이 기술은 S 유전자형을 효율적으로 식별하고 감귤류의 자체 비호환성을 정확하게 식별하여 적합한 꽃가루 매개자 나무를 선택하는 데 필요한 정보를 제공할 수 있습니다. 이것은 번식 프로그램에서 적절한 부모 나무를 선택하는 시간 효율적이고 간단하며 신뢰할 수 있는 기술입니다. 이 기술은 간단하고 쉽게 할 수 있으며 처음으로 실험을하려면 인내와 보살핌이 필요합니다.
S 유전자형 동정 및 S 특이적 프라이머 설계에는 더 많은 관심과 주의가 필요합니다. 절차를 시연하는 것은 내 연구실의 석사 대학원생 인 Yu Hu가 될 것입니다. Majia pomelo, Citrus maxima, 꽃을 실험실로 가져가 꽃가루 수집을 시작하십시오.
핀셋을 사용하여 꽃밥을 모아 여과지가 들어있는 페트리 접시에 넣으십시오. 꽃밥이 들어있는 페트리 접시를 섭씨 28도 오븐에 24 시간 동안 넣어 꽃가루 알갱이를 건조시킵니다. 건조 후 색이 변하는 실리카겔이 들어 있는 Micro Centron 밀폐 지퍼백에 꽃가루를 보관합니다.
가방을 닫고 꽃가루 품종의 이름과 보관 날짜를 가방에 표시하십시오. 300 마이크로 리터의 액체 배지를 2 밀리리터 원심 분리기 튜브의 뚜껑에 붓고 수분 브러시를 사용하여 꽃가루를 골고루 뿌립니다. 가습 된 블랙 박스에 꽃가루를 넣고 섭씨 28도에서 12 시간 동안 배양합니다.
배양 후, 1, 000 마이크로 리터 피펫 팁에서 상단 1 밀리미터 팁을 잘라내고 소량의 배양 용액으로 꽃가루를 흡인합니다. 꽃가루를 현미경 슬라이드 중앙에 놓고 커버 슬립으로 덮습니다. 완료되면 10X 대물렌즈를 사용하여 도립 현미경으로 표본을 관찰합니다.
각 반복실험에 대해 거의 동일한 꽃가루 밀도를 사용하여 3개의 독립적인 반복실험을 수행합니다. 수분을 위해 수분 브러시를 사용하여 암술머리가 손상되지 않도록 충분한 양의 생존 가능한 꽃가루를 암술머리 표면에 뿌립니다. 수분된 꽃을 황산염 종이 봉지로 덮고 클립을 사용하여 봉지를 밀봉하여 유전형적으로 구별되는 꽃가루에 의한 수분을 방지합니다.
라벨에 종의 이름과 수분의 수와 시간을 쓰십시오. 수분 된 꽃 근처의 가지에 라벨을 걸어 놓습니다. 수분 후 약 3-4 일 후에 수분 주머니를 제거하고 수분 된 꽃을 지퍼 잠금 가방에 모으십시오.
즉시 꽃에서 꽃잎, 용기 및 난소를 제거하고 스타일에 융합 된 암술머리를 새로 준비된 고정 용액이 들어있는 원심 분리기 튜브에 담그십시오. 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 고정액에 암술머리와 스타일을 배양하십시오. 다음날, 낙인을 씻기 전에 정착액을 버리고 95 % 에탄올로 2-3 번 스타일링하십시오.
그런 다음 스타일에 70% 에탄올 용액을 추가하여 샘플이 용액에 완전히 잠기도록 합니다. 이 단계의 스타일은 섭씨 4도에서 1-2 개월 동안 보관할 수 있습니다. 아닐린 블루 염색의 경우 70 % 에탄올에 저장된 스타일 샘플을 증류수로 3-4 회 세척하십시오.
4몰 수산화나트륨 용액에 담그고 밀봉한 후 섭씨 65도의 수조에서 60분 동안 배양합니다. 이 단계에서 스타일의 색상이 노란색-흰색에서 주황색-빨간색으로 바뀝니다. 다음으로 스타일을 증류수에 담그십시오.
30 분 후 증류수를 버리고 증류수로 스타일을 3-4 회 또는 스타일의 색상이 노란색이 될 때까지 씻으십시오. 그런 다음 샘플이 잠길 때까지 아닐린 블루를 첨가하고 어둠 속에서 12시간 동안 배양합니다. 형광 현미경으로 꽃가루 튜브 성장을 관찰합니다.
평평한 테이블 위에 슬라이드를 놓습니다. 메스를 사용하여 세로축을 따라 스타일을 두 개의 반쪽으로 나눕니다. 스타일의 절반을 유리 슬라이드에 놓고 슬라이드 표면에 폴리에틸렌 글리콜 2-3 방울을 첨가하십시오.
그런 다음 커버 슬립으로 덮으십시오. 완료되면 슬라이드를 현미경 스테이지에 올려 놓고 조리개 위의 10X 대물렌즈를 사용하여 시각화합니다. DAPI 필터를 사용하여 꽃가루 튜브 성장을 관찰하십시오.
각 수분 유형에 대해 5 가지 스타일을 관찰하십시오. Citrus maxima의 꽃가루 생존력과 발아율은 형광 현미경을 사용하여 정량화되었습니다. 호환 가능한 꽃가루는 암술머리 표면에서 성공적으로 발아하여 정상적인 꽃가루 관을 생성했으며, 이는 성장하여 궁극적으로 난소에서 수정으로 이어졌습니다.
대조적으로, 호환되지 않는 꽃가루 튜브는 스타일의 약 2/3를 통해 성장한 다음 성장을 멈췄습니다. 아가로스 겔 전기영동은 S 유전자좌 특이적 프라이머를 사용하여 증폭된 DNA 생성물을 검출하였다. 500 내지 1, 000 염기쌍 사이의 DNA 산물의 증폭을 보여주었다.
상응하는 S 유전자형이 확인되었다. 상이한 감귤류 종에서 21개의 S 일배체형이 이 방법을 사용하여 확인되었습니다. 수분 단계가 중요합니다.
성공적인 수분 만이 꽃가루 튜브의 후속 관찰을 보장 할 수 있습니다. 이 기술은 자기 비호환성 특성을 분석하고 자기 비호환성의 여성 결정 요인을 탐색하고 식별하는 데 사용되었습니다. 이 방법은 자기 비 호환성 연구 및 육종 프로그램에 중요합니다.
또한 과수원에 꽃가루 나무를 선택하는 농업 공동체를 용이하게 할 수 있습니다.
