우리는 기꺼이 그 DARPA 후원 마이크로 / 나노 Fluidics 기본 포커스 (MF3) 계약 번호 N66001-10-1-4003, 이하 센터에서와 DARPA 부여 N660001-09-C-2082에서 기금을 인정합니다.

1. ITP의 물리학 ITP는 같은 요금 이온 사이에 날카로운 감동적인 경계를 형성합니다. 기술은 음이온이나 양이온 샘플 수행하지만 재단사이 음이온 ITP에 대한 소개와 유의 동일한 원칙 양이온 ITP에 적용할 수 있습니다. 우리는 르 이온이 높은 진도​​ 효과적인 전기 영 동적 이동성이 있는지 등의 르와 TE 버퍼를 선택합니다. 효과적인 전기 영 동적 이동성, μ는 = U / E는, 응용 전기 분야, 전자 및 이온 드리프트 속도, U 사이에 일정한 비례이다. 13 우리는 르와 장비 사이에 확산 인터페이스를 설정하고부터 높은 감독 전기장을 적용 낮은 전도성 TE 영역에 전도성 르 영역. 시스템은 신속 비 균일한 전도성 프로파일에 의한 ITP 인터페이스에서 전기 분야에서 강력한 그라디언트를 설정합니다. 이름마다 동일한, 균일한했습니다에서 TE와 르 이온 여행 (그리스로부터, &quot;isos&quot;는 &quot;takhos&quot;는 &quot;속도&quot;를 의미, &quot;평등&quot;이라는 뜻)locity가 아닌 균일한 전기장과 전류의 절약의 결과로 (이것은 소위 &quot;ITP 상태&quot;이며, 그림 1 참조). ITP 인터페이스는 셀프 샤프닝됩니다 TE 영역의 경험으로 강력한 복원 자속을 무마하여 선도 지역 (그리고 르 영역에 TE 이온에 대한 반대의 경우)로 돌아갑니다 것을 르 이온. 샘플 이온은 TE 영역에서의 효율적인 이동성이 TE 공동 이온보다 큰 경우이 인터페이스에 초점을, 그리고 르 영역에서의 효율적인 이동성이 르 공동 이온 (그림 1 참조)보다 적은 경우. 이 기법의 견고에 기여하고 인터페이스 (예 : 같은 수축, 확장 및 회전과 같은 압력 구동 흐름이나 형상의 변화로 인한)의 방해로 ITP가 상대적으로 구별하게 셀프 샤프닝 및 ITP의 속성을 집중. 정상 모드 ITP (그림 2A 및 비디오 1-2 참조)에서 샘플 이온 농도입니다항상 르와 TE 이온 농도보다 훨씬 낮은, 따라서 지역 전도성에 negligibly 기여합니다. 샘플 이온의 분포는 인접 구역 간의자가 선명 인터페이스 (여기 TE와 르) 및 이들 영역에 상대적인 표본 효과적인 이동성의 가치에 의해 결정됩니다. 대부분으로 14 다중 샘플 이온은 같은 좁은 ITP 인터페이스 영역 내에 집중 봉우리 중복. 인터페이스와 최대 너비뿐만 아니라 관련 preconcentration 팩터, 적용 전류와 반대 스케일 (그림 2B의 실험 참조). 14 충분히 높은 초기 시료 농도 및 충분한 축적 시간의 경우 샘플 이온은 임계 농도 값에 도달합니다. 완전 이온화 종의 경우이 값은 Kohlrausch의 조절 기능 (KRF)에 의해 결정됩니다. 약한 전해질 15은 그게 Alberty과 Jovin 기능에 의해 결정됩니다. 고원에서 16,17모드, 그림 3과 샘플 이온들의 효과적인 이동성에 의해 결정 순서 로컬 균일하고 일정한 농도의 영역으로 분리하여 정화 비디오 3에 묘사된. 아주 묽은 이온은 여전히​​ 고원 지대 사이에 피크 모드에서 초점을 맞출 수 있습니다. ITP에서는 시료 이온은 TE와 르 (그림 3 참조) 사이에 유한 주입에 소개하거나 교대 TE 및 / 또는 LE (그림 2 참조)과 함께 혼합. 우리는 지속적으로 analyte 이온을 축적하는 데 사용할 수있는 &#39;세미 무한 &quot;주사로 TE 영역에 믹싱을 참조하십시오. 연속 샘플 축적 피크와 고원 모드 assays 모두에서 감도를 증가시킵니다. 그러나 유한 주사는 고원 모드에서보다 일반적인 수 있습니다. 세미 무한 사출 높은 초기 analyte의 농도가 크게 TE의 전도성과 낮은 초점 률을 높일 수 있기 때문에이 가능성이 높습니다. 또한, 완전한 정화가 (거기에 레마 이후 세미 무한 주사에 수 없습니다TE의 기능은 유한 농도). 2. 장치 청소 및 준비 이 프로토콜에서 제공 assays 위해 우리는 교차 채널 설계 (그림 1 참조)와 함께 isotropically (약 D-모양의 단면) 젖어 에칭처리된 유리 microfluidic 칩을 사용합니다. 다음 청소 및 준비 프로토콜은 borosilicate와 융합된 실리카 채널에 최적화되어 있습니다뿐만 아니라 유리 / PDMS 칩을 사용할 수 있습니다. 실행 대 실행 repeatability 및 electroosmotic 흐름 (EOF)을 억제하는 데 필요한 동적 코팅의 성공적인 응용을 보장하기 위해 사전 실험이 청소 절차를 수행합니다. 이 프로토콜의 누락은 ITP 인터페이스의 강력한 분산을 초래할 수 있습니다. 14 <ol><li> 채널을 오염을 제거하다하려면 10 %의 표백제 10-20 μL와 북쪽 동쪽과 남쪽 저수지를 채우는 2 분 서쪽 저수지에서 진공을 적용합니다. 표준 캘리퍼스 칩을 캐디를 사용하는 경우 진공 효과적으로 간단하게 attachin하여 적용할 수g 폭 200 μL의 끝 (필터없는) 칩에 저수지에 피펫 팁 및 2mm 내경 관에 진공 라인을 연결. </li><li> 저수지을 비우 2 분 1 M의 수산화 나트륨과 채널을 (1 단계) 린스. 이것은 부드럽게 균일한 표면 속성을 설정할 수 있도록 깨끗한​​ borosilicate 표면을하였으며, 채널 벽면을 파 놓았. </li><li> 저수지 빈과 드 이온화된 물 (DI)과 깨끗한 후 ~ 2 분 르와 채널을 린스. 이 기간 동안 표면 특성과 역동적인 코팅 채널 내에서 평형. </li></ol> 3. 형광단는 정상 모드로 ITP에 초점 <ol><li> 100 MM HCL, 200 MM 트리스, 그리고 1퍼센트 PVP로 구성된 하나 ML 르를 준비합니다. </li><li> 100 밀리미터 HEPES 구성된 한 ML TE 200 MM 트리스를 준비합니다. 1 μm의 알렉사 형석 488 (AF488) 10 μl와 TE의 90 μl을 결합. </li><li> 르와 rinsing 후에 같이 빈, 부 2에 서쪽 저수지를 설명하며하거나 DI와 몇 번 청소데르는 저수지에 남아있는 르를 희석합니다. 20 μL TE는 AF488를 포함하는으로이 저수지를 채웁니다. </li><li> 동쪽 저수지에서 긍정적인 전극과 서쪽 저수지에서 지상 (부정적인) 전극을 놓고 2 μA를 (정전류) 적용됩니다. 샘플 피크는 서부 저수지에서 동쪽 저수지 (그림 1 참조)과 낮은 전도율 TE는 채널을 채우고으로 이러한 저수지 사이의 전압이 증가에 일정한 속도로 마이 그 레이션됩니다. </li></ol> 4. 교양 E.로부터 추출 및 핵산의 정화 대장균 선택적으로 이온 종을 집중할 수있는 능력은 생물 학적 샘플 준비를위한 이상적인 기술을 ITP 있습니다. 우리는 효과적인 이동성 진도 대상 핵산보다 낮은지만 공동 이온 PCR 억제제 (예 : 음이온 세제, 단백질 및 유기 용제, 경우에도 하이에 존재보다 높은과 후행 음이온을 선택하여 치료 세포 lysate로부터 핵산 정화GH 농도). 양이온 PCR 저해제 (예 : 알칼리 금속 양이온 단백질과 세제)은 반대 방향으로 마이 그 레이션하고 너무도 뒤에 남아 있습니다. 느린 PCR-억제 종 배후를 (그림 4 참조) 떠나는 동안 ITP는 샘플 저수지에서 대상 핵산을 추출하고 초점을 맞추고 있습니다. <ol><li> 의 샘플이나 문화 E.를 구합니다 밀도보다 큰 10 8 CFU / ML에 대한 대장균 세포. </li><li> 6 분 대한 4천g에서 원심 분리하여 안전한 잠금 microcentrifuge 튜브 및 펠렛으로 한 ML 셀 문화를 전송합니다. </li><li> 80 μL RNase없는 물에 펠릿를 다시 중지 및 10 밀리미터 tricine, 10 MM 비스 - 트리스, 2 밀리미터 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 0.1 % 트리톤-X, 5 밀리그램 / ML 라이 소 자임 구성된 에이전트를 lysing 10 μL를 추가합니다. 부드럽게 섞어서 5 분 동안 품어. 상온에서 (Bercovici 외에서 적응 lysing 프로토콜. 11). </li><li> ~ 12.5로 lysate 산도 마련을 위해 1 M의 수산화 나트륨 10 μL를 추가합니다. 부드럽게 피펫을 행동시키다 아래까지솔루션은 포인트 lysing이 완료되는, 분명해진다. </li><li> 50 밀리미터 tricine 90 μL과 100 MM 비스 - 트리스와 lysate 10 μL을 결합. 이 솔루션은 현재 장비로 사용될 수 있습니다. </li><li> 500 MM 비스 - 트리스, 250 MM HCL, 1 % PVP 및 1X SYBR 녹색 II로 구성된 르의 1 ML을 준비합니다. 같은 파트 3에서 설명한 르와 microfluidic 칩을 채웁니다. </li><li> ITP에 따라 오프 칩 분석을 위해 정화 핵산을 추출하기 위해서는 50mM 비스 - 트리스, 25 MM HCL, 그리고 0.1 % PVP를 포함하는 PCR 호환 르와 동부 저수지의 내용을 바꿉니다. 실험을 시작하기 위해 동서 우물 사이에 1,000 V를 적용합니다. 이들 저수지 사이에 전류가 줄어 듭니다. </li><li> 실험이 끝나면 예제 르의 저수지로 elutes. 이 용출과 일치하는,이 시스템의 현재 대 시간은 일반적으로 대지 값 (저항이 이제 균일 채널 내에 분산 TE 이온에 의해 지배되기 때문에)에 도달합니다. 부드럽게 저수지를 섞어작품 내용은 pipetting을 반복하고 정량 RT-PCR에 의한 분석을 위해 5 μL 볼륨 압축을 풉니다. </li></ol> 5. 시각화를위한 양이온 고원 모드 ITP와 비 초점 추적 (노퍽 표준시)과 아미노산의 분리 ITP는 TE와 르 사이에 인접한 및 감지 대지에 작은 이온을 분리해서 집중하는 데 사용할 수 있습니다. 여기에는 로컬 전도성, 자외선 흡광도, 온도 감지, 또는 굴절 지수와 같은 물리 특성을 바탕으로 탐지 및 식별이 가능합니다. 자, 형광등, 공동 이온 종은 르에 추가됩니다 아닌 초점 추적 (노퍽 표준시) 분석을 보여줍니다. 이 형광 종이 초점을 아니지만, 그 농도는 지역의 전기장에 적응함으로써 (그림 5 참조) 정화 고원 지대의 시각화를 가능하게합니다. <ol><li> 100 밀리미터 ethanolamine 구성된 한 ML 르, 200 밀리미터 tricine 및 1퍼센트 PVP와 양이온 형광단의 Rhodamine 6G의 100 μm의를 준비합니다. </li> &lt;리&gt; 준비하십시오 하나 ML TE 20 MM 트리스, 40 밀리미터 tricine 구성된. 10 μL 50 밀리미터 아르기닌의 각과 라이신 50 밀리미터와 TE의 90 μL를 혼합하여 샘플을 준비합니다. </li><li> 20 μL 서부 르와 동부 저수지의 북쪽 저수지와 샘플을 분배. 1 분 동안 남쪽 저수지에서 진공을 적용합니다. </li><li> DI와 잘 이스트를 씻어 및 시험 장비 (샘플 제외 TE)로 바꿉니다. </li><li> 동서 저수지 사이에 500 V를 적용합니다. </li></ol> 6. 대표 결과 우리는 그림 4에서 그림 2B와 핵산 추출 실험에서 피크 모드 실험 isotachopherograms을 보여줍니다. 형광 리포터 (예 : AF488, SYBR 녹색 II)와 피크 모드 실험에서는 전체적인 형광 강도가 정량 농도 정보를 얻을 교정 곡선으로부터 통합과 비교할 수 있습니다. 또한 12, 핵산 추출 실험에서 샘플을 elute 수 있습니다 t로그는 르 저수지 및 정량 RT-PCR. 10,12하여 분석을 위해 피펫으로 추출된 우리는 그림 5의 아미노산 분리를 위해 대지 모드 isotachopherograms을 보여줍니다. 영역 너비가 quantitation을 사용하면서 형광 강도는 (르거나 TE 지대 강도에 상대적), 영역 식별에 사용할 수 있습니다. <img alt="1 그림." src="/files/ftp_upload/3890/3890fig1.jpg" /> 그림 1. Isotachophoresis (ITP)은 이온의 민감한 감지 및 분리를 위해 microfluidic 어플 리케이션에 사용되는 계면 기술이다. ITP는 분리, 선택 집중, 그리고 preconcentration 기능을 제공합니다. 또한, 그것은 매우 강력하고 있기 때문에 그 자체 선명하게 자연의 물리적인 방해로 구분하지 않습니다. 샘플 이온 선택적으로 르 영역에서 선도적인 이온의 속도에 의해 결정 일정한 속도로 microchannel 통해 선도 (LE)와 후행 전해질 (TE)와 여행 사이에 중점을 둡니다. 샘플 이온그들의 효과적인 전기 영 동적 이동성이 르와 TE 이온의 효과적인 이동성에 의해 괄호 경우 중점을 둡니다. 개략도 예제 르와 TE 영역 사이에 연속적으로 초점을 맞춘 모델 ITP 실험을 묘사. <img alt="그림 2." src="/files/ftp_upload/3890/3890fig2.jpg" /> 그림 2. &quot;정상 모드&quot;ITP에서 샘플 이온 초점을 희석. ) 두 개의 묽은 (C 샘플 &lt;&lt; C 르) 르와 TE 영역 사이에 형성된 인터페이스에서 정상 모드에서 수종 초점. 샘플 종 상당히 전류에 기여하지 않는 한 전적 르와 장비는 전기 필드를 결정합니다. 샘플 이온은 TE (세미 무한 주사)을 함께 혼합하고 ITP 인터페이스에서 대략 가우스 피크에 함께 집중. 포커싱 기준가 (불평등로 표시) 강하게 이온화 수종에 적용됩니다. b)는 알렉사 형석에게 488 (AF488)를 보여주는 실험 (또한 V를보고 응용 전류 범위 피크 모드에서 초점ideo 1). 샘플 피크 폭 (electroosmotic 흐름으로 인해 무시할 advective 분산의 경우) 전류에 반비례합니다. 14 셀프 샤프닝 인터페이스가 압력 중심의 흐름 (비디오 2 참조)에 의한 분산에 강한 것입니다. <img alt="그림 3." src="/files/ftp_upload/3890/3890fig3.jpg" /> 그림 3. 샘플 &quot;대지 모드&quot;에서 충분히 높은 농도 초점에서 이온과 지방 전도성 적용됩니다. 우리는 일반적으로 장비와 르 간의 유한 주입에 샘플 이온을 소개합니다. 이러한 양상에서, 그들의 효과적인 전기 영 동적 이동성 (비디오 3 참조)에 따라 샘플 이온 분리 및 주문. 강하게 이온화 종 들어, TE 및 고원 지대 농도는 Kohlrausch의 조절 기능 (KRF, 르 영역에 의해 처음 불변량 세트)에 의해 결정됩니다. 희석 이온은 고원 지역의 bracketing들의 효과적인 이동성 사이 정상 모드에서 초점을 맞출 것을 계속한다. C를 중심으로riterion는 (불평등로 표시) 강하게 이온화 수종에 적용됩니다. <img alt="4 그림." src="/files/ftp_upload/3890/3890fig4.jpg" /> 그림 4. 피크 모드 ITP와 준비와 핵산 추출 Lysate. 핵산은 E.에서 추출됩니다 라이 소 자임 이용한 알칼리 lysing을 사용하고 ITP를 통해 초점을 선택적 전기에 의해 정화 대장균의 세포 배양. lysate와 혼합 TE는 (갈색) 대상 핵산의 산성 (녹색), 단백질, 및 잠재적인 PCR-억제 화학 포함되어 있습니다. 이온 후행하고 선도의 적절한 선택은 뒤에 PCR 억제제를 떠나는 동안 표적 핵산의 중심으로 선택 가능합니다. 삽입된 페이지 이미지에 현재와 같이 총 핵산 ITP 피크는 종종, 비 이상적인 형태를 취한다. 이 분석의 시연으로 우리는 그람 음성 세균에서 총 핵산을 추출, ITP를 사용하여 대장균 (혼자 수산화 나트륨 용액으로 lysed), lysate로부터 정화 NA는 수집유전 물질을 추출하고, 16 rRNA (적색) 및 세균성 문화에서 16 rDNA (녹색)의 성공적인 정화를 확인 qRT-PCR 분석을 수행했습니다. 16 rRNA (파란색)과 16 rDNA (노란색)에 대한 부정적 제어 임계값주기는 각보다 30 사이클 있었다. 우리는 파워 SYBR 녹색 RNA - 투 - C T 권장 열 사이클링 조건 150 앞으로 NM (5&#39;-CGGATTGGAGTCTGCAACTCG) 및 역방향 (5&#39;-CACAAAGTGGTAAG CGCCCTC) primers와 응용 Biosystems에서 1 단계는 키트를 사용 qRT-PCR을 수행. <img alt="그림 5." src="/files/ftp_upload/3890/3890fig5.jpg" /> 그림 5. 비 초점 레이블이 지정되지 않은 아미노산의 분리 및 검출을위한 트레 이서 (노퍽 표준시) 분석합니다. 노퍽 표준시 분석의) 도식. 샘플 이온의 유한 주입은 이스트 채널에 소개된다. 우리는 TE 이온 (μ의 추적기는 &lt;μ TE)보다 효과적인 이동성 낮은과 추적 양이온 형광단로 르를 섞는다. 형광단&quot;underspeeding의 트레 이서 &#39;역할을했다고한다. 형광단 이제 샘플 고원 및 시험 장비에 의해 점령 지역으로 르에서 electromigrates로서 높은 전기장 때문에 그것의 농도 증가를 경험한다. 농도에서이 변경 사항은 isotachopherogram의 단계를 만듭니다. B) 2 아미노산, 아르기닌과 라이신의 분리는 underspeeding 형광 트레 이서 등 Rhodamine 6G 제품과 함께 노퍽 표준시 분석을 사용합니다. TE와 아르기닌 사이에 약간의 피크는 ITP에 공통적으로 잘 이해되지 않으며 여기에 대지를 감지하거나 quantifying을 방해하지 않습니다. 보충 영화 1. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3890/3890movie1.mpg" target="_blank">보완 동영상을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . 보충 동영상 2. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3890/3890movie2.mpg" target="_blank">보완 동영상을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . 보충 영화 3. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3890/3890movie3.mpg" target="_blank">보완 동영상을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> .

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우리는 공개 할게 없다.

ITP 방법은 여기 이온 분자의 신속한 민감하고 강력한 탐지 및 처리를 가능하게 표현했습니다. ITP를 사용하는 주요 과제는 르와 TE 버퍼의 적절한 선택입니다. 그것이 매우 높은 절대적인 이동성을 가진 강한 산성이며 따라서 매우 예측 가능한 특성을 가지고 있기 때문에 음이온의 ITP에서 우리는 일반적으로 최고의 음이온으로 염화물을 선택합니다. 따라서 음이온 ITP의 버퍼의 선택은 일반적으로 적절한 장비와 counterion을 선택으로 감소됩니다. 선택적 집중 실험 들어, TE의 선택은 이온 오염의 배제하기 위해 중요합니다. 오염 물질이 존재하지 않습니다 응용 프로그램에서는 더 낮은 TE 효과적인 이동성 초점의 빠른 속도로 연결됩니다. MES, 맙스, HEPES, tricine : 우리는 상대적으로 음이온 TE 이온을 잘 행동, 다음을 사용하는 것이 좋습니다. counterion의 선택은 시스템 산도 및 시험 장비 효율적인 이동성을 모두에 영향을 미칩니다. 일반 counterions은 트리스 (pKa 8.1) 및 비스 - 트리스 (pKa 6.4)입니다. 낮은 이상의 산도가 필요한 assays에 대해서는 피리딘을 추천 (pKa 5.25) 및각각 ethanolamine (pKa 9.5). 표 1과 2에서 음이온과 양이온 ITP에 대해 각각, 우리는 몇 가지 유용한 버퍼 예제를 요약합니다. 우리는 양이온 르 이온 등의 음이온 르 이온과 나트륨으로 HCL을 받아, 우리는 르 버퍼의 100 MM 이온 강도를 가정합니다. 리더는 우리의 프로토콜에서 해당 버퍼 이온 강도에 유의 (및 표 1-2에) 항상보다 큼 또는 10 밀리미터와 동일합니다. 이론에서 ITP의 물리학은 10 밀리미터보다 낮은 이온 강도에 적용하는 동안 1 ㎜ 수준 근처 자연 오염 물질 (물과 대기의 이산화탄소 간의 반응의 예 탄산) 종종 낮은 이온 강도 버퍼의 실제적인 사용을 제한합니다. 우리는 신호 전달 메커니즘이 프로토콜에 표시 assays에 한정하지 않습니다. 영역을 정화 고원 모드에서 5 부에서 짧게 말씀 드린대로 지역 전도도의 변화, 자외선 absor 통해 감지할 수굴절 ba​​nce, 온도, 또는 인덱스. 우리 자신의 그룹에서 우리는 알 수없는 analytes의 민감한 탐지 및 식별을위한 형광 캐리어 ampholytes을 활용하는 방법을 개발했습니다. 피크 모드 실험 5는 특정 프로브이 집중 analytes 레이블을 지정하는 데 사용할 수 있습니다. 높은 특이성과 대상의 DNA 또는 RNA 분자를 탐지하기 위해 11,18가 - 그들의 목표 시퀀스에 하이브 리다이 제이션에 따라 형광 oligonucleotide 프로브 - 한 예제에서, 우리는 분자 비콘을 사용합니다. ITP는 압력 중심의 흐름과 EOF에 의한 분산 상대적으로 견고하지만, 과도한 EOF가 평균 EOF 속도는 ITP 속도와 동일된다 ITP 인터페이스의 침체로 이어질 수 있습니다. 14 이러한 강력한 EOF 특히 높은 산도 조건에서 발생 낮은 이온 강도. 이러한 이유로, 우리는 100 MM의 순서 편리한 경우에 pH를 8 이하로와 이온 강도와 버퍼의 사용을 권장합니다. 우리의 경험에서는 PVP가borosilicate 칩의 EOF 억제를위한 가장 효과적인 코팅. 그러나, 그 체질 특성 때문에 PVP는 게놈 DNA를 중심으로 같은 일부 응용 프로그램에 적합하지 않을 수 있습니다. 실험에서 우리는 PVP의 또한 크게 (이것은 집중하지 않는 지점까지) 게놈 DNA는 절대 이동성을 줄일 수 있습니다 관찰합니다. 이러한 경우에는 같은 계면 활성제 (예 : 트리톤-X 100)과 conjuction에서 Sigmacote 같은 silanol 코팅도 EOF를 줄이는 효과가 될 수 있습니다. 10 <table border="1"><tbody><tr><td></td><td colspan="4"> TE의 음이온 (pKa -1) </td></tr><tr><td> 버퍼링 counterion (pKa +1) </td><td> MES (6.10) </td><td> 맙스 (7.20) </td><td> HEPES (7.50) </td><td> tricine (8.15) </td></tr><tr><td> ethanolamine (9.50) </td><td> 21.41 </td><td> 20.40 </td><td> 17.38 </td><td> 22.85 </td></tr><tr><td> 트리스 (8.08) </td><td> 21.00 </td><td> 19.23 &lt;/ TD&gt; <td> 15.84 </td><td> 17.56 </td></tr><tr><td> 비스 - 트리스 (6.40) </td><td> 18.22 </td><td> 10.41 </td><td> 7.30 </td><td> 5.23 </td></tr><tr><td> 피리딘 (5.18) </td><td> 1.01 </td><td> 3.72 </td><td> 2.42 </td><td> 1.48 </td></tr></tbody></table> 표 1. 르가 100 밀리미터 HCL 200 밀리미터 버퍼링 counterion입니다 음이온 ITP에서 조정된 순수 analyte 영역의 효과적인 이동성 진도 (× 10 -9 m 2 / V / s의). <table border="1"><tbody><tr><td></td><td colspan="4"> TE 양이온 (pKa +1) </td></tr><tr><td> 버퍼링 counterion (pKa -1) </td><td> ethanolamine (9.50) </td><td> 트리스 (8.08) </td><td> 비스 - 트리스 (6.40) </td><td> 피리딘 (5.18) </td></tr><tr><td> MES (6.10) </td><td> 35.57 </td><td> 21.96 </td><td> 16.39 </td><td> 10.45 </td></tr><tr><td> 미주리PS (7.20) </td><td> 35.47 </td><td> 20.92 </td><td> 9.76 </td><td> 3.93 </td></tr><tr><td> HEPES (7.50) </td><td> 35.35 </td><td> 19.97 </td><td> 7.77 </td><td> 2.88 </td></tr><tr><td> Tricine (8.15) </td><td> 34.77 </td><td> 16.72 </td><td> 4.50 </td><td> 1.44 </td></tr></tbody></table> 표 2. 양이온 ITP에서 조정된 순수 analyte 영역의 효과적인 이동성 진도 (× 10 -9 m 2 / V / s)로 LE 100 밀리미터 나트륨 200 밀리미터 버퍼링 counterion입니다.

<table border="1"><tbody><tr><td colspan="4"> 시약 </td></tr><tr><td> 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> 증류수 </td><td> GIBCO </td><td> 10,977 </td><td> RNase / DNase 무료 </td></tr><tr><td> Clorox 울트라 </td><td> Clorox </td><td> 02489CT </td><td></td></tr><tr><td> 수산화 나트륨 (NaOH) </td><td> Mallinckrodt </td><td> 7708 </td><td></td></tr><tr><td> 염산 (HCL) </td><td> EMD 화학 </td><td> HX0603-4 </td><td></td></tr><tr><td> Trizma베이스 (트리스) </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> T6066 </td><td></td></tr><tr><td> polyvinylpyrrolidone (PVP) </td><td> Polysciences 주식 회사 </td><td> 06,067 </td><td> MW 1,000,000 </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> H-4034 </td><td></td></tr><tr><td> 알렉사 형석 488 카르복실산 </td><td> Invitrogen </td><td> A20000 </td><td></td></tr><tr><td> tricine </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> T-9784 </td><td></td></tr><tr><td> 비스 - 트리스 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> B4429 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) </td><td> GIBCO </td><td> AM9260G </td><td></td></tr><tr><td> 트리톤-X 100 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> X100 </td><td></td></tr><tr><td> 라이 소 자임 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> L6876 </td><td></td></tr><tr><td> SYBR 녹색 II </td><td> Invitrogen </td><td> S7564 </td><td></td></tr><tr><td> ethanolamine </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> 411,000 </td><td></td></tr><tr><td> Rhodamine 6G </td><td> Acros의 생명체 (Geel, 벨기에) </td><td> CAS 989-38-8 </td><td></td></tr><tr><td> L-아미노산 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> LAA21 </td><td></td></tr><tr><td> 전원 SYBR 녹색 RNA - 투 - C T 1 단계 키트 </td><td> 응용 Biosystems </td><td> 4,389,986 </td><td></td></tr><tr> &lt;TD&gt; PCR primers </td><td> 통합의 DNA 기술 </td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> 장비 </td></tr><tr><td> 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> Borosilicate microfluidic 칩 </td><td> 캘리퍼스 생명 과학 주식 회사 </td><td> NS12A </td><td> 플라스틱 캐디와 함께 또는없이 공급 </td></tr><tr><td> 배기기 </td><td> Gast </td><td> DOA-P104-AA </td><td></td></tr><tr><td> Sourcemeter </td><td> Keithley </td><td> 2410 </td><td> 정전류 및 정전압 동작 모드 </td></tr><tr><td> 거꾸로 epifluorescent 현미경 </td><td> 올림포스 산 </td><td> IX70 </td><td> 조명 때문에 수은 램프 (올림푸스) 또는 LED (Thorlabs)를 사용하여 </td></tr><tr><td> 필터 큐브 </td><td> 오메가 </td><td> XF115-2 </td><td> 여기 / 방출 : 녹색 / 청색 </td></tr><tr><td> 금고microcentrifuge 튜브를 잠그려면 </td><td> Eppendorf </td><td> 022,363,204 </td><td> 1.5 ML 용량 </td></tr><tr><td> 원심 분리기 </td><td> Eppendorf </td><td> 5417C </td><td></td></tr></tbody></table> 표 3. 특정 시약 및 장비.

on-chip isotachophoresis for separation of ions and purification of nucleic acids

계면 기술 인해 움직이는 부분과 간단한 소형 시스템에서 유체 및 전기 공정의 다양한 수행하는 그들의 특별한 능력의 microscale 애플 리케이션의 스테이플러입니다. Isotachophoresis (ITP)는 이온 이동성을 기반으로 만 배 preconcentration 1,2 효율적인 분리 및 추출을 달성할 수있는 간단하고 매우 강력한 계면 기술입니다. 예를 들어, 우리가 분리하고 레이블이 지정되지 않은의 민감한 검출에 ITP의 적용을 증명 한것 3 거의 없거나 전혀없는 시료 준비 4-8과 및 세포 배양, 소변, 혈액을 포함한 복잡한 매트릭스에서 핵산의 추출 및 정제에 이온 분자 (예 : 독소, DNA, rRNA, miRNA). 9-12 ITP는 초점과 유체 채널 시스템 내에서 적용된 전기장 두 개의 버퍼를 사용하여 분리를 실현. 음이온 analytes 들어, 선도 전해액 (르) 버퍼의 선택됩니다그 anions는 후행 전해질 (TE) 버퍼 (효과적인 이동성은 이온의 관찰할 수 드리프트 속도를 설명하고 같은 Persat 외 의해 상세하게 설명한 계정으로 이온의 이온화 상태를 소요의 anions보다 높은 효과적인 전기 영 동적 이동성이 있는지 uch . 13). TE와 르 간의 인터페이스를 맺은 후, 전기장이 르 이온은 TE 이온에 의해 점령 지역에서 떨어져 이동되는 등 적용됩니다. 앞서 TE 이온의지만, 중간 효과적인 이동성 경주의 샘플 이온 르 이온을 추월 수 없으며, 그래서 그들은 LE-TE 인터페이스 (이하 &quot;ITP 인터페이스 &#39;라고도 함)에 중점을 둡니다. 또한, TE 및 ITP 인터페이스에서 가파른 전기장 기울기를 확립 각각 낮은과 높은 전도성의 르 양식 영역. 그들이 초점으로이 필드 기울기는 샘플 종 preconcentrates. 적절한 기타 비 중심의 종으로부터 초점과 대상 종의 정화의 TE와 르 결과의 선택과, 결국 분리샘플 종의 D 분리. 우리는 여기서 물리적 원리 근본 ITP를 검토 및 운영의 두 표준 모드 토론 : &quot;정상&quot;및 &quot;대지&quot;모드. 정상 모드에서는 비교적 시료 이온은 ITP 인터페이스에서 좁은 봉우리 중복 내에서 함께 초점을 희석. 고원 모드에서보다 풍부한 샘플 이온은 정상 상태 농도에 도달하고 효과적인 이동성의 지시 인접한 대지와 같은 영역으로 분리. 피크와 고원 모드는 동일한 기본 물리학 중에 발생하지만 초기 analyte 농도 및 / 또는 샘플 축적에 할당된 시간의 금액으로 구분 별개의 정권을 나타냅니다. 우리가 먼저 세부 모델 피크 모드 실험에 대해 설명하고 E.로부터 핵산의 추출을위한 피크 모드 분석을 증명 대장균의 세포 배양. 우리는 분리를 시각화하는 비 초점 추적 (노퍽 표준시) 종이를 사용하여 어디 고원 모드 분석을 제시하며 당 맺다아미노산의 quantitation를 형성하고 있습니다.

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On-chip Isotachophoresis for Separation of Ions and Purification of Nucleic Acids

Isotachophoresis (ITP)는 독소 검출에서 샘플 준비에 이르기까지 다양한 애플 리케이션과 강력한 계면 분리 및 preconcentration 기술입니다. 분리와 작은 분자 및 세포 배양 lysate로부터 핵산 정화의 검출 : 우리는 ITP의 물리적 원리와 두 구체적인 예를 들어 응용 프로그램에이 기법을 적용하는 방법론을 검토합니다.

이온의 분리 및 핵산의 정화를위한 온칩 Isotachophoresis

Electrokinetic techniques are a staple of microscale applications because of their unique ability to perform a variety of fluidic and electrophoretic ...

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24.2K 조회수.  Stanford University. Isotachophoresis (ITP)는 독소 검출에서 샘플 준비에 이르기까지 다양한 애플 리케이션과 강력한 계면 분리 및 preconcentration 기술입니다. 분리와 작은 분자 및 세포 배양 lysate로부터 핵산 정화의 검출 : 우리는 ITP의 물리적 원리와 두 구체적인 예를 들어 응용 프로그램에이 기법을 적용하는 방법론을 검토합니다.

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Fabrication of Electrochemical-DNA Biosensors for the Reagentless Detection of Nucleic Acids, Proteins and Small Molecules

As medicine is currently practiced, doctors send specimens to a central laboratory for testing and thus must wait hours or days to 
receive the results. Many patients would be better served by rapid, bedside tests. To this end our laboratory and others have developed a versatile, reagentless 
biosensor platform that supports the quantitative, reagentless, electrochemical detection of nucleic acids (DNA, RNA), proteins (including antibodies) and small 
molecules analytes directly in unprocessed clinical and environmental samples. In this video, we demonstrate the preparation and use of several biosensors in this 
"E-DNA" class. In particular, we fabricate and demonstrate sensors for the detection of a target DNA sequence in a polymerase chain reaction mixture, an HIV-specific antibody and the drug cocaine. The preparation procedure requires only three hours of hands-on effort followed by an overnight incubation, and their use requires only minutes.

"E-DNA" sensors, reagentless, electrochemical biosensors that perform well even when challenged directly in blood and other complex matrices, have been adapted to the detection of a wide range of nucleic acid, protein and small molecule analytes. Here we present a general procedure for the fabrication and use of such sensors.

핵산, 단백질과 작은 분자의 Reagentless 감지를위한 전기 -의 DNA Biosensors의 제작

As medicine is currently practiced, doctors send specimens to a central laboratory for testing and thus must wait hours or days to 
receive the results. ...

연구

생체공학

Lensfree On-chip Tomographic Microscopy Employing Multi-angle Illumination and Pixel Super-resolution

Tomographic imaging has been a widely used tool in medicine as it can provide three-dimensional (3D) structural information regarding objects of different size scales. In micrometer and millimeter scales, optical microscopy modalities find increasing use owing to the non-ionizing nature of visible light, and the availability of a rich set of illumination sources (such as lasers and light-emitting-diodes) and detection elements (such as large format CCD and CMOS detector-arrays). Among the recently developed optical tomographic microscopy modalities, one can include optical coherence tomography, optical diffraction tomography, optical projection tomography and light-sheet microscopy. 1-6 These platforms provide sectional imaging of cells, microorganisms and model animals such as C. elegans, zebrafish and mouse embryos.
Existing 3D optical imagers generally have relatively bulky and complex architectures, limiting the availability of these equipments to advanced laboratories, and impeding their integration with lab-on-a-chip platforms and microfluidic chips. To provide an alternative tomographic microscope, we recently developed lensfree optical tomography (LOT) as a high-throughput, compact and cost-effective optical tomography modality. 7 LOT discards the use of lenses and bulky optical components, and instead relies on multi-angle illumination and digital computation to achieve depth-resolved imaging of micro-objects over a large imaging volume. LOT can image biological specimen at a spatial resolution of &lt;1 &mu;m x &lt;1 &mu;m x &lt;3 &mu;m in the x, y and z dimensions, respectively, over a large imaging volume of 15-100 mm3, and can be particularly useful for lab-on-a-chip platforms.

Lensfree optical tomography is a three-dimensional microscopy technique that offers a spatial resolution of &lt;1 &mu;m &times; &lt;1 &mu;m &times; &lt;3 &mu;m in x, y and z dimensions, respectively, over a large imaging-volume of 15-100 mm3, which can be particularly useful for integration with lab-on-a-chip platforms.

멀티 앵글 조명 및 픽셀 슈퍼 해상도를 채용 Lensfree 온칩 단층 현미경

Tomographic imaging has been a widely used tool in medicine as it can provide three-dimensional (3D) structural information regarding objects of different ...

On-Chip Endothelial Inflammatory Phenotyping

Atherogenesis is potentiated by metabolic abnormalities that contribute to a heightened state of systemic inflammation resulting in endothelial dysfunction. However, early functional changes in endothelium that signify an individual's level of risk are not directly assessed clinically to help guide therapeutic strategy. Moreover, the regulation of inflammation by local hemodynamics contributes to the non-random spatial distribution of atherosclerosis, but the mechanisms are difficult to delineate in vivo. We describe a lab-on-a-chip based approach to quantitatively assay metabolic perturbation of inflammatory events in human endothelial cells (EC) and monocytes under precise flow conditions. Standard methods of soft lithography are used to microfabricate vascular mimetic microfluidic chambers (VMMC), which are bound directly to cultured EC monolayers.1 These devices have the advantage of using small volumes of reagents while providing a platform for directly imaging the inflammatory events at the membrane of EC exposed to a well-defined shear field. We have successfully applied these devices to investigate cytokine-,2 lipid-3, 4 and RAGE-induced5 inflammation in human aortic EC (HAEC). Here we document the use of the VMMC to assay monocytic cell (THP-1) rolling and arrest on HAEC monolayers that are conditioned under differential shear characteristics and activated by the inflammatory cytokine TNF-&alpha;. Studies such as these are providing mechanistic insight into atherosusceptibility under metabolic risk factors.

Microfluidic flow chambers etched by photolithography and fabricated from PDMS are applied to probe functional outcomes associated with EC dysfunction and inflammation. In a representative experiment, the ability of differential shear stress to modulate monocytic cell adhesion to cytokine activated EC monolayers is demonstrated.

온칩 내피 염증성 Phenotyping

Atherogenesis is potentiated by metabolic abnormalities that contribute to a heightened state of systemic inflammation resulting in endothelial ...

Dry Film Photoresist-based Electrochemical Microfluidic Biosensor Platform: Device Fabrication, On-chip Assay Preparation, and System Operation

In recent years, biomarker diagnostics became an indispensable tool for the diagnosis of human disease, especially for the point-of-care diagnostics. An easy-to-use and low-cost sensor platform is highly desired to measure various types of analytes (e.g., biomarkers, hormones, and drugs) quantitatively and specifically. For this reason, dry film photoresist technology - enabling cheap, facile, and high-throughput fabrication - was used to manufacture the microfluidic biosensor presented here. Depending on the bioassay used afterwards, the versatile platform is capable of detecting various types of biomolecules. For the fabrication of the device, platinum electrodes are structured on a flexible polyimide (PI) foil in the only clean-room process step. The PI foil serves as a substrate for the electrodes, which are insulated with an epoxy-based photoresist. The microfluidic channel is subsequently generated by the development and lamination of dry film photoresist (DFR) foils onto the PI wafer. By using a hydrophobic stopping barrier in the channel, the channel is separated into two specific areas: an immobilization section for the enzyme-linked assay and an electrochemical measurement cell for the amperometric signal readout.
The on-chip bioassay immobilization is performed by the adsorption of the biomolecules to the channel surface. The glucose oxidase enzyme is used as a transducer for electrochemical signal generation. In the presence of the substrate, glucose, hydrogen peroxide is produced, which is detected at the platinum working electrode. The stop-flow technique is applied to obtain signal amplification along with rapid detection. Different biomolecules can quantitatively be measured by means of the introduced microfluidic system, giving an indication of different types of diseases, or, in regard to therapeutic drug monitoring, facilitating a personalized therapy.

A microfluidic biosensor platform was designed and fabricated using low-cost dry film photoresist technology for the rapid and sensitive quantification of various analytes. This single-use system allows for the electrochemical readout of on-chip-immobilized enzyme-linked assays by means of the stop-flow technique.

드라이 필름 포토 레지스트 기반 전기 화학 미세 바이오 센서 플랫폼: 장치 제작, 온 칩 시험 준비 및 시스템 운영

In recent years, biomarker diagnostics became an indispensable tool for the diagnosis of human disease, especially for the point-of-care diagnostics. An ...

Fabrication and Validation of an Organ-on-chip System with Integrated Electrodes to Directly Quantify Transendothelial Electrical Resistance

Organs-on-chips, in vitro models involving the culture of (human) tissues inside microfluidic devices, are rapidly emerging and promise to provide useful research tools for studying human health and disease. To characterize the barrier function of cell layers cultured inside organ-on-chip devices, often transendothelial or transepithelial electrical resistance (TEER) is measured. To this end, electrodes are usually integrated into the chip by micromachining methods to provide more stable measurements than is achieved with manual insertion of electrodes into the inlets of the chip. However, these electrodes frequently hamper visual inspection of the studied cell layer or require expensive cleanroom processes for fabrication. To overcome these limitations, the device described here contains four easily integrated electrodes that are placed and fixed outside of the culture area, making visual inspection possible. Using these four electrodes the resistance of six measurement paths can be quantified, from which the TEER can be directly isolated, independent of the resistance of culture medium-filled microchannels. The blood-brain barrier was replicated in this device and its TEER was monitored to show the device applicability. This chip, the integrated electrodes and the TEER determination method are generally applicable in organs-on-chips, both to mimic other organs or to be incorporated into existing organ-on-chip systems.

This publication describes the fabrication of an organ-on-chip device with integrated electrodes for direct quantification of transendothelial electrical resistance (TEER). For validation, the blood-brain barrier was mimicked inside this microfluidic device and its barrier function was monitored. The presented methods for electrode integration and direct TEER quantification are generally applicable.

제조 및 통합된 전극 Transendothelial 전기 저항을 직접 측정 하는 기관-온-칩 시스템의 유효성 검사

Organs-on-chips, in vitro models involving the culture of (human) tissues inside microfluidic devices, are rapidly emerging and promise to provide useful ...

Visual Detection of Multiple Nucleic Acids in a Capillary Array

Multi-target, short time, and resource-affordable methodologies for the detection of multiple nucleic acids in a single, easy to operate test are urgently needed in disease diagnosis, microbial monitoring, genetically modified organism (GMO) detection, and forensic analysis. We have previously described the platform called CALM (Capillary Array-based Loop-mediated isothermal amplification for Multiplex visual detection of nucleic acids). Herein, we describe improved fabrication and performance processes for this platform. Here, we apply a small, ready-to-use cassette assembled by capillary array for multiplex visual detection of nucleic acids. The capillary array is pre-treated into a hydrophobic and hydrophilic pattern before fixing loop-mediated isothermal amplification (LAMP) primer sets in capillaries. After assembly of the loading adaptor, LAMP reaction mixture is loaded and isolated into each capillary, due to capillary force by a single pipetting step. The LAMP reactions are performed in parallel in the capillaries. The results are visually read out by illumination with a hand-held UV flashlight. Using this platform, we demonstrate monitoring of 8 frequently appearing elements and genes in GMO samples with high specificity and sensitivity. In summary, the platform described herein is intended to facilitate the detection of multiple nucleic acids. We believe it will be widely applicable in fields where high-throughput nucleic acid analysis is required.

This protocol describes the fabrication of a small, ready-to-use cassette that can be applied for visual detection of multiple nucleic acids in a single, test that is easy to operate. In this approach, a capillary array was used for multiplex and highly efficient detection of GMO targets.

모 세관 배열에 여러 개의 핵 산의 비주얼 검색

Multi-target, short time, and resource-affordable methodologies for the detection of multiple nucleic acids in a single, easy to operate test are urgently ...

Preparation, Purification, and Use of Fatty Acid-containing Liposomes

Liposomes containing single-chain amphiphiles, particularly fatty acids, exhibit distinct properties compared to those containing diacylphospholipids due to the unique chemical properties of these amphiphiles. In particular, fatty acid liposomes enhance dynamic character, due to the relatively high solubility of single-chain amphiphiles. Similarly, liposomes containing free fatty acids are more sensitive to salt and divalent cations, due to the strong interactions between the carboxylic acid head groups and metal ions. Here we illustrate techniques for preparation, purification, and use of liposomes comprised in part or whole of single chain amphiphiles (e.g., oleic acids).

Liposomes containing single-chain amphiphiles, particularly fatty acids, exhibit distinct properties compared to those containing diacylphospholipids due to the unique chemical properties of single chain amphiphiles. Here we describe techniques for the preparation, purification, and use of liposomes comprised in part or whole of these amphiphiles.

준비, 정화, 및 지방산 포함 된 리의 사용

Liposomes containing single-chain amphiphiles, particularly fatty acids, exhibit distinct properties compared to those containing diacylphospholipids due ...

Simultaneous Quantification of Selected Kynurenines Analyzed by Liquid Chromatography-Mass Spectrometry in Medium Collected from Cancer Cell Cultures

The kynurenine pathway and the tryptophan catabolites called kynurenines have received increased attention for their involvement in immune regulation and cancer biology. An in vitro cell culture assay is often used to learn about the contribution of different tryptophan catabolites in a disease mechanism and for testing therapeutic strategies. Cell culture medium that is rich in secreted metabolites and signaling molecules reflects the status of tryptophan metabolism and other cellular events. New protocols for the reliable quantification of multiple kynurenines in the complex cell culture medium are desired to allow for a reliable and quick analysis of multiple samples. This can be accomplished with liquid chromatography coupled with mass spectrometry. This powerful technique is employed in many clinical and research laboratories for the quantification of metabolites and can be used for measuring kynurenines.
Presented here is the use of liquid chromatography coupled with single quadrupole mass spectrometry (LC-SQ) for the simultaneous determination of four kynurenines, i.e., kynurenine, 3-hydroxykynurenine, 3-hydroxyanthranilic, and xanthurenic acid in the medium collected from in vitro cultured cancer cells. SQ detector is simple to use and less expensive compared to other mass spectrometers. In the SQ-MS analysis, multiple ions from the sample are generated and separated according to their specific mass-to-charge ratio (m/z), followed by the detection using a Single Ion Monitoring (SIM) mode.
This paper draws the attention on the advantages of the reported method and indicates some weak points. It is focused on critical elements of LC-SQ analysis including sample preparation along with chromatography and mass spectrometry analysis. The quality control, method calibration conditions and matrix effect issues are also discussed. We described a simple application of 3-nitrotyrosine as one analog standard for all target analytes. As confirmed by experiments with human ovary and breast cancer cells, the proposed LC-SQ method&#160;generates reliable results and can be further applied to other in vitro cellular models.

Described here is a protocol for the determination of four different tryptophan metabolites generated in the kynurenine pathway (kynurenine, 3-hydroxykynurenine, xanthurenic acid, 3-hydroxyanthranilic acid) in the medium collected from cancer cell cultures analyzed by liquid chromatography coupled with a single quadrupole mass spectrometry.

암 세포 배양에서 수집된 매체에서 액체 크로마토그래피 질량 분광법에 의해 분석된 선택된 Kynurenines의 동시 정량화

The kynurenine pathway and the tryptophan catabolites called kynurenines have received increased attention for their involvement in immune regulation and ...

Self-Assembly of Gamma-Modified Peptide Nucleic Acids into Complex Nanostructures in Organic Solvent Mixtures

Current strategies in DNA and RNA nanotechnology enable the self-assembly of a variety of nucleic acid nanostructures in aqueous or substantially hydrated media. In this article, we describe detailed protocols that enable the construction of nanofiber architectures in organic solvent mixtures through the self-assembly of uniquely addressable, single-stranded, gamma-modified peptide nucleic acid (&#947;PNA) tiles. Each single-stranded tile (SST) is a 12-base &#947;PNA oligomer composed of two concatenated modular domains of 6 bases each. Each domain can bind to a mutually complimentary domain present on neighboring strands using programmed complementarity to form nanofibers that can grow to microns in length. The SST motif is made of 9 total oligomers to enable the formation of 3-helix nanofibers. In contrast with analogous DNA nanostructures, which form diameter-monodisperse structures, these &#947;PNA systems form nanofibers that bundle along their widths during self-assembly in organic solvent mixtures. Self-assembly protocols described here therefore also include a conventional surfactant, Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), to reduce bundling effects.

This article provides protocols for the design and self-assembly of nanostructures from gamma-modified peptide nucleic acid oligomers in organic solvent mixtures.

감마 변형 펩타이드 핵산의 자가 조립을 유기 용매 혼합물의 복잡한 나노 구조로

Current strategies in DNA and RNA nanotechnology enable the self-assembly of a variety of nucleic acid nanostructures in aqueous or substantially hydrated ...

On-Chip Octanol-Assisted Liposome Assembly for Bioengineering

Microfluidics is a widely used tool to generate droplets and vesicles of various kinds in a controlled and high-throughput manner. Liposomes are simplistic cellular mimics composed of an aqueous interior surrounded by a lipid bilayer; they are valuable in designing synthetic cells and understanding the fundamentals of biological cells in an in vitro fashion and are important for applied sciences, such as cargo delivery for therapeutic applications. This article describes a detailed working protocol for an on-chip microfluidic technique, octanol-assisted liposome assembly (OLA), to produce monodispersed, micron-sized, biocompatible liposomes. OLA functions similarly to bubble blowing, where an inner aqueous (IA) phase and a surrounding lipid-carrying 1-octanol phase are pinched off by surfactant-containing outer fluid streams. This readily generates double-emulsion droplets with protruding octanol pockets. As the lipid bilayer assembles at the droplet interface, the pocket spontaneously detaches to give rise to a unilamellar liposome that is ready for further manipulation and experimentation. OLA provides several advantages, such as steady liposome generation (&#62;10 Hz), efficient encapsulation of biomaterials, and monodispersed liposome populations, and requires very small sample volumes (~50 &#181;L), which can be crucial when working with precious biologicals. The study includes details on microfabrication, soft-lithography, and surface passivation, which are needed to establish OLA technology in the lab. A proof-of-principle synthetic biology application is also shown by inducing the formation of biomolecular condensates inside the liposomes via transmembrane proton flux. It is anticipated that this accompanying video protocol will facilitate the readers to establish and troubleshoot OLA in their labs.

The present protocol describes octanol-assisted liposome assembly (OLA), a microfluidic technique to generate biocompatible liposomes. OLA produces monodispersed, micron-sized liposomes with efficient encapsulation, allowing immediate on-chip experimentation. This protocol is anticipated to be particularly suitable for synthetic biology and synthetic cell research.