혈액-척수 장벽은 단단히 결합되어 있으며 투과성이 제한되어 있습니다. 이 프로토콜을 통해 연구원은 미세 기포와 집속 초음파를 사용하여 혈액-척수 장벽을 안전하고 일시적으로 열 수 있습니다. 이 기술을 통해 혈액-척수 장벽 개방이 표적 척수 분절에 국한될 수 있습니다.
또한 육안 관찰 또는 형광 현미경을 통해 혼란을 쉽게 확인할 수 있습니다. 이 프로토콜은 종양, 위축 또는 부상 치료를 위해 척수에 대한 유전자 요법 또는 약물의 전달을 개선하는 데 있어 잠재력을 탐구할 수 있습니다. 절차를 시연하는 것은 Meghana Bhimreddy입니다.
제 연구실의 뛰어난 MD 학생으로, 매일 공학과 의학 사이의 격차를 해소하고 있습니다. 먼저, 쥐의 혈액-척수 장벽 또는 BSCB 개구부를 달성하기에 충분한 사양의 집속 초음파 변환기 시스템을 구입하십시오. 3D 프린팅된 프로브 홀더와 워터 콘을 트랜스듀서에 부착합니다.
콘과 변환기 사이에 방수 밀봉이 있는지 확인하십시오. 멸균된 50미크론 두께의 음향적으로 투명한 폴리에스터 멤브레인을 고무 밴드를 사용하여 물콘 바닥에 고정합니다. 입구 및 출구 튜브를 사용하여 탈기 및 탈이온수로 물 콘을 채웁니다.
원뿔 내부의 기포는 변환기와 대상 사이의 음향 결합을 방해할 수 있으므로 피하십시오. 이 단계에서 Mylar 멤브레인은 약간 팽창되어야 합니다. 파동 발생기와 무선 주파수 구동 증폭기가 포함된 구동 장비를 변환기에 연결합니다.
정위 암을 고정판에 고정하고 프로브 홀더를 암에 부착합니다. 마취된 Sprague-Dawley 암컷 쥐의 체중을 기록하고 발가락과 꼬리 꼬집기 테스트를 수행하여 마취를 확인합니다. 가열 패드와 멸균 흡수 패드를 고정판에 놓습니다.
쥐를 흡수 패드에 놓습니다. 눈 연고를 바르고 직장 체온계를 올려 체온을 모니터링합니다. 13번째 흉추의 척추에 부착된 쥐의 마지막 갈비뼈를 촉진합니다.
전기 면도기를 사용하여 마지막 갈비뼈와 목 사이의 등쪽 표면에서 털을 깎습니다. 노출된 피부를 10%요오드포비돈에 적신 거즈로 닦아냅니다. 홍채 가위를 사용하여 정중선을 절개하고 가시돌기와 판판이 노출될 때까지 근막을 절개합니다.
척수가 노출될 때까지 오프셋 뼈 집게와 각진 칼날 홍채 가위로 뼈를 제거합니다. 후궁 절제술에 인접한 가시 돌기를 고정하여 쥐를 고정판에 고정합니다. 그런 다음 클램프를 약간 당겨 척추를 팽팽하게 만듭니다.
후궁 절제술 바로 위에 위치할 때까지 정위 암으로 변환기의 위치를 조정합니다. 레이저 장치를 물방울 바닥에 부착하고 레이저 포인트가 보일 때까지 내립니다. 그런 다음 레이저 포인트가 BSCB 중단의 목표 위치 위에 올 때까지 변환기의 측면 위치를 조정합니다.
레이저 장치를 제거하고 기포가 생기지 않도록 원뿔과 척수 사이의 공간을 가스가 제거된 초음파 젤로 채웁니다. 변환기 전원 출력에서 초음파 처리 매개 변수를 설정합니다. 제조업체의 지침에 따라 마이크로 버블 용액을 준비하십시오.
성공적인 꼬리 정맥 카테터 삽입 가능성을 높이려면 꼬리를 따뜻한 물에 담그고 꼬리 바닥에 지혈대를 놓아 정맥 직경을 확대하십시오. 그런 다음 22게이지 꼬리 정맥 카테터를 삽입하고 0.2ml의 헤파린화 식염수로 세척합니다. 3% Evans Blue Dye 또는 EBD의 킬로그램당 1밀리리터를 카테터에 주입합니다.
그런 다음 0.2mL의 헤파린화 식염수로 카테터를 세척합니다. 쥐의 피부, 눈 또는 등쪽 척추 정맥의 파란색 변화를 확인하여 성공적인 꼬리 정맥 카테터 삽입을 확인합니다. 0.2 밀리리터의 마이크로 버블을 카테터에 주입하고 초음파 처리를 시작하기 전에 헤파린 화 식염수로 세척하십시오.
쥐를 안락사시킨 후 척수를 제거하고 섭씨 4도의 4% 파라포름알데히드에 밤새 담가둡니다. 다음날 파라포름알데히드를 PBS로 교체합니다. BSCB 중단을 시각화하려면 면도날을 사용하여 초음파 처리 위치를 둘러싼 2cm 섹션을 분리하십시오.
마이크로톰을 사용하여 단면을 10미크론 두께의 절편으로 분할하고 헤마톡실린 에오신 염색으로 염색합니다. 형광 현미경 검사의 경우 척수 절편이 포함된 슬라이드를 탈파라핀화하고 장착 매체에 용해된 25마이크로리터의 DAPI로 대조염색합니다. 표백을 방지하기 위해 섭씨 4도에서 어두운 곳에서 10분 동안 절편을 배양합니다.
배양 후 형광 현미경을 사용하여 모든 슬라이드를 이미지화합니다. 광학 현미경을 사용하여 헤마톡실린 및 에오신 염색 슬라이드를 이미지화합니다. 척수 혈관 구조는 후궁 절제술 후 볼 수 있으며 후방 척추 정맥을 보여주며 여러 개의 작은 혈관이 측면으로 방사됩니다.
EBD를 정맥 주사한 후 주변 조직과 척수 혈관이 파랗게 나타났습니다. 초음파 처리 후 표적 위치 위에 파란색 점이 보이는데, 이는 BSCB 중단으로 인해 EBD가 백색 실질로 유출되었음을 나타냅니다. 저강도 집속 초음파 또는 LIFU 초음파로 쥐의 척수를 절제한 결과 척수로 EBD가 명백한 유출을 확인했습니다.
LIFU 처리를 하지 않은 음성 대조군 쥐는 EBD 외피를 나타내지 않았습니다. LIFU 초음파 처리가있는 척수는 초음파 처리를받지 않은 코드보다 EBD 자가 형광의 강도가 훨씬 더 높았습니다. 둘 다에 유사한 강도의 DAPI가 있습니다.
헤마톡실린 및 에오신 분석 결과 초음파 처리 부위에서 신경 손상, 출혈 또는 공동 병변이 발견되지 않았습니다. 외과적 취급 부주의로 인한 손상된 코드의 예와 고출력 초음파 처리가 비교로 표시됩니다. 마이크로 버블 및 LIFU 처리를받은 쥐에서는 운동 점수, 초음파 전, 초음파 처리 후 및 5 일 생존 기간 동안 변화가 관찰되지 않았습니다.
척수 온도의 최소 변화는 초음파 분석 전, 도중 및 후에 관찰되었습니다. 후궁 절제술 중 탯줄의 외과적 손상을 제한하는 것이 중요합니다. 현미경으로 H 및 E 염색 단면을 시각화하면 손상이 발생했는지 알 수 있습니다.
혈액-척수 장벽 파괴 후 집속 초음파를 사용하여 동물에게 항종양제 또는 유전자 요법을 주입할 수 있습니다. 그 결과에 따라 이 기술이 치료제 전달을 개선하고 척수 병리 환경에서 생존을 연장할 수 있는지 여부가 결정됩니다.
