이 프로토콜은 서로 다른 균주와 효모 종이 서로 짝짓기하는 효율성을 정량화하는 간단한 방법입니다. 제안된 방법은 간단하고 강력하며 효율적입니다. 상기 방법은 효모의 모든 균주로 확장될 수 있다.
이 연구에서 설명된 방법은 효모에서 종분화가 어떻게 발생하는지 이해하는 데 사용할 수 있습니다. 또한, 우리가 설명하는 균주는 유전자 흐름에 대한 실험을 설계하는 데 특히 유용 할 수 있습니다. 이 방법의 강점은 정말 간단하다는 것입니다.
사용되는 특정 균주에 따라 배양 시간과 같은 약간의 조정이 필요할 수 있습니다. 효모 추출물, 펩톤, 포도당 또는 YPD 한천 플레이트에 효모 접종물을 줄무늬로 만들어 냉동 주식에서 반수체 A와 알파를 되살리기 시작합니다. 단일 콜로니를 얻기 위해 섭씨 30도에서 48시간 동안 성장시키십시오.
배양 후, YPD 플레이트 및 5밀리리터의 YPD 배지로부터 단일 콜로니를 접종하고, 섭씨 30도에서 250 RPM 진탕으로 48시간 동안 배양한다. 세포는이 잠복기 후에 성장의 정지 단계에 있습니다. 새로운 YPD 플레이트에서 결합 효율 그리드를 각각 1 x 0.5cm 크기의 세 개의 상자로 나누어진 1 x 1.5cm 직사각형으로 그립니다.
두 가지 짝짓기 유형의 YPD 배양액 5마이크로리터를 가장 왼쪽 및 가장 오른쪽 직사각형에 접종합니다. 이 부피는 각 섹션에서 대략 5 곱하기 10 내지 5번째 반수체 세포에 해당합니다. 섭씨 30도에서 24 시간 동안 플레이트를 배양하십시오.
동일한 수의 효모 세포를 혼합하려면 멸균 이쑤시개를 사용하여 외부 상자에서 발생한 효모 성장의 약 1/3을 제거하고 멸균된 1.5밀리리터 바이알에 20마이크로리터의 물에 제거된 세포를 다시 현탁합니다. 각 반수체에 대해 이것을 따르십시오. 그런 다음 이 현탁액 5마이크로리터를 2밀리리터의 물에 희석하고 600나노미터에서 분광 광도계를 사용하여 광학 밀도를 측정합니다.
광학 밀도 값과 하나의 광학 밀도에서 밀리리터당 세포 수에 따라 신선하고 멸균 된 1.5 밀리리터 바이알에 필요한 양의 반수체를 추가합니다. 피펫을 사용하여 잘 섞는다. 이 현탁액의 최종 부피는 일반적으로 약 6-8 마이크로 리터입니다.
다음으로, 이 현탁액을 중앙 그리드에 접종합니다. 접시를 섭씨 30도에서 7시간 동안 배양하여 반수체가 짝짓기를 할 수 있도록 합니다. 7 시간 배양 후 이쑤시개 또는 피펫 팁을 사용하여 중앙 직사각형에서 세포를 긁어 내고 2 밀리리터의 멸균 수로 희석합니다.
추가 희석을 수행 한 다음 세포 현탁액을 YPD 한천에 뿌려 단일 콜로니를 얻습니다. 도금 후, YPD 플레이트를 섭씨 30도에서 36 내지 48 시간 동안 배양하여 단일 콜로니를 생성한다. 데이터의 통계적 유의성을 보장하기 위해 스크리닝을 위해 각 짝짓기 실험에서 수백 개의 개별 콜로니를 확보해야 합니다.
플레이트에서 이배체 콜로니를 식별하려면 단일 콜로니를 이중 드롭아웃 플레이트에 개별적으로 줄무늬를 만들어 옮기고, 균주가 영양요영양성인 아미노산이 부족합니다. 플레이트를 섭씨 30도에서 48시간 동안 배양하고 짝짓기 효율 nu를 계산합니다. 프로토콜의 견고성으로 인해 SK1AM과 ScAM의 두 균주 간의 결합 효율을 쉽게 구별할 수 있었습니다.
SK1 균주는 매우 높은 효율로 교배된 반면, ScAM 균주는 상대적으로 낮은 효율로 교배되었습니다. 환경에 포도당이 1차 탄소원으로 포함되어 있지 않을 때 ScAM 균주의 짝짓기 효율이 크게 떨어졌으며, 이는 짝짓기가 에너지적으로 비용이 많이 드는 과정이며 대체 탄소원의 성장이 짝짓기 효율을 질적으로 감소시킨다는 것을 나타냅니다. 상이한 시간 기간 동안 짝짓기를 허용했을 때, 처음 4-5시간 동안은 짝짓기가 관찰되지 않았다.
첫 번째 이배체는 4-5 시간 후에 만 나타 났으며, 이는 주어진 환경에서 짝짓기 과정을 완료하는 데 필요한 시간임을 나타냅니다. 그 후, 짝짓기 효율이 급격히 증가했다. 7 시간을 초과하여 짝짓기 효율 계산은 유사 분열 성장이 플레이트에서 시작되었다는 사실에 의해 영향을 받았습니다.
동일한 수의 두 반수체가 혼합되어 있는지 확인합니다. 이것에서 벗어나면 프로토콜의 독립적인 반복이 변형될 수 있습니다. 유전자 흐름이 적응과 종분화에 어떻게 영향을 미치는지는 열린 질문입니다.
영양요구성 마커가 우리 균주의 MAT 유전자좌 옆에 삽입되기 때문에 이것은 이 중요한 질문을 해결하는 데 도움이 됩니다.
