완전히 발달 흐름을 따라 2 분에 대해 3 프레임 / 초에서 디지털 이미지 시퀀스를 취득 벽. </li><li> 단일층 같은 초점 평면에서 자신의 위상 밝은 모습을 파악하여 현장 체포 당 세포의 수를 세어보세요. </li><li> 기업 셀 체포 움직임에 의해 정의되고 &lt;10 s에 ½ 세포 직경. 3 랜덤 필드 / 채널 이상 평균 데이터 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 계량. </li></ol> 7. 대표 결과 혈관 내피가 균일하게 전신 염증에 기여 agonists에 노출되고 있지만, 죽상 경화증은 내피 기능의 공간적 이질 고발, 동맥의 흐름 변동의 사이트에서 우선적으로 개발 초점 질병 8. </suP와 같은 TNF-α 등&gt; 순환 염증 중재자는 신진 대사 스트레스가 인간의 혈청에서 상승하고 장애 내피 기능과 상관 관계. 9, 10 TNF-α는 세포 유착 분자의 상향 조절 (달았을 포함 EC에 잘 특성화 응답을 유도하고 ; 예 VCAM-1, ICAM-1, E-selectin)과 순환, 초기 atherosclerotic 병변의 특징에서 모집 monocytes 11 혈류 역학은 내피 염증성 표현형의 중요한 조절기는 것을 12 하이 크기의 전단 응력이 chemokines (HSS..; 예를 들어 15 dynes / ㎝ 2) 또는 타악기 전단 응력 (PSS, 예 : 15 ± 5 dynes / ㎝ 2) 동맥에서 TNF-α 유발 반응을 다운 규제 죽상 경화증에 대한 저항의 사이트와 연관된. 반대로, 낮은 크기의 전단 응력 (LSS; 예 2 dynes / ㎝ 2) 또는 oscillatory 전단, 생체내에 감염될 사이트의 특성 ​​(OSS 예 : 0 ± 5 dynes / cm 2), cytoki 증명했다NE-유도 염증. 13, 14 우리 microfluidic PDMS 장치는 내피 기능과 병리의 규정에 유체 요소로 대사 스트레스가 중첩 관련된 가설을 테스트하는 기계론의 연구 수행을위한 플랫폼을 제공합니다. 접근 방식의 유틸리티와 다기능는 크게 다음과 같은 대표적인 결과를 통해 보여주고있다. <img src="/files/ftp_upload/4169/4169fig1.jpg" alt="그림 1" /> 1 그림. 전단 응력은 differentially TNF-α 염증 내피 monolayers에 THP-1 세포 접착력을 modulates.이 데이터는 위의 동영상에서 설명 설명한 세부적인 프로토콜을 사용하여 획득했다. HAEC의 monolayers 동시에 염증성 시토킨 TNF-α (0.5 NG / ML, VCAM-1까지 규제를위한 ~ EC 50)과 HSS (15 dynes / ㎝ 2) 또는 OSS (0 ± 5 dynes 중의 낮은 복용량에 노출되었다 descri 등 4 시간에 대한 사용자 지정 CSD의 / ㎝ 2, 1 Hz에서)자세한 프로토콜의 침대. THP-1 세포 체포 PDMS 흐름 챔버의 전단 유동 하에서 계량되었다. 인간 monocytes의 표현형을 모방한 것이었 이러한 세포 라인의 재현성 및 사용의 용이성을 위해 선정되었습니다. HSS 감쇠 염증 반응은 감소 THP-1 세포 체포 결과, OSS에 비해. 데이터는 학생의 T-테스트에 의해 분석되었으며 말은 ± 3 독립적인 실험 SEM을로 표현됩니다. DeVerse 외로부터 허가를 적응 5. 다음 데이터가 출판 작업에서 예제를 사용하여 우리의 접근 방법의 다양성을 보여줍니다. 해당되는 위의 프로토콜의 출발이 표시됩니다. <img src="/files/ftp_upload/4169/4169fig2.jpg" alt="그림 2" /> 그림 2. 시토킨 유도된 VCAM-1 표현과 전단 응력 구배에 단핵구 모집의 변조. ) HAEC의 monolayers는 플로 아래에 4 시간을 위해 TNF-α (0.3 NG / ML)로 자극했다Hele-쏘 플로우 이론을 바탕으로 설계된 VMMC의 w 15 채널의 중심선을 따라 SS 친위대 크기의 선형 감소는 2 차원 침체 흐름의 합리화에 맞춰 챔버 측벽을 설계하고 끝을 형성함으로써 달성되었다 채널의 ISO-잠재적인 라인과 일치합니다. 입구 (X)에서 축 거리에서이 채널의 중심선을 따라 생성된 벽면 전단 응력은 (τ W)에 의해 주어진다 : <img src="/files/ftp_upload/4169/4169eq3.jpg" alt="등식 3" /> μ는 체적 유량은 Q 매체의 점도이고, H는 채널 높이, W 1 채널 입구 폭이며, L은 전체 채널의 길이입니다. Q가 16 일부터 SS 친위대 진도에서 그라디언트를 생성하는 선정되었습니다 outle에 dynes / 정체 지점에서 0으로 입구에서 cm 2 &quot;&quot;단지 근위티. B)-C) VCAM-1 표현은 양자 도트에 복합 및 unstimulated 정적 제어의 비율이 평균 형광 강도 (MFI)로 제시 항체를 사용하여 immunofluorescence 현미경에 의해 원위치로 측정되었다. SS는 unstimulated HAEC (회색 삼각형)에서 낮은 VCAM-1의 기저 레벨을 조절하지 않았다. 그러나, VCAM-1 표현)은 ~ 2 dynes / ㎝ 2 시에 피킹 및 전단 크기는&gt; 5 dynes / ㎝ 2 (검은색 사각형). D에서 TNF-α의 기준으로 반환하거나 아래, LSS의 크기는에서 TNF-α에 상대적으로 증가 Monocytes (10 6 / ML)가)에서와 같이 preconditioned monolayers 이상의 병렬 플로우 채널에서 5 분 동안 두 dynes / ㎝ 2 시에 perfused되었다. 내피에 단핵구 모집은 양적 주어진 전단 응력 크기에서 VCAM-1 표현과 상호. 특히, monolaye에서 훌륭한 공간 해상도로 VCAM-1 표현과 단핵구 모집을 알아내기 수있는 능력R은 별도의 실험에서 전단 중 몇 이산 값을 적용하여 평가되지 않을 SS 친위대 크기의 좁은 범위에서 상당한 변화를 발표했다. 데이터는 TNF-α의 * P &lt;0.05 정적인 조건 하에서 반복 측정 ANOVA와 뉴만 - Keuls posttest에 의해 평가의 차이에 의해 분석되었다. 데이터는 의미있다 ± SEM을 3-6 독립적인 실험에서. Tsou 외 2.의 허가와 적응 <img src="/files/ftp_upload/4169/4169fig3.jpg" alt="그림 3" /> 그림 3. 트리 글리세 라이드 풍부한 lipoproteins (TGRL)는 기증자 혈청 트리 글리세 라이드 수준과 VCAM-1 표현에 비례 시토킨 유도된 염증을 조절. HAEC의 monolayers는 TGRL (10 MG / DL과 동시에 4 시간 동안 TNF-α (0.3 NG / ML)로 자극했다 ApoB)는 정적 문화에 고지방 음식을 먹은 후엔 인간 주제에 격리.) VCAM-1 표현은 유동세포계측법에 의해 정지 EC에서 별도로 측정되었다그리고 단핵구 유착은 세부적인 프로토콜에 설명된대로 VMMC을 사용하여 계량. 데이터는 TNF-α의 % 변화로 제공됩니다. 단핵구 체포는 기증자 혈청 트리 글리세 라이드의 수준과 직접적으로 증가했다. B) 프로 염증성 기증자의 하위 집합에 대한 단핵구 체포가 VCAM-1 차단 항체의 면전에서 abrogated되었다 내피 VCAM-1 표현에 정비례에서 변경될. 의의가 결합하여 학생의 T-테스트에 의해 결정되었다 3-5 독립적인 실험에서 ± SEM을 의미합니다. 왕 외로부터 허가를 적응 4.

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관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.

우리는 캠 표현과 단핵구 유착의 실시간 영상을 통해 내피 염증성 표현형의 온 칩 평가를위한 microfluidic PDMS 장치의 사용을 설명합니다. 우리의 접근 방식의 가장 큰 장점은 atherogenic 혈관에 전단 응력을 미러링 정의된 유체 조건에서식이 lipids 및 크린 시토킨 등의 염증 중재자에 노출된 세포에서 내피 기능 장애와 관련된 결과를 계량하는 능력에있다. VMMC는 시약 또는 제한된 공급이있을 수 있습?...

<table border="1"><tbody><tr><td> 아이템 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td></tr><tr><td> 100 X 20mm 배양 접시 </td><td> BD 팔콘 </td><td> 353,003 </td></tr><tr><td> 에탄올 95% </td><td> EMD 화학 </td><td> EX0290-1 </td></tr><tr><td> DPBS </td><td> Cellgro </td><td> 21-031 - 이력서 </td></tr><tr><td> 나는 쥐 꼬리 파생 콜라겐을 입력합니다 </td><td> Gibco </td><td> A10483-01 </td></tr><tr><td> 인간의 대동맥 내피 세포 </td><td> Genlantis </td><td> PH30405A </td></tr><tr><td> 항생제 - Antimycotic 솔루션 </td><td> Invitrogen </td><td> 15240-062 </td></tr><tr><td> 내피 BulletKit </td><td> Lonza </td><td> CC-4176 </td></tr><tr><td> 내피 자연적으로 흐르는 것과, 반사적으로 흐르는 미디어-2 </td><td> Lonza </td><td> CC-3156 </td></tr><tr><td> 10 ML의 주사기 </td><td> BD 팔콘 </td><td> 309,604 </td></tr><tr><td> 폴리 우레탄 튜브 </td><td> Tygon </td><td> ABW0001 </td></tr><tr><td> Leibovitz-15 미디어 </td><td> Gibco </td><td> 11415-069 </td></tr><tr><td> Sylgard 184 실리콘 엘라스토머베이스 </td><td> 다우 코닝 </td><td> 184 </td></tr><tr><td> Sylgard 184 실리콘 엘라스토머 경화 에이전트 </td><td> 다우 코닝 </td><td> 184 </td></tr><tr><td> SU8 포토 레지스트 마스터 웨이퍼 </td><td> UC 데이비스 팬 연구실 </td><td> N / A </td></tr><tr><td> 이클립스 TE200 거꾸로 현미경 </td><td> 니콘 </td><td> 이클립스 TE200 </td></tr><tr><td> 주사기 펌프 </td><td> 하버드 장치 </td><td> PHD2000 </td></tr><tr><td> 19 게이지 피하 바늘 </td><td> 켄달 </td><td> 8881 </td></tr><tr><td> THP-1 Monocytic 세포주 </td><td> ATCC </td><td> 티비-202 </td></tr><tr><td> HBSS 칼슘 2 + / MG 2 (행크스는 생리 식염수를 버퍼) + </td><td&gt; Gibco </td><td> 14025-092 </td></tr><tr><td> 종양 괴사 요인 알파 (TNF-α) </td><td> R &amp; D 시스템 </td><td> 210-TA-010 </td></tr><tr><td> Stromal 유래 팩터 - 1 (SDF-1) </td><td> R &amp; D 시스템 </td><td> 350 NS-010 </td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Cellgro </td><td> 10-040 - 이력서 </td></tr><tr><td> 알부민 혈청 인간 (HSA) </td><td> ZLB Behring </td><td> NDC 0053-7680-32 </td></tr></tbody></table> 표 2. 특정 시약 및 장비.

on-chip endothelial inflammatory phenotyping

Atherogenesis은 내피 기능 장애의 결과로 조직의 염증의 상승된 상태에 기여하는 대사 이상에 의해 potentiated됩니다. 그러나 위험 개인의 수준을 의미하는 내피의 초기 기능 변경은 직접 가이드 치료 전략을 돕기 위해 임상적으로 평가되지 않습니다. 또한, 지역 혈류 역학에 의한 염증의 규정은 죽상 경화증의 비 임의의 공간적 분포에 기여하고 있지만 메커니즘은 생체내에 윤곽을 그리다하기가 어렵습니다. 우리는 정확한 유량 조건 하에서 인간 내피 세포 (EC)와 monocytes의 염증성 이벤트의 정량적 분석 신진 대사 섭동에 실험실 - 온 - 칩 기반의 접근 방식을 설명합니다. 소프트 리소그래피의 표준 방식은 교양 EC의 monolayers에 직접 바인딩되는 혈관 모방 microfluidic 챔버 (VMMC)를 microfabricate하는 데 사용됩니다. 1이 디바이스 시약 작은 볼륨 동안 사용의 이점을 가지고잘 정의된 전단 필드에 노출 EC의 세포막에서 염증 이벤트에 직접 이미징을위한 플랫폼을 제공합니다. 우리는 성공적으로 인간의 대동맥 EC (HAEC)에서 시토킨-2 지질-3, 4, 분노 유발 5 염증을 조사하기 위해 이러한 장치를 적용했습니다. 여기 분석 monocytic 셀 (THP-1) 압연 및 차동 전단 특성 아래 조건과 염증성 시토킨 TNF-α에 의해 활성화됩니다 HAEC monolayers의 체포에 VMMC의 사용을 문서화. 이러한 연구는 신진 대사 위험 요인 아래 atherosusceptibility으로 기계론의 통찰력을 제공하고 있습니다.

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On-Chip Endothelial Inflammatory Phenotyping

석판술으로 새겨져와 PDMS에서 가공 Microfluidic 흐름 여왕님 EC 장애와 염증과 관련된 기능적 결과를 알아내기 위해 적용됩니다. 대표 실험에서는 차등 전단 응력의 능력 시토킨 활성화 EC monolayers에 monocytic 세포 접착을 조절하기 위해이 입증되었습니다.

온칩 내피 염증성 Phenotyping

Atherogenesis is potentiated by metabolic abnormalities that contribute to a heightened state of systemic inflammation resulting in endothelial ...

on-chip-endothelial-inflammatory-phenotyping

Research

JoVE Journal

Bioengineering

10.8K 조회수.  University of California, Davis. 석판술으로 새겨져와 PDMS에서 가공 Microfluidic 흐름 여왕님 EC 장애와 염증과 관련된 기능적 결과를 알아내기 위해 적용됩니다. 대표 실험에서는 차등 전단 응력의 능력 시토킨 활성화 EC monolayers에 monocytic 세포 접착을 조절하기 위해이 입증되었습니다.

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On-chip Isotachophoresis for Separation of Ions and Purification of Nucleic Acids

Electrokinetic techniques are a staple of microscale applications because of their unique ability to perform a variety of fluidic and electrophoretic processes in simple, compact systems with no moving parts. Isotachophoresis (ITP) is a simple and very robust electrokinetic technique that can achieve million-fold preconcentration1,2 and efficient separation and extraction based on ionic mobility.3 For example, we have demonstrated the application of ITP to separation and sensitive detection of unlabeled ionic molecules (e.g. toxins, DNA, rRNA, miRNA) with little or no sample preparation4-8 and to extraction and purification of nucleic acids from complex matrices including cell culture, urine, and blood.9-12
ITP achieves focusing and separation using an applied electric field and two buffers within a fluidic channel system. For anionic analytes, the leading electrolyte (LE) buffer is chosen such that its anions have higher effective electrophoretic mobility than the anions of the trailing electrolyte (TE) buffer (Effective mobility describes the observable drift velocity of an ion and takes into account the ionization state of the ion, as described in detail by Persat et al.13). After establishing an interface between the TE and LE, an electric field is applied such that LE ions move away from the region occupied by TE ions. Sample ions of intermediate effective mobility race ahead of TE ions but cannot overtake LE ions, and so they focus at the LE-TE interface (hereafter called the "ITP interface"). Further, the TE and LE form regions of respectively low and high conductivity, which establish a steep electric field gradient at the ITP interface. This field gradient preconcentrates sample species as they focus. Proper choice of TE and LE results in focusing and purification of target species from other non-focused species and, eventually, separation and segregation of sample species.
We here review the physical principles underlying ITP and discuss two standard modes of operation: "peak" and "plateau" modes. In peak mode, relatively dilute sample ions focus together within overlapping narrow peaks at the ITP interface. In plateau mode, more abundant sample ions reach a steady-state concentration and segregate into adjoining plateau-like zones ordered by their effective mobility. Peak and plateau modes arise out of the same underlying physics, but represent distinct regimes differentiated by the initial analyte concentration and/or the amount of time allotted for sample accumulation.
We first describe in detail a model peak mode experiment and then demonstrate a peak mode assay for the extraction of nucleic acids from E. coli cell culture. We conclude by presenting a plateau mode assay, where we use a non-focusing tracer (NFT) species to visualize the separation and perform quantitation of amino acids.

Isotachophoresis (ITP) is a robust electrokinetic separation and preconcentration technique with applications ranging from toxin detection to sample preparation. We review the physical principles of ITP and the methodology of applying this technique to two specific example applications: separation and detection of small molecules and purification of nucleic acids from cell culture lysate.

이온의 분리 및 핵산의 정화를위한 온칩 Isotachophoresis

Electrokinetic techniques are a staple of microscale applications because of their unique ability to perform a variety of fluidic and electrophoretic ...

연구

생체공학

Lensfree On-chip Tomographic Microscopy Employing Multi-angle Illumination and Pixel Super-resolution

Tomographic imaging has been a widely used tool in medicine as it can provide three-dimensional (3D) structural information regarding objects of different size scales. In micrometer and millimeter scales, optical microscopy modalities find increasing use owing to the non-ionizing nature of visible light, and the availability of a rich set of illumination sources (such as lasers and light-emitting-diodes) and detection elements (such as large format CCD and CMOS detector-arrays). Among the recently developed optical tomographic microscopy modalities, one can include optical coherence tomography, optical diffraction tomography, optical projection tomography and light-sheet microscopy. 1-6 These platforms provide sectional imaging of cells, microorganisms and model animals such as C. elegans, zebrafish and mouse embryos.
Existing 3D optical imagers generally have relatively bulky and complex architectures, limiting the availability of these equipments to advanced laboratories, and impeding their integration with lab-on-a-chip platforms and microfluidic chips. To provide an alternative tomographic microscope, we recently developed lensfree optical tomography (LOT) as a high-throughput, compact and cost-effective optical tomography modality. 7 LOT discards the use of lenses and bulky optical components, and instead relies on multi-angle illumination and digital computation to achieve depth-resolved imaging of micro-objects over a large imaging volume. LOT can image biological specimen at a spatial resolution of &lt;1 &mu;m x &lt;1 &mu;m x &lt;3 &mu;m in the x, y and z dimensions, respectively, over a large imaging volume of 15-100 mm3, and can be particularly useful for lab-on-a-chip platforms.

Lensfree optical tomography is a three-dimensional microscopy technique that offers a spatial resolution of &lt;1 &mu;m &times; &lt;1 &mu;m &times; &lt;3 &mu;m in x, y and z dimensions, respectively, over a large imaging-volume of 15-100 mm3, which can be particularly useful for integration with lab-on-a-chip platforms.

멀티 앵글 조명 및 픽셀 슈퍼 해상도를 채용 Lensfree 온칩 단층 현미경

Tomographic imaging has been a widely used tool in medicine as it can provide three-dimensional (3D) structural information regarding objects of different ...

Quantifying the Mechanical Properties of the Endothelial Glycocalyx with Atomic Force Microscopy

Our understanding of the interaction of leukocytes and the vessel wall during leukocyte capture is limited by an incomplete understanding of the mechanical properties of the endothelial surface layer. It is known that adhesion molecules on leukocytes are distributed non-uniformly relative to surface topography 3, that topography limits adhesive bond formation with other surfaces 9, and that physiological contact forces (&asymp; 5.0 &minus; 10.0 pN per microvillus) can compress the microvilli to as little as a third of their resting length, increasing the accessibility of molecules to the opposing surface 3, 7. We consider the endothelium as a two-layered structure, the relatively rigid cell body, plus the glycocalyx, a soft protective sugar coating on the luminal surface 6. It has been shown that the glycocalyx can act as a barrier to reduce adhesion of leukocytes to the endothelial surface 4. In this report we begin to address the deformability of endothelial surfaces to understand how the endothelial mechanical stiffness might affect bond formation. Endothelial cells grown in static culture do not express a robust glycocalyx, but cells grown under physiological flow conditions begin to approximate the glycocalyx observed in vivo 2. The modulus of the endothelial cell body has been measured using atomic force microscopy (AFM) to be approximately 5 to 20 kPa 5. The thickness and structure of the glycocalyx have been studied using electron microscopy 8, and the modulus of the glycocalyx has been approximated using indirect methods, but to our knowledge, there have been no published reports of a direct measurement of the glycocalyx modulus in living cells. In this study, we present indentation experiments made with a novel AFM probe on cells that have been cultured in conditions to maximize their glycocalyx expression to make direct measurements of the modulus and thickness of the endothelial glycocalyx.

The mechanical characteristics of endothelial glycocalyx were measured by indentation using micron sized spheres on AFM cantilevers. Endothelial cells were cultured in a custom chamber under physiological flow conditions to induce glycocalyx expression. Data were analyzed using a thin film model to determine the glycocalyx thickness and modulus.

원자 힘 현미경과 내피 Glycocalyx의 기계적 성질을 정량화

Our  understanding of the interaction of leukocytes and the vessel wall during  leukocyte capture is limited by an incomplete understanding of the ...

Ferromagnetic Bare Metal Stent for Endothelial Cell Capture and Retention

Rapid endothelialization of cardiovascular stents is needed to reduce stent thrombosis and to avoid anti-platelet therapy which can reduce bleeding risk. The feasibility of using magnetic forces to capture and retain endothelial outgrowth cells (EOC) labeled with super paramagnetic iron oxide nanoparticles (SPION) has been shown previously. But this technique requires the development of a mechanically functional stent from a magnetic and biocompatible material followed by in-vitro and in-vivo testing to prove rapid endothelialization. We developed a weakly ferromagnetic stent from 2205 duplex stainless steel using computer aided design (CAD) and its design was further refined using finite element analysis (FEA). The final design of the stent exhibited a principal strain below the fracture limit of the material during mechanical crimping and expansion. One hundred stents were manufactured and a subset of them was used for mechanical testing, retained magnetic field measurements, in-vitro cell capture studies, and in-vivo implantation studies. Ten stents were tested for deployment to verify if they sustained crimping and expansion cycle without failure. Another 10 stents were magnetized using a strong neodymium magnet and their retained magnetic field was measured. The stents showed that the retained magnetism was sufficient to capture SPION-labeled EOC in our in-vitro studies. SPION-labeled EOC capture and retention was verified in large animal models by implanting 1 magnetized stent and 1 non-magnetized control stent in each of 4 pigs. The stented arteries were explanted after 7 days and analyzed histologically. The weakly magnetic stents developed in this study were capable of attracting and retaining SPION-labeled endothelial cells which can promote rapid healing.

Our goals were to design, manufacture and test ferromagnetic stents for endothelial cell capture. Ten stents were tested for fracture and 10 more stents were tested for retained magnetism. Finally, 10 stents were tested in-vitro and 8 more stents were implanted in 4 pigs to show cell capture and retention.

내피 세포 캡처 및 유지에 대한 강자성 베어 메탈 스텐트

Rapid endothelialization of cardiovascular stents is needed to reduce stent thrombosis and to avoid anti-platelet therapy which can reduce bleeding risk. ...

Dry Film Photoresist-based Electrochemical Microfluidic Biosensor Platform: Device Fabrication, On-chip Assay Preparation, and System Operation

In recent years, biomarker diagnostics became an indispensable tool for the diagnosis of human disease, especially for the point-of-care diagnostics. An easy-to-use and low-cost sensor platform is highly desired to measure various types of analytes (e.g., biomarkers, hormones, and drugs) quantitatively and specifically. For this reason, dry film photoresist technology - enabling cheap, facile, and high-throughput fabrication - was used to manufacture the microfluidic biosensor presented here. Depending on the bioassay used afterwards, the versatile platform is capable of detecting various types of biomolecules. For the fabrication of the device, platinum electrodes are structured on a flexible polyimide (PI) foil in the only clean-room process step. The PI foil serves as a substrate for the electrodes, which are insulated with an epoxy-based photoresist. The microfluidic channel is subsequently generated by the development and lamination of dry film photoresist (DFR) foils onto the PI wafer. By using a hydrophobic stopping barrier in the channel, the channel is separated into two specific areas: an immobilization section for the enzyme-linked assay and an electrochemical measurement cell for the amperometric signal readout.
The on-chip bioassay immobilization is performed by the adsorption of the biomolecules to the channel surface. The glucose oxidase enzyme is used as a transducer for electrochemical signal generation. In the presence of the substrate, glucose, hydrogen peroxide is produced, which is detected at the platinum working electrode. The stop-flow technique is applied to obtain signal amplification along with rapid detection. Different biomolecules can quantitatively be measured by means of the introduced microfluidic system, giving an indication of different types of diseases, or, in regard to therapeutic drug monitoring, facilitating a personalized therapy.

A microfluidic biosensor platform was designed and fabricated using low-cost dry film photoresist technology for the rapid and sensitive quantification of various analytes. This single-use system allows for the electrochemical readout of on-chip-immobilized enzyme-linked assays by means of the stop-flow technique.

드라이 필름 포토 레지스트 기반 전기 화학 미세 바이오 센서 플랫폼: 장치 제작, 온 칩 시험 준비 및 시스템 운영

In recent years, biomarker diagnostics became an indispensable tool for the diagnosis of human disease, especially for the point-of-care diagnostics. An ...

Fabrication and Validation of an Organ-on-chip System with Integrated Electrodes to Directly Quantify Transendothelial Electrical Resistance

Organs-on-chips, in vitro models involving the culture of (human) tissues inside microfluidic devices, are rapidly emerging and promise to provide useful research tools for studying human health and disease. To characterize the barrier function of cell layers cultured inside organ-on-chip devices, often transendothelial or transepithelial electrical resistance (TEER) is measured. To this end, electrodes are usually integrated into the chip by micromachining methods to provide more stable measurements than is achieved with manual insertion of electrodes into the inlets of the chip. However, these electrodes frequently hamper visual inspection of the studied cell layer or require expensive cleanroom processes for fabrication. To overcome these limitations, the device described here contains four easily integrated electrodes that are placed and fixed outside of the culture area, making visual inspection possible. Using these four electrodes the resistance of six measurement paths can be quantified, from which the TEER can be directly isolated, independent of the resistance of culture medium-filled microchannels. The blood-brain barrier was replicated in this device and its TEER was monitored to show the device applicability. This chip, the integrated electrodes and the TEER determination method are generally applicable in organs-on-chips, both to mimic other organs or to be incorporated into existing organ-on-chip systems.

This publication describes the fabrication of an organ-on-chip device with integrated electrodes for direct quantification of transendothelial electrical resistance (TEER). For validation, the blood-brain barrier was mimicked inside this microfluidic device and its barrier function was monitored. The presented methods for electrode integration and direct TEER quantification are generally applicable.

제조 및 통합된 전극 Transendothelial 전기 저항을 직접 측정 하는 기관-온-칩 시스템의 유효성 검사

Organs-on-chips, in vitro models involving the culture of (human) tissues inside microfluidic devices, are rapidly emerging and promise to provide useful ...

High Throughput Yeast Strain Phenotyping with Droplet-Based RNA Sequencing

The powerful tools available to edit yeast genomes have made this microbe a valuable platform for engineering. While it is now possible to construct libraries of millions of genetically distinct strains, screening for a desired phenotype remains a significant obstacle. With existing screening techniques, there is a tradeoff between information output and throughput, with high-throughput screening typically being performed on one product of interest. Therefore, we present an approach to accelerate strain screening by adapting single cell RNA sequencing to isogenic picoliter colonies of genetically engineered yeast strains. To address the unique challenges of performing RNA sequencing on yeast cells, we culture isogenic yeast colonies within hydrogels and spheroplast prior to performing RNA sequencing. The RNA sequencing data can be used to infer yeast phenotypes and sort out engineered pathways. The scalability of our method addresses a critical obstruction in microbial engineering.

A bottleneck in the &#8216;design-build-test&#8217; cycle of microbial engineering is the speed at which we can perform functional screens of strains. We describe a high-throughput method for strain screening applied to hundreds to thousands of yeast cells per experiment that utilizes droplet-based RNA sequencing.

액적 기반 RNA 시퀀싱을 통한 높은 처리량 효모 균주 현상태핑

The powerful tools available to edit yeast genomes have made this microbe a valuable platform for engineering. While it is now possible to construct ...

Direct Bioprinting of 3D Multicellular Breast Spheroids onto Endothelial Networks

Bioprinting is emerging as a promising tool to fabricate 3D human cancer models that better recapitulate critical hallmarks of in vivo tissue architecture. In current layer-by-layer extrusion bioprinting, individual cells are extruded in a bioink together with complex spatial and temporal cues to promote hierarchical tissue self-assembly. However, this biofabrication technique relies on complex interactions among cells, bioinks and biochemical and biophysical cues. Thus, self-assembly may take days or even weeks, may require specific bioinks, and may not always occur when there is more than one cell type involved. We therefore developed a technique to directly bioprint pre-formed 3D breast epithelial spheroids in a variety of bioinks. Bioprinted pre-formed 3D breast epithelial spheroids sustained their viability and polarized architecture after printing. We additionally printed the 3D spheroids onto vascular endothelial cell networks to create a co-culture model. Thus, the novel bioprinting technique rapidly creates a more physiologically relevant 3D human breast model at lower cost and with higher flexibility than traditional bioprinting techniques. This versatile bioprinting technique can be extrapolated to create 3D models of other tissues in additional bioinks.

The goal of this protocol is to directly bioprint breast epithelial cells as multicellular spheroids onto pre-formed endothelial networks to rapidly create 3D breast-endothelial co-culture models which can be used for drug screening studies.

내피 네트워크에 3D 다세포 유방 스페로이드의 직접 생체 인쇄

Bioprinting is emerging as a promising tool to fabricate 3D human cancer models that better recapitulate critical hallmarks of in vivo tissue ...

Characterization of Blood Outgrowth Endothelial Cells (BOEC) from Porcine Peripheral Blood

The endothelium is a dynamic integrated structure that plays an important role in many physiological functions such as angiogenesis, hemostasis, inflammation, and homeostasis. The endothelium also plays an important role in pathophysiologies such as atherosclerosis, hypertension, and diabetes. Endothelial cells form the inner lining of blood and lymphatic vessels and display heterogeneity in structure and function. Various groups have evaluated the functionality of endothelial cells derived from human peripheral blood with a focus on endothelial progenitor cells derived from hematopoietic stem cells or mature blood outgrowth endothelial cells (or endothelial colony-forming cells). These cells provide an autologous resource for therapeutics and disease modeling. Xenogeneic cells may provide an alternative source of therapeutics due to their availability and homogeneity achieved by using genetically similar animals raised in similar conditions. Hence, a robust protocol for the isolation and expansion of highly proliferative blood outgrowth endothelial cells from porcine peripheral blood has been presented. These cells can be used for numerous applications such as cardiovascular tissue engineering, cell therapy, disease modeling, drug screening, studying endothelial cell biology, and in vitro co-cultures to investigate inflammatory and coagulation responses in xenotransplantation.

Characterization of Blood Outgrowth Endothelial Cells BOEC from Porcine Peripheral Blood

돼지 말초 혈액에서 혈액 성장 내피 세포(BOEC)의 특성화

The endothelium is a dynamic integrated structure that plays an important role in many physiological functions such as angiogenesis, hemostasis, ...

A Microphysiological System to Study Leukocyte-Endothelial Cell Interaction during Inflammation

Leukocyte-endothelial cell interactions play an important role in inflammatory diseases such as sepsis. During inflammation, excessive migration of activated leukocytes across the vascular endothelium into key organs can lead to organ failure. A physiologically relevant biomimetic microfluidic assay (bMFA) has been developed and validated using several experimental and computational techniques, which can reproduce the entire leukocyte rolling/adhesion/migration cascade to study leukocyte-endothelial cell interactions. Microvascular networks obtained from in vivo images in rodents were digitized using a Geographic Information System (GIS) approach and microfabricated with polydimethylsiloxane (PDMS) on a microscope slide. To study the effect of shear rate and vascular topology on leukocyte-endothelial cell interactions, a Computational Fluid Dynamics (CFD) model was developed to generate a corresponding map of shear rates and velocities throughout the network. The bMFA enables the quantification of leukocyte-endothelial cells interactions, including rolling velocity, number of adhered leukocytes in response to different shear rates, number of migrated leukocytes, endothelial cell permeability, adhesion molecule expression and other important variables. Furthermore, by using human-related samples, such as human endothelial cells and leukocytes, bMFA provides a tool for rapid screening of potential therapeutics to increase their clinical translatability.

In this protocol, a biomimetic microfluid assay, which can reproduce a physiologically relevant microvascular environment and reproduce the entire leukocyte adhesion/migration cascade, is employed to study leukocyte-endothelial cell interactions in inflammatory disease.

염증 중 백혈구-내피 세포 상호작용을 연구하는 미생리학적 시스템

Leukocyte-endothelial cell interactions play an important role in inflammatory diseases such as sepsis. During inflammation, excessive migration of ...