이 작품은 스미스 &amp; 조카 영국 회사에 의해 MDB와 후원으로 Wellcome 신탁 기금 088,419에 의해 지원되었다

1. 매트릭스 리간드와 코팅 표면 <ol><li> 초음파는 개별 음식이나 6 - 잘 플레이트 등 중, 3.5 cm의 우물에서 전지에 적용됩니다. 직접 플라스틱쪽으로 생화학 assays 들면, 코트 리간드. immunofluorescence 들어, 종기 유리 MilliQ 물 및 각 우물의 바닥에 장소 4 coverslips을에 세 번 coverslips. </li><li> 유리 표면 효율적인 리간드 코팅을 보장하기 위해 derivati​​zed이어야합니다. 1 ㎜에서 PBS의 sulpho-M-maleimidobenzoyl-N-hydrosuccinimide 에스테르를 해산. 각도에이 ML을 넣고 실온에서 30 분간 부화. </li><li> PBS로 derivati​​zed 표면에 3 번씩 씻으십시오. </li><li> 코트 중 derivati​​zed 유리 또는 인테 그린의 리간드와 치료 플라스틱. 각도에 +와 MG 2 + 칼슘 2를 포함하는 PBS에 녹아있는 10 UG / ML 인테 ligand9 2 ML을 적용하고 4에서 하룻밤 품어 ° C. </li><li> ° C 13분 동안 85 PBS에 녹아있는 1 % BSA를, 가열하여 BSA를 monoparticulate 준비합니다. 허용식힌 다음 0.45-μm의 필터를 통과합니다. </li><li> 30 분 monoparticulate BSA와 리간드 - 코팅 표면에게 PBS 및 블록과 3 회 씻는다. </li></ol> 2. 세포의 준비 <ol><li> 실험 내내 매트릭스 환경을 제어하려면 단백질 합성은 25 μg / ML cycloheximide 80 % 2 시간 합류 섬유아 세포의 추가에 의해 차단되어야합니다. </li><li> PBS와 cycloheximide - 대우 세포를 씻어 및 0.5 밀리그램 / ML 트립신 / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)를 사용하여 배양 플라스크에서 분리. </li><li> 15 분 500x g에서 원심 분리하여 세포를 수확 단독. </li><li> DMEM/25 밀리미터 HEPES의 Resuspend 세포, 25 μg / ML의 cycloheximide. </li><li> 혈구계를 사용하여 현탁액의 세포 밀도를 세어 105 ML-1로 희석. </li><li> 표면 인테 그린을 복구하기 위해 20 분 동안 37 ° C에서 세포를 품어. </li><li> PBS와 리간드 - 코팅, BSA 차단 우물 3 회 씻어. </li><li> 각도에 세포 현탁액의 씨앗이 ML. </li><li> Allo37에서 2 시간 동안 확산 w 세포 ° C에서 5 % CO 2. </li></ol> 3. 초음파 자극 <ol><li> 37 ° C.에 초음파 에미터 어레이와 결합 젤을 따뜻하게 </li><li> 각 방출로 젤 커플링의 완두콩 크기의 BLOB을 적용합니다. </li><li> 각 방출은 초음파 지표 다이오드 검출기를 사용하여 기능성한지 테스트합니다. </li><li> 에미터 어레이에 우물를 놓습니다. 37로 배열을 반환 ° C, 10 분 동안 평형을 위해 5 % CO 2와 허용 온도. </li><li> 초음파 신호를 전환합니다. </li><li> 초음파 신호 치료 정권을 흉내낸 20 분 후에 비활성화됩니다. 짧은 자극 시간이 필요한 경우, 플레이트는 시간을 가리키는 적절한에서 배열에서 제거됩니다. 모든 경우에있어서 사용은 부정적인 컨트롤로 번호판을 unstimulated. </li></ol> 4. Immunofluorescence에 의한 초점 접착 분석 <ol><li> 초점 유착 형성의 분석은 20 분간 초음파 신호를 적용그리고 구조 ° C에서 5 % CO 2 37 세포를 유지하여 추가로 40 분 동안 개발할 수 있습니다. </li><li> 미디어를 대기음하고 PBS로 200 ML 4 % paraformaldehyde를 적용하여 세포를 고정시킨다. 실온 14 분 동안 품어. </li><li> paraformaldehyde를 기음과 전단 세력의 생성을 피하기 위해 우물의 가장자리 아래로 부드럽게 PBS를 적용, PBS로 세 번 씻어. </li><li> 3.5 ㎝의 잘 후속 immunofluorescent 염색법을위한 24 잘 플레이트 각 coverslip을 전송합니다. </li><li> 24 우물 각 PBS에 0.​​5 ML 0.1 M 글리신을 적용하여 잔류 paraformaldehyde를 끄다. 상온에서 20 분 동안 품어. </li><li> 기음 글리신은하고 PBS로 세 번 씻어. </li><li> 0.5 ML 0.5 % Triton은 PBS의 X-100 (W / V)을 적용하여 세포를 Permeabilise. 실온에서 4 분간 부화. </li><li> 기음 트리톤 X-100하고 PBS로 세 번 씻어. </li><li> 0.5 ML 3퍼센트 (W / V) PBS에 BSA를 적용하여 차단합니다. 4 &amp; D에서 하룻밤 사이에 품어예, C. </li><li> 청바지 vinculin 함유 BSA 블록에 1:400 희석 hVIN-1 항체에 초점 접착력을. 실온에서 한 시간 만이라도 품어. </li><li> PBS로 세 번 씻어. </li><li> 형광단 (DyLight 488) 복합 이차 항체 (1:200 희석)와 BSA 블록에 TRITC-복합 phalloidin (1:200 희석)와 얼룩 actin을 적용합니다. 상온에서 30 분간 부화. </li><li> PBS, 그리고 한 물로 세 번 씻어. </li><li> 골드 mountant을 연장 사용 거꾸로 입장에 유리 슬라이드에 탑재합니다. </li></ol> 5. 풀다운 분석에 의한 Rac1 활성화의 부량 <ol><li> Rac1 활성화의 분석 내용은, 37에서 세포에 20 분간 초음파 신호를 적용 ° C에서 5 % CO 2. 이십분 이상 응답 시간을 평가했을 때 20 분 동안 초음파 신호를 적용한 37에서 세포를 유지 ° C, 5 % 응답 개발할 수 있도록 남은 시간에 대한 CO 2. </li><li> 대기음 매체와 장소 잘얼음의. 이 ML 차가운 PBS와 대기음으로 우물을 씻어. 확인 잔여 PBS는 철저한 흡인 뒤에는 1 분 기울어져 우물을 떠날에 의해 제거됩니다. </li><li> 물론 당 35 μl 용해 완충액 (10 % 글리세롤, 20 밀리미터 Hepes의 산도 7.4, 140 MM NaCl, 1 % NP40, 0.5 %의 나트륨 Deoxycholate, 4 MM EGTA, 4 밀리미터 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 1 × 전체 테아제 억제제)와 함께 얼음 세포를 Lyse. 이 예제에서, 6 우물은 세포 lysate의 210 μl를 생성하는 시점에 따라 사용됩니다. 더 많거나 적게 우물을 사용 할 수 있지만 전체 lysate 볼륨 집계해야 ~ 200 μl를. </li><li> 세포 스크레이퍼로 철저하게 자국이 세포 전체 세포 용해를 보장하고 우물을 떠난은 풀에 lysate 수 있도록 1 분 기울어져. </li><li> 펠렛 세포 잔해는 4 ° C에서 2 분 동안 21,000에서 얼음처럼 차가운 1.5 ML microfuge 튜브 (동일 치료 정권에서 풀링의 lysates) 및 스핀 × g로 lysate 전송합니다. </li><li> 용해 완충액 130 μl, 25 μl 박 - GLUT를 포함하는 1.5-ML microfuge 튜브는 심심풀이로 lysate 180 μl를 전송athione 아가로 오스 비즈 10. 이후 겔 분리를 위해 -20 ° C에서 남아있는 원유 lysate 보관하십시오. </li><li> 4에서 40 분 동안 튜브를 돌려 박-글루타티온 아가로 오스 비즈에 대한 적극적인 Rac1 캡처 ° C. </li><li> 하베스트 아가로 오스 비드는 2000에서 원심 분리하여 conjugates × G를 1 분 4 시에 ° C. </li><li> 워시 비드는 각 세척 후에 2000x G 및 폐기 뜨는에서 원심 분리하여 구슬을 수확, 500 μl 용해 완충액으로 세 번 conjugates. 조심스럽게 200 μl 피펫으로 모든 나머지 용해 세차 버퍼를 제거합니다. </li><li> 5 분 동안 흔들어 열 블록에 85 35 μl SDS-PAGE 로딩 버퍼와 부화 ° C를 추가하여 각 샘플을 Elute. 1 분 21,000 × g에서 원심 분리하여 구슬을 제거합니다. </li><li> SDS-PAGE에 의해 비드 eluate를 해결 Rac1위한 nitrocellulose와 프로브로 전송할 수 있습니다. </li></ol> 6. 대표 결과 이 프로토콜에서는 vinculin - 얼룩의 유도를 설명에드 초점의 adhesions과 초음파에 의한 Rac1 활동. 초점 유착 실험의 경우 기준 위치는 α 5 β 1-인테 그린의 리간드에 확산 섬유아 세포가 두 번째 fibronectin 수용체, syndecan-4 않는 vinculin 함유 adhesions (그림 3A)를 형성하지 않는 것이있다는가 추가로 종사하고 있습니다 수용성 리간드 (그림 3B) 3,4. 그러나 초음파로 자극은 초음파 자극은 fibronectin에 의존 신호 전달 경로 5의 특정 구성 요소에 대해 대체할 수 나타내는 syndecan-4 (그림 3C)의 약혼과 같은 정도로 초점 유착 형성을 유도합니다. 이 프로토콜있는 주요 장애물은 흥분제의 부재에 초점 유착 형성을 제거할 수있다. cycloheximide에 의한 단백질 합성의 억제 불완전 자동 자극에 대한 세포하기에 충분 매트릭스 증착을 허용합니다. 세포의 인구 과잉은 또한 낮은 수준의 초점 유착 formatio을 일으킬 수N과 세포 - 세포 및 세포 - 매트릭스 접점 사이의 누화와 같은 초음파에 가난한 반응은 하나의 자극을 분리하도록 설계된 실험을 복잡하게합니다. 기본적인 분석의 개발로서 우리는 syndecan-4 (그림 4) 부족한 섬유아 세포에 반복적으로 동일한 실험을 보여줍니다. 이 섬유아 세포는 아직 초음파 (그림 4C)에 대응하지만, syndecan-4 리간드 (그림 4B)에 대응하기 위해 실패합니다. / - - Sdc4 이용한 실험 섬유아 세포는 초음파 실제로 특정 fibronectin 수용체에 대한 필요성을 무시할 수 보여줍니다, 그리고 간단한 프로토콜 신호 전달 경로에 대한 추가적인 정보를 얻기 위해 개발된 수있는 방법을 보여줍니다. 생화학 실험을 위해 우리가 초음파 델 Pozo 외 10.에 기술된 방법의 적응이다 풀다운 분석을 사용하여 Rac1의 정품 인증을 일으킬 수 보여줍니다. 활성 Rac1 0, 10, 30 INI 후 60 분 강수초음파 자극 tiation는 기준선 (그림 5)로 돌아오기 전에, 10-30분에서 Rac1 활동 봉우리 그것을 보여준다. vinculin에 대한 원유 lysates를 모래 바닥은 시간 지점 사이의 등가 하중을 보장합니다. 결과는 syndecan-4 3의 참여에 의한 Rac1의 정품 인증과 유사하지만, fibronectin에 의해 활성화보다 약간 더 오래 끈 것입니다. 따라서 8-10 반복 일반적으로 중요한 데이터를 달성해야합니다. Rac1의 정품 인증은 초점 유착 형성에 대한 세포의 헌신에 대한 책임이며, 초기 초점 adhesions는 Rac1 활성화와 동시, 10~30분에서 형성되기 시작합니다. 일단 시작, 그 adhesions는 그림 3과 4에 표시된 대형 유착 plaques으로 성숙 나갈 것입니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/4024/4024fig1.jpg" /> 그림 1. 초음파 파형. 초음파는 간헐적으로 1.5 MHz의 신호를 구성 그 낮은 진폭 (30 MW / cm &lt;로 인해&gt; 2를 한모금, 공간적 평균, 시간적 평균)은 더 가열 효과가 없습니다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/4024/4024fig2.jpg" /> 그림 2. 준비와 초음파 검사와 세포의 자극에 대한 흐름의 도식 표현. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/4024/4024fig3.jpg" /> 그림 3. 섬유아 세포에 초점 유착 형성의 초음파 유도. 섬유아 세포는 syndecan-4-결합 fibronectin의 조각 (B) 또는 초음파 (C)로 자극하기 전에 fibronectin의 인테 바인딩 조각 ()에 확산되었다. 60 분 자극에 따라 세포가 수정되었습니다 vinculin와 actin에 대해 묻다, 그리고 epifluorescence에 의해 몇 군데. 바 = 10 μm의. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/4024/4024fig4.jpg" /> 그림 4. syndecan-4가 부족한 섬유아 세포에 초점 유착 형성의 초음파 유도. <em&gt; Sdc4 - / - 섬유아 세포는 syndecan-4-결합 fibronectin의 조각 (B) 또는 초음파 (C)로 자극하기 전에 fibronectin의 인테 바인딩 조각 ()에 확산되었다. 60 분 자극에 따라 세포가 수정되었습니다 vinculin와 actin에 대해 묻다, 그리고 epifluorescence에 의해 몇 군데. / - - Sdc4 있지만 섬유아 세포는 fibronectin 구별했다, 초음파 아직도 초음파 검사 행렬 수용체 참여를 무시 나타내는 초점 유착 형성을 유도. 바 = 10 μm의. <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/4024/4024fig5.jpg" /> 그림 5. 초음파에 의한 Rac1의 활성화. 세포는 시점에 따라 사용되는 여섯 웰스와 0, 10, 30 및 60 분간 자극했다. Rac1 풀다운 분석 시간 코스부터 샘플에 GTP-Rac1 현재의 금액은 서양 얼룩 (상단 이미지)에 대한 백신 Rac1 항체와 배양에 의한 시각이었다. 밴드 강도 (8-10의 평균 복제)의 부량는 Rac1 증가 드러내ctivity 60 분 (그래프)에서 기준 레벨로 돌아오기 전에 10 30 분에 초음파 신호에서 발생. 오차 막대는 SEM을 대표

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	<li>Bass, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+syndecan-4+hair+trigger+initiates+wound+healing+through+caveolin-+and+RhoG-regulated+integrin+endocytosis.">A syndecan-4 hair trigger initiates wound healing through caveolin- and RhoG-regulated integrin endocytosis.</a> Dev. Cell. 21, 681-693 (2011).</li><li>Echtermeyer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delayed+wound+repair+and+impaired+angiogenesis+in+mice+lacking+syndecan-4.">Delayed wound repair and impaired angiogenesis in mice lacking syndecan-4.</a> J. Clin. Invest. 107, R9-R14 (2001).</li><li>Bass, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Syndecan-4-dependent+Rac1+regulation+determines+directional+migration+in+response+to+the+extracellular+matrix.">Syndecan-4-dependent Rac1 regulation determines directional migration in response to the extracellular matrix.</a> J. Cell Biol. 177, 527-538 (2007).</li><li>Woods, A., Couchman, J. R., Johansson, S., Hook, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesion+and+cytoskeletal+organisation+of+fibroblasts+in+response+to+fibronectin+fragments.">Adhesion and cytoskeletal organisation of fibroblasts in response to fibronectin fragments.</a> Embo. J. 5, 665-670 (1986).</li><li>Mahoney, C. M., Morgan, M. R., Harrison, A., Humphries, M. J., Bass, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+ultrasound+bypasses+canonical+syndecan-4+signaling+to+activate+rac1.">Therapeutic ultrasound bypasses canonical syndecan-4 signaling to activate rac1.</a> J. Biol. Chem. 284, 8898-8909 (2009).</li><li>Claes, L., Willie, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+enhancement+of+bone+regeneration+by+ultrasound.">The enhancement of bone regeneration by ultrasound.</a> Prog. Biophys. Mol. Biol. 93, 384-398 (2007).</li><li>Heckman, J. D., Ryaby, J. P., McCabe, J., Frey, J. J., Kilcoyne, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acceleration+of+tibial+fracture-healing+by+non-invasive,+low-intensity+pulsed+ultrasound.">Acceleration of tibial fracture-healing by non-invasive, low-intensity pulsed ultrasound.</a> J. Bone Joint Surg. Am. 76, 26-34 (1994).</li><li>Kristiansen, T. K., Ryaby, J. P., McCabe, J., Frey, J. J., Roe, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerated+healing+of+distal+radial+fractures+with+the+use+of+specific,+low-intensity+ultrasound.+A+multicenter,+prospective,+randomized,+double-blind,+placebo-controlled+study.">Accelerated healing of distal radial fractures with the use of specific, low-intensity ultrasound. A multicenter, prospective, randomized, double-blind, placebo-controlled study.</a> J. Bone Joint Surg. Am. 79, 961-973 (1997).</li><li>Danen, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+for+the+synergy+site+for+cell+adhesion+to+fibronectin+depends+on+the+activation+state+of+integrin+alpha+5+beta+1.">Requirement for the synergy site for cell adhesion to fibronectin depends on the activation state of integrin alpha 5 beta 1.</a> J. Biol. Chem. 270, 21612-21618 (1995).</li><li>Del Pozo, M. A., Price, L. S., Alderson, N. B., Ren, X. D., Schwartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesion+to+the+extracellular+matrix+regulates+the+coupling+of+the+small+GTPase+Rac+to+its+effector+PAK.">Adhesion to the extracellular matrix regulates the coupling of the small GTPase Rac to its effector PAK.</a> Embo. J. 19, 2008-2014 (2000).</li><li>Makarem, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Competitive+binding+of+vascular+cell+adhesion+molecule-1+and+the+HepII/IIICS+domain+of+fibronectin+to+the+integrin+alpha+4+beta+1.">Competitive binding of vascular cell adhesion molecule-1 and the HepII/IIICS domain of fibronectin to the integrin alpha 4 beta 1.</a> J. Biol. Chem. 269, 4005-4011 (1994).</li></ol>

앤드류 해리슨 스미스 &amp; 조카 영국 제한의 직원입니다.

이 프로토콜에서는 일반적으로 인간의 환자에 적용되는 치료는 세포 기반 실험에 사용할 수하는 방법을 설명합니다. 궁극적인 목적은 치료가 세련 수 있도록 초음파 행동의 분자 메커니즘을 이해하는 것입니다. 이 프로토콜에서는 모델 전지 시스템으로 마우스 배아 섬유아 세포 (MEFs)를 사용하지만, 초음파는 기본 인간 포피의 섬유아 세포 5, mesenchymal 줄기 세포, osteoblasts와 chondrocytes 6에 효과적인 것으로 발견되었습니다. 우리는 예를 생화 학적 분석으로 Rac1 정품 인증을 사용하지만 방법은 똑같이 단백질 인산화 또는 immunoprecipitation에 의한 단백질 단지 형성의 규제를 테스트하는 데 사용할 수 있습니다. immunofluorescent 예를 들어 우리는 초점 유착 형성에 효과 초음파를 보여주지만, 어떤 분자의 재배포는 검사 수 있습니다. 예를 들어, 하나는 prote의 colocalisation, 플라즈마 막에 cytosolic 요인 채용을 테스트할 수인신 매매 vesicles의 기능이나 mitotic 스핀들 조직에 대한 초음파의 효과를 검사합니다. 지금까지 우리는 다른 콜라겐에 대한, 또는 성장 요인의 존재에 초음파 검사가 복잡한 환경에서 세포의 행동에 미치는 영향의 사진을 만들어 테스트할 수있는 세포에 대한 초음파의 효과에 의해, fibronectin 종속적인 경로를 테스트하는 데 국한되어있다 그 이상 밀접하게 관련 생체내 상황은 비슷합니다. 큰 도전은 방출의 존재는 초음파 현재 추가적인 기술적 장애물에서 빛의 경로와 진동을 차단 촬영된 이미지를 사용하여 초음파의 효과를 테스트하는 것입니다. 그러나, 치료 응용 프로그램은 하루에 자극을 불과 20 분 거리가 필요하다는 사실은 자극 버스트 후 셀 동작의 분석을 잘 생산있을 수 있습니다 제안합니다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 (옵션) </td></tr><tr><td> sulpho-M-maleimidobenzoyl-N-hydrosuccinimide 에스테르 </td><td> FisherPerbio </td><td> PN22312 </td><td> 물속에 녹아있는 25 밀리미터 주식은 -20 ° C에 저장될 수 </td></tr><tr><td> 6 - 잘 조직 배양 플레이트 </td><td> 코닝 </td><td> 3516 </td><td> 다른 회사의 플라스틱이 저조한 코트 수 </td></tr><tr><td> 13 밀리미터 유리 coverslip </td><td> 과학 실험실 용품 Ltd.SLS </td><td> MIC3336 </td><td> 다른 기업에서 유리 저조한 코트 수 </td></tr><tr><td> PBS </td><td> 시그마 </td><td> D8537 </td><td></td></tr><tr><td> PBS, CA 2 + MG 2 + </td><td> 시그마 </td><td> D8662 </td><td></td></tr><tr><td> 50K 인테 그린 리간드 (fibronectin 단편) </td><td> 설명 및 사전을 구성9, 11 paration </td><td></td><td> 대체 매트릭스 리간드은 다른 경로를 심문하는 데 사용할 수 </td></tr><tr><td> BSA </td><td> 시그마 </td><td> A3059 </td><td></td></tr><tr><td> Cycloheximide </td><td> 시그마 </td><td> C7698 </td><td> 물에 10mg/ml 재고로 저장될 수 있습니다 </td></tr><tr><td> DMEM/25 MM HEPES </td><td> 시그마 </td><td> D6171 </td><td></td></tr><tr><td> Exogen 4000 + </td><td> 스미스 앤 조카 INC </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 초음파 커플링 젤 </td><td> 스미스 앤 조카 INC </td><td></td><td></td></tr><tr><td> SAFHS 지표 </td><td> 스미스 앤 조카 INC </td><td></td><td></td></tr><tr><td> hVIN-1 </td><td> 시그마 </td><td> V9264 </td><td></td></tr><tr><td> DyLight 488-복합 백신 마우스 </td><td> Stratech 과학 </td><td> 715-485-150 </td><td></td></tr><tr><td> TRITC-라벨 phalloidin &lt;/ TD&gt; <td> 시그마 </td><td> P1951 </td><td></td></tr><tr><td> 골드 antifade 시약을 연장 </td><td> Invitrogen </td><td> P36930 </td><td></td></tr><tr><td> 전체 테아제 억제제 (EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 무료) </td><td> 로슈 </td><td> 056 489 001 </td><td> 타블렛으로 만든 100 × 주가는 -20 ° C에 보관 </td></tr><tr><td> 박 - 글루타티온 아가로 오스 비즈 </td><td> 10 설명 및 준비를 건설 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 글리세린 </td><td> 어부 </td><td> G/0650/17 </td><td></td></tr><tr><td> Hepes </td><td> 아폴로 과학 </td><td> BI8181 </td><td> 7.4로 1M 주식과 산도 만들기 </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 어부 </td><td> S/0160/65 </td><td></td></tr><tr><td> NP40 </td><td> 시그마 </td><td> I3021 </td><td></td></tr><tr><td> 나트륨 Deoxycholate </td><td> 시그마 </td><td> D6750 </td><td></td></tr><tr><td> EGTA </td><td> 시그마 </td><td> E4378 </td><tD&gt; </td></tr><tr><td> EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) </td><td> 시그마 </td><td> E5134 </td><td></td></tr></tbody></table>

induction of adhesion-dependent signals using low-intensity ultrasound

다세포 생물에서는 세포 문제는 세포외 기질과 상호 작용에 의해 결정됩니다. 세포 마이 그 레이션 및 확산 규제에서 분비 심지어 차별화에 매트릭스 - 포용 범위의 결과들. 이러한 복잡한 프로세스 각각의 기본 신호는 세포의 표면에 세포외 기질 수용체의 분자 상호 작용에서 발생합니다. Integrins는 prototypic 수용체이며 기계 세포외 기질과 cytoskeleton 사이의 연결뿐만 아니라 접착 - 종속 신호 폭포의 일부를 시작하고 있습니다. 그러나 추가 transmembrane 수용체가 하류 인테 자체와 신호를 모두 통제하고 integrins 함께 작동하는 점점 명백한지고 있습니다. 이러한 예제의 가장 우아 fibronectin에 부착하는 동안 α 5 β 1-인테 협력 transmembrane의 proteoglycan, syndecan-4입니다. 생체내 모델에서 demonstr가syndecan-4-녹아웃 마우스는 비효율적인 fibroblast 마이 그 레이션 1,2로 인한 치료 지연을 전시로, syndecan-4 신호의 중요성을 먹었어요. 야생 형 동물에 상처 향해 섬유아 세포의 이전이 손상된 모세 혈관의 누출과 부상을 조직의 macrophages에 의해 침전되는 fibronectin의 모양에 의해 트리거됩니다. 따라서 fibronectin 종속 신호를 향상시키고 복구 프로세스를 가속화할 수있는 전략을 발견에 큰 관심이 있습니다. fibronectin 종속 신호의 인테 그린 - 중재와 syndecan-4-매개 구성 요소는 재조합 fibronectin의 파편 자극 세포로 구분 할 수 있습니다. 인테 그린 결합은 세포 부착에 필수이지만, 특정 fibronectin 종속 신호는 syndecan-4에 의해 규제됩니다. Syndecan-4를 활성화 Rac1 밀어내는 신호 3 초점으로 인테 재배포 1 등 vinculin 같은 cytoskeletal 분자의 트리거 모집을 일으키는adhesions 4 및함으로써 방향 마이 그 레이션 3 유도합니다. 우리는 그러한 신호를 활성화하기위한 대안 전략에 대해 검토한 결과, 낮은 강도 펄스 초음파 (LIPUS)는 syndecan-4 교전 5 효과를 흉내내는 것으로 나타났습니다. 이 프로토콜에서는 1 kHz에서 (그림 1)에서 펄스 30 MW / cm 2, 1.5 MHz의 초음파가, Rac1 활성화 및 초점 유착 형성을 유도하기 위해 문화의 섬유아 세포 (그림 2)에 적용할 수있는하는 방법을 설명합니다. 매개 변수의 조합 임상적 골절 수리 6 가속을위한 가장 효과있는 것으로 판명되었습니다로 초음파 자극은 20 분 최대 적용됩니다. 방법은 syndecan-4의 참여없이 α 5 β 1-인테 그린을 참여시키는 재조합 fibronectin 조각을 사용하며 섬유아 세포에 의해 추가로 모체의 증착을 차단하는 cycloheximide에 의한 단백질 합성의 억제가 필요합니다., 긍정적인 효과 O수리 메커니즘의 F에 초음파가 잘 7,8를 문서화하고 있으며, 문화 초음파의 분자 효과를 이해함으로써 우리는 임상 결과를 개선하는 치료 기법을 좁힐 수 있어야합니다.

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Induction of Adhesion-dependent Signals Using Low-intensity Ultrasound

이 프로토콜은 초점 유착 형성과 transmembrane 매트릭스 수용체, syndecan-4의 포용을 흉내낸하여 Rac1 활성화를 몰고 낮은 강도 펄스 초음파와 교양 섬유아 세포의 자극에 대해 설명합니다. 이러한 접근 방식함으로써 치료의 섬세한 기회를 제공하고, 세포 수준에서 성공적인 임상 기술의 조사를 허용합니다.

낮은 강도의 초음파를 사용하여 접착 종속 신호의 유도

In multicellular organisms, cell behavior is dictated by interactions with the extracellular matrix. Consequences of matrix-engagement range from ...

induction-of-adhesion-dependent-signals-using-low-intensity-ultrasound

Research

JoVE Journal

Bioengineering

9.4K 조회수.  University of Bristol. 이 프로토콜은 초점 유착 형성과 transmembrane 매트릭스 수용체, syndecan-4의 포용을 흉내낸하여 Rac1 활성화를 몰고 낮은 강도 펄스 초음파와 교양 섬유아 세포의 자극에 대해 설명합니다. 이러한 접근 방식함으로써 치료의 섬세한 기회를 제공하고, 세포 수준에서 성공적인 임상 기술의 조사를 허용합니다.

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Contrast Ultrasound Targeted Treatment of Gliomas in Mice via Drug-Bearing Nanoparticle Delivery and Microvascular Ablation

We are developing minimally-invasive contrast agent microbubble based therapeutic approaches in which the permeabilization and/or ablation of the microvasculature are controlled by varying ultrasound pulsing parameters.  Specifically, we are testing whether such approaches may be used to treat malignant brain tumors through drug delivery and microvascular ablation.  Preliminary studies have been performed to determine whether targeted drug-bearing nanoparticle delivery can be facilitated by the ultrasound mediated destruction of "composite" delivery agents comprised of 100nm poly(lactide-co-glycolide) (PLAGA) nanoparticles that are adhered to albumin shelled microbubbles. We denote these agents as microbubble-nanoparticle composite agents (MNCAs). When targeted to subcutaneous C6 gliomas with ultrasound, we observed an immediate 4.6-fold increase in nanoparticle delivery in MNCA treated tumors over tumors treated with microbubbles co-administered with nanoparticles and a 8.5 fold increase over non-treated tumors. Furthermore, in many cancer applications, we believe it may be desirable to perform targeted drug delivery in conjunction with ablation of the tumor microcirculation, which will lead to tumor hypoxia and apoptosis. To this end, we have tested the efficacy of non-theramal cavitation-induced microvascular ablation, showing that this approach elicits tumor perfusion reduction, apoptosis, significant growth inhibition, and necrosis. Taken together, these results indicate that our ultrasound-targeted approach has the potential to increase therapeutic efficiency by creating tumor necrosis through microvascular ablation and/or simultaneously enhancing the drug payload in gliomas.

Insonation of microbubbles is a promising strategy for tumor ablation at reduced time-averaged acoustic powers, as well as for the targeted delivery of therapeutics. The purpose of the present study is to develop low duty cycle ultrasound pulsing strategies and nanocarriers to maximize non-thermal microvascular ablation and payload delivery to subcutaneous C6 gliomas.

명암 초음파 마약 베어링 Nanoparticle 배달 및 Microvascular 절제를 통해 마우스에서 Gliomas의 치료 타겟

We are developing minimally-invasive contrast agent microbubble based therapeutic approaches in which the permeabilization and/or ablation of the ...

연구

생체공학

Introduction to the Ultrasound Targeted Microbubble Destruction Technique

In UTMD, bioactive molecules, such as negatively charged plasmid DNA vectors encoding a gene of interest, are added to the cationic shells of lipid microbubble contrast agents7-9. In mice these vector-carrying microbubbles can be administered intravenously or directly to the left ventricle of the heart. In larger animals they can also be infused through an intracoronary catheter. The subsequent delivery from the circulation to a target organ occurs by acoustic cavitation at a resonant frequency of the microbubbles. It seems likely that the mechanical energy generated by the microbubble destruction results in transient pore formation in or between the endothelial cells of the microvasculature of the targeted region10. As a result of this sonoporation effect, the transfection efficiency into and across the endothelial cells is enhanced, and transgene-encoding vectors are deposited into the surrounding tissue. Plasmid DNA remaining in the circulation is rapidly degraded by nucleases in the blood, which further reduces the likelihood of delivery to non-sonicated tissues and leads to highly specific target-organ transfection.

Ultrasound Targeted Microbubble Destruction (UTMD) can be used to direct site-specific delivery of bioactive molecules, including therapeutic genes, to target organs accessible to ultrasound, such as the heart and liver1-6.

초음파 타겟 Microbubble 파괴 기술 소개

In UTMD, bioactive molecules, such as negatively charged plasmid DNA vectors encoding a gene of interest, are added to the cationic shells of lipid ...

Wideband Optical Detector of Ultrasound for Medical Imaging Applications

Optical sensors of ultrasound are a promising alternative to piezoelectric techniques, as has been recently demonstrated in the field of optoacoustic imaging. In medical applications, one of the major limitations of optical sensing technology is its susceptibility to environmental conditions, e.g. changes in pressure and temperature, which may saturate the detection. Additionally, the clinical environment often imposes stringent limits on the size and robustness of the sensor. In this work, the combination of pulse interferometry and fiber-based optical sensing is demonstrated for ultrasound detection. Pulse interferometry enables robust performance of the readout system in the presence of rapid variations in the environmental conditions, whereas the use of all-fiber technology leads to a mechanically flexible sensing element compatible with highly demanding medical applications such as intravascular imaging. In order to achieve a short sensor length, a pi-phase-shifted fiber Bragg grating is used, which acts as a resonator trapping light over an effective length of 350 &#181;m. To enable high bandwidth, the sensor is used for sideway detection of ultrasound, which is highly beneficial in circumferential imaging geometries such as intravascular imaging. An optoacoustic imaging setup is used to determine the response of the sensor for acoustic point sources at different positions.

Optical detection of ultrasound is impractical in many imaging scenarios because it often requires stable environmental conditions. We demonstrate an optical technique for ultrasound sensing in volatile environments with miniaturization and sensitivity levels appropriate for optoacoustic imaging in restrictive scenarios, e.g. intravascular applications.

광대역 의료 이미징 애플리케이션을위한 초음파의 광 검출기

Optical sensors of ultrasound are a promising alternative to piezoelectric techniques, as has been recently demonstrated in the field of optoacoustic ...

Real-time Monitoring of High Intensity Focused Ultrasound (HIFU) Ablation of In Vitro Canine Livers Using Harmonic Motion Imaging for Focused Ultrasound (HMIFU)

Harmonic Motion Imaging for Focused Ultrasound (HMIFU) is a technique that can perform and monitor high-intensity focused ultrasound (HIFU) ablation. An oscillatory motion is generated at the focus of a 93-element and 4.5 MHz center frequency HIFU transducer by applying a 25 Hz amplitude-modulated signal using a function generator. A 64-element and 2.5 MHz imaging transducer with 68kPa peak pressure is confocally placed at the center of the HIFU transducer to acquire the radio-frequency (RF) channel data. In this protocol, real-time monitoring of thermal ablation using HIFU with an acoustic power of 7 W on canine livers in vitro is described. HIFU treatment is applied on the tissue during 2 min and the ablated region is imaged in real-time using diverging or plane wave imaging up to 1,000 frames/second. The matrix of RF channel data is multiplied by a sparse matrix for image reconstruction. The reconstructed field of view is of 90&#176; for diverging wave and 20 mm for plane wave imaging and the data are sampled at 80 MHz. The reconstruction is performed on a Graphical Processing Unit (GPU) in order to image in real-time at a 4.5 display frame rate. 1-D normalized cross-correlation of the reconstructed RF data is used to estimate axial displacements in the focal region. The magnitude of the peak-to-peak displacement at the focal depth decreases during the thermal ablation which denotes stiffening of the tissue due to the formation of a lesion. The displacement signal-to-noise ratio (SNRd) at the focal area for plane wave was 1.4 times higher than for diverging wave showing that plane wave imaging appears to produce better displacement maps quality for HMIFU than diverging wave imaging.

Real-time Monitoring of High Intensity Focused Ultrasound HIFU Ablation of In Vitro Canine Livers Using Harmonic Motion Imaging for Focused Ultrasound HMIFU

This article describes real-time monitoring of HIFU ablation in canine liver with high frame rate ultrasound imaging using diverging and plane wave imaging. Harmonic Motion Imaging for Focused Ultrasound is used to image the decrease of acoustic radiation force induced displacement in the ablated region.

높은 강도의 실시간 모니터링의 초음파 (HIFU) 절제를 집중<em&gt; 체외</em&gt; 집중 초음파에 대한 조화 운동 이미징을 사용하여 개 간을 (HMIFU)

Harmonic Motion Imaging for Focused Ultrasound (HMIFU) is a technique that can perform and monitor high-intensity focused ultrasound (HIFU) ablation. An ...

Transmission of Multiple Signals through an Optical Fiber Using Wavefront Shaping

The transmission of multiple independent optical signals through a multimode fiber is accomplished using wavefront shaping in order to compensate for the light distortion during the propagation within the fiber. Our methodology is based on digital optical phase conjugation employing only a single spatial light modulator, where the optical wavefront is individually modulated at different regions of the modulator, one region per light signal. Digital optical phase conjugation approaches are considered to be faster than other wavefront shaping approaches, where (for example) a complete determination of the wave propagation behavior of the fiber is performed. In contrast, the presented approach is time-efficient since it only requires one calibration per light signal. The proposed method is potentially appropriate for spatial division multiplexing in communications engineering. Further application fields are endoscopic light delivery in biophotonics, especially in optogenetics, where single cells in biological tissue have to be selectively illuminated with high spatial and temporal resolution.

We demonstrate the transmission of multiple independent signals through a multimode fiber using wavefront shaping employing a single spatial light modulator. By modulating the wavefront for each signal individually, spatially separated foci are transmitted. Potential applications are multiplexed data transfer in communications engineering and endoscopic light delivery in biophotonics.

파면 정형을 이용하여 광섬유를 통해 다중 신호 전송

The transmission of multiple independent optical signals through a multimode fiber is accomplished using wavefront shaping in order to compensate for the ...

Manufacturing Abdominal Aorta Hydrogel Tissue-Mimicking Phantoms for Ultrasound Elastography Validation

Ultrasound (US) elastography, or elasticity imaging, is an adjunct imaging technique that utilizes sequential US images of soft tissues to measure the tissue motion and infer or quantify the underlying biomechanical characteristics. For abdominal aortic aneurysms (AAA), biomechanical properties such as changes in the tissue's elastic modulus and estimates of the tissue stress may be essential for assessing the need for the surgical intervention. Abdominal aortic aneurysms US elastography could be a useful tool to monitor AAA progression and identify changes in biomechanical properties characteristic of high-risk patients.
A preliminary goal in the development of an AAA US elastography technique is the validation of the method using a physically relevant model with known material properties. Here we present a process for the production of AAA tissue-mimicking phantoms with physically relevant geometries and spatially modulated material properties. These tissue phantoms aim to mimic the US properties, material modulus, and geometry of the abdominal aortic aneurysms. Tissue phantoms are made using a polyvinyl alcohol cryogel (PVA-c) and molded using 3D printed parts created using computer aided design (CAD) software. The modulus of the phantoms is controlled by altering the concentration of PVA-c and by changing the number of freeze-thaw cycles used to polymerize the cryogel. The AAA phantoms are connected to a hemodynamic pump, designed to deform the phantoms with the physiologic cyclic pressure and flows. Ultra sound image sequences of the deforming phantoms allowed for the spatial calculation of the pressure normalized strain and the identification of mechanical properties of the vessel wall. Representative results of the pressure normalized strain are presented.

Here we describe a method to manufacture aneurysmal, aortic tissue-mimicking phantoms for the use in testing ultrasound elastography. The combined use of computer-aided design (CAD) and 3-dimensional (3D) printing techniques produce aortic phantoms with predictable, complex geometries to validate the elastographic imaging algorithms with controlled experiments.

복 부 대동맥 히드로 조직 흉내 낸 제조 초음파 Elastography 유효성 검사에 대 한 환영

Ultrasound (US) elastography, or elasticity imaging, is an adjunct imaging technique that utilizes sequential US images of soft tissues to measure the ...

Functional Transcranial Doppler Ultrasound for Monitoring Cerebral Blood Flow

Functional transcranial Doppler ultrasound (fTCD) is the use of transcranial Doppler ultrasound (TCD) to study neural activation occurring during stimuli such as physical movement, activation of tactile sensors in the skin, and viewing images. Neural activation is inferred from an increase in the cerebral blood flow velocity (CBFV) supplying the region of the brain involved in processing sensory input. For example, viewing bright light causes increased neural activity in the occipital lobe of the cerebral cortex, leading to increased blood flow in the posterior cerebral artery, which supplies the occipital lobe. In fTCD, changes in CBFV are used to estimate changes in cerebral blood flow (CBF).
With its high temporal resolution measurement of blood flow velocities in the major cerebral arteries, fTCD complements other established functional imaging techniques. The goal of this Methods paper is to give step-by-step instructions for using fTCD to perform a functional imaging experiment. First, the basic steps for identifying the middle cerebral artery (MCA) and optimizing the signal will be described. Next, placement of a fixation device for holding the TCD probe in place during the experiment will be described. Finally, the breath-holding experiment, which is a specific example of a functional imaging experiment using fTCD, will be demonstrated.

Functional transcranial Doppler ultrasound complements other functional imaging modalities, with its high temporal resolution measurement of stimulus-induced changes in cerebral blood flow within the basal cerebral arteries. This Methods paper gives step-by-step instructions for using functional transcranial Doppler ultrasound to perform a functional imaging experiment.&#160;

대뇌 혈류 를 모니터링하기위한 기능성 경두개 도플러 초음파

Functional transcranial Doppler ultrasound (fTCD) is the use of transcranial Doppler ultrasound (TCD) to study neural activation occurring during stimuli ...

Contrast-Enhanced Subharmonic Aided Pressure Estimation (SHAPE) Using Ultrasound Imaging with a Focus on Identifying Portal Hypertension

Noninvasive, accurate measurement of pressures within the human body has long been an important but elusive clinical goal. Contrast agents for ultrasound imaging are gas-filled, encapsulated microbubbles (diameter &#60; 10 &#956;m) that traverse the entire vasculature and enhance signals by up to 30 dB. These microbubbles also produce nonlinear oscillations at frequencies ranging from the subharmonic (half of the transmit frequency) to higher harmonics. The subharmonic amplitude has an inverse linear relationship with the ambient hydrostatic pressure. Here an ultrasound system capable of performing real-time, subharmonic aided pressure estimation (SHAPE) is presented. During ultrasound contrast agent infusion, an algorithm for optimizing acoustic outputs is activated. Following this calibration, subharmonic microbubble signals (i.e., SHAPE) have the highest sensitivity to pressure changes and can be used to noninvasively quantify pressure. The utility of the SHAPE procedure for identifying portal hypertension in the liver is the emphasis here, but the technique has applicability across many clinical scenarios.

Contrast-Enhanced Subharmonic Aided Pressure Estimation SHAPE Using Ultrasound Imaging with a Focus on Identifying Portal Hypertension

A protocol for noninvasively estimating ambient pressures utilizing subharmonic ultrasound imaging of infused contrast microbubbles (following appropriate calibration) is described with examples from human patients with chronic liver disease.

문맥 고혈압 식별에 중점을 둔 초음파 영상을 사용한 조영 강화 저고조파 보조 압력 추정(SHAPE)

Noninvasive, accurate measurement of pressures within the human body has long been an important but elusive clinical goal. Contrast agents for ultrasound ...

Multi-timescale Microscopy Methods for the Characterization of Fluorescently-labeled Microbubbles for Ultrasound-Triggered Drug Release

Microbubble contrast agents hold great promise for drug delivery applications with ultrasound. Encapsulating drugs in nanoparticles reduces systemic toxicity and increases circulation time of the drugs. In a novel approach to microbubble-assisted drug delivery, nanoparticles are incorporated in or on microbubble shells, enabling local and triggered release of the nanoparticle payload with ultrasound. A thorough understanding of the release mechanisms within the vast ultrasound parameter space is crucial for efficient and controlled release. This set of presented protocols is applicable to microbubbles with a shell containing a fluorescent label. Here, the focus is on microbubbles loaded with poly(2-ethyl-butyl cyanoacrylate) polymeric nanoparticles, doped with a modified Nile Red dye. The particles are fixed within a denatured casein shell. The microbubbles are produced by vigorous stirring, forming a dispersion of perfluoropropane gas in the liquid phase containing casein and nanoparticles, after which the microbubble shell self-assembles. A variety of microscopy techniques are needed to characterize the nanoparticle-stabilized microbubbles at all relevant timescales of the nanoparticle release process. Fluorescence of the nanoparticles enables confocal imaging of single microbubbles, revealing the particle distribution within the shell. In vitro ultra-high-speed imaging using bright-field microscopy at 10 million frames per second provides insight into the bubble dynamics in response to ultrasound insonation. Finally, nanoparticle release from the bubble shell is best visualized by means of fluorescence microscopy, performed at 500,000 frames per second. To characterize drug delivery in vivo, the triggered release of nanoparticles within the vasculature and their extravasation beyond the endothelial layer is studied using intravital microscopy in tumors implanted in dorsal skinfold window chambers, over a timescale of several minutes. The combination of these complementary characterization techniques provides unique insight into the behavior of microbubbles and their payload release at a range of time and length scales, both in vitro and in vivo.

The presented protocols can be used to characterize the response of fluorescently-labeled microbubbles designed for ultrasound-triggered drug delivery applications, including their activation mechanisms as well as their bioeffects. This paper covers a range of in vitro and in vivo microscopy techniques performed to capture the relevant length and timescales.

초음파 트리거 약물 방출을 위한 형광 표지 마이크로 버블의 특성화를 위한 다중 시간 척도 현미경 검사법

Microbubble contrast agents hold great promise for drug delivery applications with ultrasound. Encapsulating drugs in nanoparticles reduces systemic ...

In vitro Induction of Human Dental Pulp Stem Cells Toward Pancreatic Lineages

As of 2000, the success of pancreatic islet transplantation using the Edmonton protocol to treat type I diabetes mellitus still faced some obstacles. These include the limited number of cadaveric pancreas donors and the long-term use of immunosuppressants. Mesenchymal stem cells (MSCs) have been considered to be a potential candidate as an alternative source of islet-like cell generation. Our previous reports have successfully illustrated the establishment of induction protocols for differentiating human dental pulp stem cells (hDPSCs) to insulin-producing cells (IPCs). However, the induction efficiency varied greatly. In this paper, we demonstrate the comparison of hDPSCs pancreatic induction efficiency via integrative (microenvironmental and genetic manipulation) and non-integrative (microenvironmental manipulation) induction protocols for delivering hDPSC-derived IPCs (hDPSC-IPCs). The results suggest distinct induction efficiency for both the induction approaches in terms of 3-dimensional colony structure, yield, pancreatic mRNA markers, and functional property upon multi-dosage glucose challenge. These findings will support the future establishment of a clinically applicable IPCs and pancreatic lineage production platform.

In vitro Induction of Human Dental Pulp Stem Cells Toward Pancreatic Lineages

This protocol presents a comparison between two different induction protocols for differentiating human dental pulp stem cells (hDPSCs) toward pancreatic lineages in vitro: the integrative protocol and the non-integrative protocol. The integrative protocol generates more insulin producing cells (IPCs).

시험관 내 췌장 혈통을 향한 인간 치과 펄프 줄기 세포의 유도

As of 2000, the success of pancreatic islet transplantation using the Edmonton protocol to treat type I diabetes mellitus still faced some obstacles. ...