이 연구는 호주 국립 보건 의학 연구위원회 (허가 번호 606658)에서 RLM에게 수여 교부금에 의해 투자되었다.

1. 세포 배양 (이전 BBB 조립에 3-7 일) 1.1. 차 인간의 뇌 미세 혈관 내피 세포 (를 BECs) 를 BECs는 상업적으로 수득 하였다. 세포는 정상적인 인간의 뇌 피질 조직의 디스 파제 해리에 의해 생성 및 통로 (3) (&lt;12 인구 doublings) 냉동 제공되었다. <ol><li> 하층 : 제조 업체의 지침에 따라 &quot;첨부 인자&quot;와 코트 조직 문화 선박. </li><li> 세포의 유지 보수 : 혈청이 포함 된 완전한 매체를 BECs을 유지한다. 완전한 무 혈청 배지에서 실험, 문화를 BECs하십시오. 가습 5 % CO 2에서 세포를 유지, 37 ° C에서 21 % O 2 배양기 참고 : DMEM/F-12 15 mM의 HEPES, 10 % (v / v) 소 태아 혈청 (FCS)으로 보충하면서 특수한 시약에 대한 대안으로, 0.1 % (w / v) 젤라틴 용액 도포 시약으로 사용할 수, 2 밀리미터 L-글루타민, 50 μg/ ㎖ 젠타 마이신, 20 ㎍ / ㎖의 헤파린 및 20 ㎍ / ml의 내피 세포 성장 보충 BEC의 유지 보수를 위해 사용될 수있다. </li><li> 다음 사용을 위해 의도 된 시간 (3-7 일간)에 따라 1:6 1:3 분할 합류를 BECs : 실험에 대한 하위 배양. 3 일마다 유지 보수 매체를 변경합니다. 15 구절를 BECs을 사용합니다. </li></ol> 1.2. SVG 인간 태아 Astroglial 셀 라인 SVG 인간 태아 astroglial 세포 (22)는 원래 복제 결핍 유인원 바이러스 (40)로 형질 전환 된 인간 태아의 두뇌의 차 문화에서 파생되었다. <ol><li> 정비 : 20 % (v / v) FCS (그들의 부모 일차 전지 (22)를 유지하는 데 사용되는 동일한 혈청 백분율) 2 ㎜의 L-글루타민, 50 U / ㎖의 페니실린으로 보충 얼의 균형 염 용액과 최소 필수 배지에서 농경 SVG 세포 50 ㎍ / ml의 스트렙토 마이신. 가습 된 5 % CO 2, 21 % O 2에서 세포를 유지 </37 ° C에서 서브&gt; 인큐베이터 </li><li> 다음 사용을 위해 의도 된 시간 (3-7 일간)에 따라 1:10, 1:5 비율로 분할 합류 SVGs : 실험에 대한 하위 배양. 트립신의 제거로 인해 매체에서 혈청의 높은 내용으로 필요하지 않습니다. 3 일마다 매체를 변경합니다. 최대 20 구절 SVGs를 사용합니다. </li></ol> 2. 인간의 체외 BBB 모델의 조립 및 공동 배양 (0 일) 의견 체외 접촉 BBB 모델은 인간의 수정, 발행 프로토콜 13, 23에 따라 제조된다. 2.1. 삽입의 코팅 <ol><li> 공급 된 24 웰 플레이트의 우물에서 조직 문화 삽입 (폴리 에스테르 다공성 막과 직경 6.5 mm, 3 ㎛의 기공 크기)를 놓습니다. 삽입의 코트 내강면 <s> </s> 밤새 쥐 콜라겐 가습 37 ° C 배양기에서 I (20 ㎍ / cm 2, 132 μg의 50 μL/ ㎖ 콜라겐 밀리 Q 물에 0.02 % 아세트산 I (MQH 2 O)). 잔류 산을 제거하는 MQH 2 O와 (abluminal 및 내강 측면에서 모두)를 한 번 삽입을 씻으십시오. 참고 : 뇌의 모세 혈관의 기저막은 콜라겐을 포함하지 I하지만 주로 라미닌, 콜라겐 IV 형의 아형, nidogens 및 헤파 란 황산 프로테오글리칸 9. 이러한 이유로, 몇몇 연구자들은 콜라겐 IV, 피브로넥틴 (13) 또는 매트 리겔 더 확실한 BBB 모델링 (BD 바이오 사이언 시즈) (16)와 같은 코팅제를 사용한다. </li></ol> 2.2. 밑면 (Abluminal) 막 표면에 파종 SVGs <ol><li> 삽입 전환 부드럽게 다공성 막 탄력있는 실리콘 튜브의 짧은 조각의 테두리에 맞게, 잘 abluminal 표면 위에 기본적으로 새를 만드는 ( &quot;외부 튜브&quot;~ 10mm 길이, 8mm 내경 1.6 mm 벽) (그림 2A). </li><li> 삽입 니의 밑면DS 미디어 누설을 방지하기 위해 밀봉된다. 플라스틱 밀봉 원뿔 일단 밀봉 먼저, (도 2B;; ~ 8mm 길게, 3.2 mm, 내경 1.6 mm의 벽 &quot;의 내부 튜브&quot;라고) 실리콘 튜브로 이루어지는 플러그 (도 2A 및 2B)을 제조 (~ 3mm 긴; 0.2 ㎖의 중합 효소 연쇄 반응 (PCR) 튜브 바닥 절삭에 의해 제조;도 2b 참조).이 원뿔 내부 튜브 내강을 밀봉, 또한 인서트에 타이트한 피팅 가장자리 넓혀 아닙니다. 그것은 막에서 최대 - ~ 1-2mm (그림 2A)에 도달 할 때까지 다음, 멸균 집게를 사용하여 내강 공동 사전 그것으로 실리콘 플러그를 삽입합니다. </li><li> 다음, 200 ㎕의 SVG 유지 보수 매체에서 4 × 10 4 SVG 세포 (종자 자체의 ction의 위 1.2.2) 직접 잘 abluminal 막 표면 위의 실리콘 (그림 2A)로. SVGs가 인큐베이터에서 최소 4 시간 동안 부착 할 수 있습니다. 주 : 무균 두 개의 6 - 웰 플레이트 (다른 것에 반전 한 접시, 그림 2C) 사이에 조립 삽입을 수송 유지하기 위해 절차를 수행하는 동안 여과되지 않은 공기에 노출을 최소화 할 수 있습니다. 실리콘 튜브 및 플러그는 에탄올에 세척하고 나중에 사용하기 위해 멸균된다. 참고 : 사용 플러그 만 막 기공과 인서트 (2.2.2)이 1 μm의보다 큰 크기. 1 μm의 ≤ 공경 막은 거의 누출되지 않고 외부 실리콘 튜브 (2.2.1) 만 피팅이 필요합니다. 또한, 콜라겐 이외의 코팅제는 I (2.1 절 주 참조)도 3 ㎛의 기공을 통해 leakiness를 방지 할 수 있습니다. 경험적으로이 문제를 확인합니다. </li><li> 당신 성상 세포의 부착 상태를 모니터하기 위해, 병렬로 씨앗성상 세포의 세포 현탁액의 표준 96 - 웰 동일한 볼륨. 이 우물은 6.5 mm의 삽입과 같은 표면적 (0.33 cm 2)이며 삽입 막보다 위상차 현미경으로 세포를보다 쉽게 시각화를 허용합니다. 당신이 컨트롤의 성상 세포의 충분한 준수를 관찰하면 96도, 성상 세포가 적절하게 삽입 막에 또한 준수했다. </li><li> 성상 세포는 충분히 96 - 웰 컨트롤에 부착 한 경우, (위의 주 참조) 조직 문화 후드에 삽입 어셈블리를 전송하고 부드럽게 외부 실리콘 튜브 및 플러그를 제거합니다. 800 μL / 잘 BEC 유지 보수 매체 (위의 섹션 1.1.2)을 포함하는 공급 우물에 정상 (즉, 수직) 방향으로 삽입을 반환합니다. </li></ol> 2.3. 성상 위의 내강 상공 회의소에를 BECs의 시드 콜라겐 코팅 내강 표면에 200 μL와 INSE을 반환 씨 2 × 4를 BECs인큐베이터에 RTS. 2.4. 공동 배양 실험 전에 미디어의 변화없이 BEC 매체 3 일 SVG / BEC 시드 삽입 공 배양. 3. 인간 BBB 모델 실험 (3 일) <ol><li> 각각 600 μL 및 혈청를 BECs 매체의 100 μL로 abluminal 및 내강 미디어를 대체하여 체외 BBB 첫 번째 세척 세포를 자극합니다. </li><li> 다시 내강 매체를 대기음 자극 에이전트와 혈청 배지 100 μL로 교체합니다. 참고 : abluminal 챔버의 자극이 (성상 세포 구획에서 체외 BBB를 활성화하기 위해) 필요한 경우, abluminal 매체를 대기음 및 에이전트를 자극으로 혈청 배지의 600 UL로 교체. </li><li> 내강 자극이 3 × 100 μl를 요구하는 수행하는 경우, 따라서 (세중 각 실험 그룹을 테스트, 우리는 다시 희석 권장<html> 우물 사이에 피펫의 오류를 최소화하기 위해 그룹 당 혈청 배지 350 μL)의 최종 농도 에이전트. </li><li> 전술 한 바와 같이 및 / 또는 봉사자 13,16,25 측정 (후자 우리는 형광 이소 티오 시아 네이트 (FITC) - 결합 된 알부민을 사용) 표준 세포층 및 / 또는 표시 추적자 16, 24의 세포 횡단 투과성 분석을 수행합니다. </li></ol> 투자율 (최대의 %) = (: 초기 투자율의 변동을 고려하여 실험 사이 (최대 투자율에 대한 참고가) 세포없이 코팅 된 인서트와 식을 이용하여 차량 투여군 투과성 상대적인 변화를 분석 비히클 군의 평균 투과도 값) X 100 - 차량 기 블랭크 인서트) / (투자율 값의 평균 투과도 값 - 투과성 실험 인서트의 값. 4. 다공성 막에 세포의 시각화 NT &quot;&gt; 코멘트 : 삽입 세포막에 흠 세포는 세포막이 매우 불투명하고 빛의 투과를 방해하기 때문에 위상차 또는 미분 간섭 대비 (DIC) 현미경으로 관찰하기 어려운 우리가 세포의 다양한 염색 절차를 개발 한이 문제를 처리하기 위해. 크게 막에 세포 모양을 향상시킬 수 있습니다. 여전히 우물에서 삽입에 붙어있다. 세포막은 설치 목적을 위해 염색 과정의 끝에서 제거해야합니다 일반적으로 삽입 세포막을 얼룩 삽입. 4.1. 헤 마톡 실린 염색 <ol><li> 20 분, 인산염 완충 생리 식염수 (130 mM의 NaCl을, 10 mM의 나 2 HPO 4, 10 밀리미터의 NaH 2 PO 4, 산도 7.2 PBS)에서 (w / v)의 파라 포름 알데히드 (PFA) 얼음처럼 차가운 4 %에 삽입 고정합니다. PBS에 한 번 씻으십시오. </li><li> 2 분 동안 0.1 % 메이어의 헤 마톡 실린 용액에 삽입 잠수함. </li><li> 조심스럽게 기능을 잠수하여 (수돗물로 삽입을 씻어비커에 들어있는 수돗물에 ERT 부드럽게) 과잉의 물을 피펫. 원하는 블루 색상이 개발 될 때까지 20 초 ~를위한 스콧의 수돗물 솔루션 (2 G / L 탄산 수소 나트륨, 20g / L 망초)에 삽입을 전송합니다. 수돗물 (4.1.3)으로 다시 삽입을 씻으십시오. 옵션 에오신 염색은 수돗물 세척 한 다음 10 초 동안 1 % 에오신 용액에 삽입을 찍기에 의해 여기에 도입 될 수있다. </li><li> 삽입 막을 공기 건조. (막 에지 주위 절단) 메스를 사용하여 멤브레인을 제거하고 시야의 이미징을위한 유리 슬라이드에 마운트 주 : 디-N-butylphthalateinxylene (DPX) 설치 매체가 활용되는 경우가 막을 제거하고 설치하기 전에 크실렌 다음에 100 % 에탄올로 삽입을 씻어. </li></ol> 4.2. 주사 전자 현미경 (SEM) <ol><li> 얼음처럼 차가운 4 %에 삽입 수정 (W / V) 20 분 대한 PBS에 PFA. PBS로 세 번 씻으십시오. </li><li> 30 1 %의 분 (W / V의 세포막을 사후 수정MQH 2 O.에서) 오스뮴 </li><li> 물 (4.1.3)에 삽입을 세척하고 (간격 당 10 분 동안 100 % 에탄올로 3 배 후 50 %, 70 %, 5 분 각 90 %) 점점 더 커지고있는 에탄올 그라데이션에 탈수. </li><li> 에탄올 (1시 2분 다음 2시 1분 5 분) : 헥사 메틸 디 실라 잔 (HMDS)의 혼합물로 탈수 삽입을 처리합니다. </li><li> 5 분, 건조 된 상태에서 자연 건조 및 저장을위한 100 % HMDS로 삽입을 처리합니다. </li><li> (막 가장자리 주위에 절단) 메스를 사용하여 막을 제거합니다. 주사 전자 현미경에 의해 세포막을 검사합니다. </li></ol> 4.3. 면역 형광 <ol><li> (V / W) PBS에 PFA는 20 분 동안, (, 50 MM 트리스 - 염산의 pH 7.6, 154 mM의 염화나트륨, 0.22 μm의 여과 TBS) 트리스 완충 식염수에 한 번 씻어 얼음처럼 차가운 4 %에 삽입 고정합니다. </li><li> 이전 26 설명한대로 삽입 막에 세포의 면역 염색을 수행합니다. </li><li> (막 에지 주위 절단) 메스를 사용하여 멤브레인을 제거하고 AG에 마운트형광 설치 매체와 아가씨 슬라이드. 형광 현미경으로 멤브레인을 검사합니다. </li></ol>

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Med. 9, 1313-1317 (2003).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+hemorrhagic+transformation+after+tissue+plasminogen+activator+reperfusion+therapy+for+ischemic+stroke.">Mechanisms of hemorrhagic transformation after tissue plasminogen activator reperfusion therapy for ischemic stroke.</a> Stroke. 35, 2726-2730 (2004).</li><li>Donnan, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+make+better+use+of+thrombolytic+therapy+in+acute+ischemic+stroke.">How to make better use of thrombolytic therapy in acute ischemic stroke.</a> Nat. Rev. Neurol. 7, 400-409 (2011).</li><li>Acheampong, P., Ford, G. 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Psychiatry. 79, 1093-1099 (2008).</li><li>Garber, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stroke+treatment--light+at+the+end+of+the+tunnel.">Stroke treatment--light at the end of the tunnel.</a> Nat. Biotechnol. 25, 838-840 (2007).</li><li>Liebeskind, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversing+Stroke+in+the+2010s.">Reversing Stroke in the 2010s.</a> Stroke. 40, 3156-3158 (2009).</li><li>Weksler, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-brain+barrier-specific+properties+of+a+human+adult+brain+endothelial+cell+line.">Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line.</a> FASEB J. 19, 1872-1874 (2005).</li><li>Song, L., Pachter, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+murine+brain+microvascular+endothelial+cells+that+maintain+expression+and+cytoskeletal+association+of+tight+junction-associated+proteins.">Culture of murine brain microvascular endothelial cells that maintain expression and cytoskeletal association of tight junction-associated proteins.</a> In Vitro Cell. Dev. Biol. Anim. 39 (2003), 313-320 (2003).</li><li>Steiner, O., Coisne, C., Engelhardt, B., Lyck, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+immortalized+bEnd5+and+primary+mouse+brain+microvascular+endothelial+cells+as+in+vitro+blood-brain+barrier+models+for+the+study+of+T+cell+extravasation.">Comparison of immortalized bEnd5 and primary mouse brain microvascular endothelial cells as in vitro blood-brain barrier models for the study of T cell extravasation.</a> J. Cereb. Blood Flow Metab. 31, 315-327 (2011).</li></ol>

저자가 공개하는 게 없다.

뇌 병변에 의료 연구는 많은 번역 어려움을 겪고있다. 급성 허혈성 뇌졸중의 영역에서, 예를 들어, 동물 모델에서 큰 약속을 보여 많은 약물 클리닉 (38, 39)에 실패했습니다. 실망스러운 결과에 대한 이유는 다양하며 인간의 스트로크 시나리오 및 동물 연구 (21)에서 얻어진 결과의 과장에 임상 테스트 시스템의 부정이 (가) 있습니다. 임상 단계에 임상 연구 결과의 예측을 개선하는 ...

BBB는 말초 혈액 순환과 뇌 지혈 유지에 결정적인 책임 중추 신경계 사이의 특수한 인터페이스이다. 기능적 뇌에 단단하고 역동적 인 게이트웨이를 형성하기 위해 (아래) 몇 가지 세포 및 무 세포 구성 요소에 의해 영향을하는 별개의 뇌 미세 혈관 내피 세포 (를 BECs)를 포함한다. 생리적 조건 하에서 BBB는 뇌에 혈액 세포, 혈장 성분 및 유해 물질, 모든 잠재적 신경 독성의 통과를 제한한다. 병행 BBB 선택적 정확하게 뇌 1,2 환경을 유지하기 위해 뇌와 순환 사이 키 이온 및 영양분 (포도당과 아미노산) 및 대사 노폐물을 교환한다. 최근 몇 년 동안은 BBB의 실패는 신경 퇴행성 염증 관련 질환 (예를 들어, 알츠하이머 질환과 multipl과 같은 만성 뇌 병변의 다양한 발생하는 것을 분명 해지고있다전자는 허혈성 뇌졸중 4와 같은 심각한 상황뿐만 아니라,)는 각각 3 경화증. 뇌 혈관 내피 세포 (를 BECs)의 독특한 BBB 속성은 크게 자신의 대뇌 환경 (5)에 의해 유도, 특히 성상 세포 6,7로됩니다. 다른 이러한 혈관 주위 세포 08 뉴런과 마이크로 글 1,3 세포 유형뿐만 아니라, 기저막 (9),를 BECs을 지원 기능 유닛이 &quot;신경 혈관 유닛&quot;(NVU)를 지칭 함께 형성하는 성장 이해있어 동시에 부부는 공급 모세 혈관 10 신진 대사 요구를 신경. 병적 인 상황에서 BBB의 참여 BBB 관련 연구 11, 12을 지원하기 위해 관내 BBB 모델의 개발에 많은 시도를 기초. 이 모델은 NVU의 원리에 따라 생체 BBB 특성에 가깝게 모방하는 것을 목표로하고 있습니다. 체외 </EM&gt; BBB 모델은 일반적으로 ((주로 소 (13)으로부터, 인간의 14, 쥐 15, 쥐 16, 17, 18 및 돼지 유래) 꽉 접합 형성를 BECs의 단층에 다공성 막에서 배양 함께 지원하는 성상 세포와 의존 광범위 ) 델리 등 2005. (11)에 의해 검토. 성상 세포는 배양액 아무런 가용성 요소 (16)를 통해를 BECs와 통신하여 (막의 상면에 재배)를 BECs 분리 잘 조직 배양의 하단에 비접촉 상태에서 성장 될 수있다. 더 나은 생체 내에서 BBB의 해부학 적 구조를 닮은 고급 모델에서, 성상 세포는 접촉 조건과 직접를 BECs 13,15,17 가까이 (그림 1)에서 멤브레인의 반대편에 배양에 유지됩니다. 이 구성은 설립를 BECs 및 성상 세포 사이에 신체 접촉을 가능하게 할 때 성상 프로젝트다공성 막을 통해 자신의 프로세스. 성상 교세포 최종 피트 작은 기공 크기 (즉, 0.4 μM) (14, 15)을 통과 할 수 있기 때문에 중요한 것은, 발생하는 진정한 담당자의 기공은 직경이 1 ㎛를 ≥해야합니다. 특히, 연락처 BBB 시스템은 자신의 트랜스 내피 전기 저항 (봉사자) 및 각종 추적기 13,17,18의 투과도 값에 대한 비접촉 대응에 우수한 것으로 일부 연구에서 입증됩니다. 미디어 흐름의 또 다른 차원은 최근 뇌 혈관 12, 19의 가까운 시뮬레이션을위한 내피 세포에 전단력을 적용 할 수있는 체외 BBB 모델의 숫자에 추가되었습니다. 접촉 BBB 모델을 생성 할 때 극복하는 한 가지 기술적 장애물은 다공성 멤브레인의 abluminal 표면에 중력에 대하여 성상 교세포의 시드이다. 성상 세포는 단순히의 상단에 미디어의 드롭에 씨앗을 품고 있었다 이전 프로토콜 13,20,, 변환 된 삽입, 수 만 짧은 시드 배 적절한 세포 부착에 대한 불충분 우리의 손에서 발견되었다 (즉, 10 분 13 2 시간 20). 이 기본적인 방법을 사용하여, 긴 성상 세포 부착 기간 (온도, pH 및 습도의 변동을 일으키는) 인큐베이터의 빈번한 개폐함에 인서트의 지속적인 모니터링을 필요로 인한 기공을 통한 매체의 누설에도 요철 세포 시딩하는 경향이있다 특히 1 μm의보다 큰 기공을 사용하는 경우. 여기서, 우리는 접촉 BBB 모델의 준비를위한 일반적인 프로토콜을 설명한다. 우리의 절차는 위에서 언급 한 제한 사항을 해결 반전 삽입에 세포 파종을위한 다른 방법을 포함한다. 방법은 장시간 동안, 평형화 인큐베이터에서 abluminal 막 표면 상 교세포의 교란 부착을 허용한다. 결과적으로, 성상 세포의 균일 한 시드가 장벽 품질을 증가시킨다 달성과 인서트 사이의 기초 투자율 변화를 최소화 할 수 있습니다. 인간 세포의 사용은 인간 관련 연구 21 중요하기 ​​때문에, 우리는 또한이 문서에서 인간의 기본를 BECs의 새로운 조합의 특정 사용을 설명하고 높은 처리량 검사 용량 접촉 인간 BBB 모델의 설립을위한 인간의 성상 세포를 불멸 . 다공성 막에 세포를 보는 것은 다공성 막에 합류하고 세포 형태의 결정에 도움을 줄 수 어렵습니다, 우리는 또한 세부 염색 기술이 될 수 있기 때문에. BBB에 - 급성 허혈성 뇌졸중에 대한 유일한 치료 옵션으로 제공하는 응고 파열 효소 - 마지막으로, 우리는 우리 인간의 BBB 모델은 조직 형 플라스 미노 겐 활성제의 영향 (t-PA)를 조사하는 데에 이용 될 수있는 방법을 예시.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="863">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Attachment Factor</td>
			<td style="width:193px;">Cell-Systems Corporation</td>
			<td style="width:171px;">4Z0-210</td>
			<td style="width:243px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Brain microvascular endothelial cells (BECs), primary, human</td>
			<td style="width:193px;">Cell-Systems Corporation</td>
			<td style="width:171px;">ACBRI 376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Complete medium</td>
			<td style="width:193px;">Cell-Systems Corporation</td>
			<td style="width:171px;">4Z0-500</td>
			<td style="width:243px;">Supplemented with CSC JetFuel</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Complete serum-free medium</td>
			<td style="width:193px;">Cell-Systems Corporation</td>
			<td style="width:171px;">SF-4Z0-500</td>
			<td style="width:243px;">Supplemented with CSC RocketFue</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">DMEM/F-12 with 15 mM HEPES</td>
			<td style="width:193px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:171px;">11330-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Endothelial cells growth supplement (from bovine origin)</td>
			<td style="width:193px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:171px;">E2759-15MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">External silicone tubing</td>
			<td style="width:193px;">Watson-Marlow</td>
			<td style="width:171px;">913.A080.016</td>
			<td style="width:243px;">Pumpsil brand, 8 mm internal diameter, 1.6 mm wall</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Foetal calf serum</td>
			<td style="width:193px;">Lonza</td>
			<td style="width:171px;">14-501F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Gentamycin sulfate</td>
			<td style="width:193px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:171px;">15750-060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Heparin sodium</td>
			<td style="width:193px;">Pfizer</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:243px;">1,000 U/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Hexamethyldisilazane (HMDS)</td>
			<td style="width:193px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:171px;">H4875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Human brain microvascular endothelial cells</td>
			<td style="width:193px;">Cell-Systems Corporation</td>
			<td style="width:171px;">ACBRI 376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Internal silicone tubing</td>
			<td style="width:193px;">Watson-Marlow</td>
			<td style="width:171px;">913.A032.016</td>
			<td style="width:243px;">Pumpsil brand, 3.2 mm internal diameter, 1.6 mm wall</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:193px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:171px;">25030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Mayer&#8217;s hematoxylin solution</td>
			<td style="width:193px;">Amber Scientific</td>
			<td style="width:171px;">MH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Minimum essential medium with Earle&#8217;s balanced salt solution</td>
			<td style="width:193px;">HyClone Laboratories</td>
			<td style="width:171px;">SH30244.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:193px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:171px;">15140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Rat collagen I</td>
			<td style="width:193px;">Trevigen</td>
			<td style="width:171px;">3440-100-01</td>
			<td style="width:243px;">Cultrex brand</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:257px;">Tissue culture inserts</td>
			<td style="width:193px;">Corning Life Sciences</td>
			<td style="width:171px;">3472</td>
			<td style="width:243px;">Transwell brand, 6.5 mm in diameter, with polyester porous membrane, 3 &#181;m pore-size</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

improved method for the preparation of a human cell-based, contact model of the blood-brain barrier

혈액 - 뇌 장벽 (BBB)​​은 밀접 뇌 환경을 제어하지만, 불 투과성 적응할 뇌 모세관을 포함한다. BBB의 실패는 임상 관련 연구를 지원하기 위해 체외 BBB 모델에서 인간의 개발에 대한 필요성을 만들고, 많은 뇌 병변의 원인에 함축되어 있습니다. 지금까지 설명한 여러 BBB 모델 중, (흐름)없이 정적, 성상 세포 및 뇌 혈관 내피 세포 (를 BECs가) 다공성 막의 양측에 동시 배양하는 BBB 모델을 문의 시뮬레이션 단순화 아직 확실한 시스템으로 부상 높은 처리량 검사 능력 BBB. 그럼에도 불구하고 이러한 모델의 생성은 몇 가지 기술적 과제를 제시한다. 여기서 우리는 인간의 기본를 BECs 및 불후의 인간의 성상 세포의 새로운 조합을 이용하여 연락처 인간 BBB 모델의 준비를 위해 프로토콜을 설명합니다. 특히, 세부 반전 삽입에 세포 파종을위한 혁신적인 방법뿐만 아니라이 inser를 지정T 염색 기술과 우리가 BBB 관련 연구에 대한 우리의 모델을 사용하는 방법을 예시.

우리는 내피 세포 14,15,27,28과 접촉 성상 세포의 최종 피트의 통과를 허용하는 것으로 3 ㎛의 기공 크기, 다공성 막에 SVGs과를 BECs을 연마했다 인간, 연락처 BBB 모델을 수립하기 위해. 전체 연락처 모델의 개략도는 그림 1 (그림 왼쪽)에 설명되어 있습니다. 연락처 시스템에 의해 제공되는 주요 기술적 과제는 멤브레인의 abluminal 표면의 중력에 성상을 시드 할 필요가있다. 우리는...

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Improved Method for the Preparation of a Human Cell-based, Contact Model of the Blood-Brain Barrier

혈액 - 뇌 장벽 (BBB)​​의 인체 모델의 확립 BBB 장애와 관련된 뇌 상태에 대한 연구를 혜택을 누릴 수 있습니다. 우리는 여기서, 다공질 막의 양측에 인간 성상 세포와 뇌 내피 세포의 공동 배양을 허용 접촉 BBB 모델의 제조를위한 개선 된 기술을 설명한다.

방법 혈액 - 뇌 장벽의 인간 세포 기반의 연락 모델의 준비를 위해 개선

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has ...

improved-method-for-preparation-human-cell-based-contact-model-blood

Research

JoVE Journal

Bioengineering

16.2K 조회수.  Monash University.  혈액 - 뇌 장벽 (BBB)​​의 인체 모델의 확립 BBB 장애와 관련된 뇌 상태에 대한 연구를 혜택을 누릴 수 있습니다. 우리는 여기서, 다공질 막의 양측에 인간 성상 세포와 뇌 내피 세포의 공동 배양을 허용 접촉 BBB 모델의 제조를위한 개선 된 기술을 설명한다. 

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Constant Pressure-controlled Extrusion Method for the Preparation of Nano-sized Lipid Vesicles

Liposomes are artificially prepared vesicles consisting of natural and synthetic phospholipids that are widely used as a cell membrane mimicking platform to study protein-protein and protein-lipid interactions3, monitor drug delivery4,5, and encapsulation4. Phospholipids naturally create curved lipid bilayers, distinguishing itself from a micelle.6 Liposomes are traditionally classified by size and number of bilayers, i.e. large unilamellar vesicles (LUVs), small unilamellar vesicles (SUVs) and multilamellar vesicles (MLVs)7. In particular, the preparation of homogeneous liposomes of various sizes is important for studying membrane curvature that plays a vital role in cell signaling, endo- and exocytosis, membrane fusion, and protein trafficking8. Several groups analyze how proteins are used to modulate processes that involve membrane curvature and thus prepare liposomes of diameters &lt;100 - 400 nm to study their behavior on cell functions3. Others focus on liposome-drug encapsulation, studying liposomes as vehicles to carry and deliver a drug of interest9. Drug encapsulation can be achieved as reported during liposome formation9. Our extrusion step should not affect the encapsulated drug for two reasons, i.e. (1) drug encapsulation should be achieved prior to this step and (2) liposomes should retain their natural biophysical stability, securely carrying the drug in the aqueous core. These research goals further suggest the need for an optimized method to design stable sub-micron lipid vesicles.
Nonetheless, the current liposome preparation technologies (sonication10, freeze-and-thaw10, sedimentation) do not allow preparation of liposomes with highly curved surface (i.e. diameter &lt;100 nm) with high consistency and efficiency10,5, which limits the biophysical studies of an emerging field of membrane curvature sensing. Herein, we present a robust preparation method for a variety of biologically relevant liposomes.
Manual extrusion using gas-tight syringes and polycarbonate membranes10,5 is a common practice but heterogeneity is often observed when using pore sizes &lt;100 nm due to due to variability of manual pressure applied. We employed a constant pressure-controlled extrusion apparatus to prepare synthetic liposomes whose diameters range between 30 and 400 nm. Dynamic light scattering (DLS)10, electron microscopy11 and nanoparticle tracking analysis (NTA)12 were used to quantify the liposome sizes as described in our protocol, with commercial polystyrene (PS) beads used as a calibration standard. A near linear correlation was observed between the employed pore sizes and the experimentally determined liposomes, indicating high fidelity of our pressure-controlled liposome preparation method. Further, we have shown that this lipid vesicle preparation method is generally applicable, independent of various liposome sizes. Lastly, we have also demonstrated in a time course study that these prepared liposomes were stable for up to 16 hours. A representative nano-sized liposome preparation protocol is demonstrated below.

This protocol describes an extrusion method for preparing lipid vesicles of sub-micron sizes with a high degree of homogeneity. This method uses a pressure-controlled system with controlled nitrogen flow rates for liposome preparation. The lipid preparation1,2, liposome extrusion, and size characterization will be presented herein.

나노 크기의 지질 Vesicles의 준비를 위해 지속적인 압력 제어 압출 방법

Liposomes are artificially prepared vesicles consisting of natural and synthetic phospholipids that are widely used as a cell membrane mimicking platform ...

연구

생체공학

An Improved Method for the Preparation of Type I Collagen From Skin

Soluble type 1 collagen (COL1) is used extensively as an adhesive substrate for cell cultures and as a cellular scaffold for regenerative applications. Clinically, this protein is widely used for cosmetic surgery, dermal injections, bone grafting, and reconstructive surgery. The sources of COL1 for these procedures are commonly nonhuman, which increases the potential for inflammation and rejection as well as xenobiotic disease transmission. In view of this, a method to efficiently and quickly purify COL1 from limited quantities of autologously-derived tissues would circumvent many of these issues; however, standard isolation protocols are lengthy and often require large quantities of collagenous tissues. Here, we demonstrate an efficient COL1 extraction method that reduces the time needed to isolate and purify this protein from about 10 days to less than 3 hr. We chose the dermis as our tissue source because of its availability during many surgical procedures. This method uses traditional extraction buffers combined with forceful agitation and centrifugal filtration to obtain highly-pure, soluble COL1 from small amounts of corium. Briefly, dermal biopsies are washed thoroughly in ice-cold dH2O after removing fat, connective tissue, and hair. The skin samples are stripped of noncollagenous proteins and polysaccharides using 0.5 M sodium acetate and a high speed bench-top homogenizer. Collagen from residual solids is subsequently extracted with a 0.075 M sodium citrate buffer using the homogenizer. These extracts are purified using 100,000 MW cut-off centrifugal filters that yield COL1 preparations of comparable or superior quality to commercial products or those obtained using traditional procedures. We anticipate this method will facilitate the utilization of autologously-derived COL1 for a multitude of research and clinical applications.

Traditional procedures for the isolation of soluble type 1 collagen (COL1) require about 10 days from start to finish because of lengthy buffer incubations and laborious resuspensions of fibrils. Here, we describe a means to purify COL1 from small dermal biopsies in less than 3 hr.

피부에서 타입 I 콜라겐의 제조를위한 개선 된 방법

Soluble type 1 collagen (COL1) is used extensively as an adhesive substrate for cell cultures and as a cellular scaffold for regenerative applications. ...

Development of a Multicellular Three-dimensional Organotypic Model of the Human Intestinal Mucosa Grown Under Microgravity

Because cells growing in a three-dimensional (3-D) environment have the potential to bridge many gaps of cell cultivation in 2-D environments (e.g., flasks or dishes). In fact, it is widely recognized that cells grown in flasks or dishes tend to de-differentiate and lose specialized features of the tissues from which they were derived. Currently, there are mainly two types of 3-D culture systems where the cells are seeded into scaffolds mimicking the native extracellular matrix (ECM): (a) static models and (b) models using bioreactors. The first breakthrough was the static 3-D models. 3-D models using bioreactors such as the rotating-wall-vessel (RWV) bioreactors are a more recent development. The original concept of the RWV bioreactors was developed at NASA&#39;s Johnson Space Center in the early 1990s and is believed to overcome the limitations of static models such as the development of hypoxic, necrotic cores. The RWV bioreactors might circumvent this problem by providing fluid dynamics that allow the efficient diffusion of nutrients and oxygen. These bioreactors consist of a rotator base that serves to support and rotate two different formats of culture vessels that differ by their aeration source type: (1) Slow Turning Lateral Vessels (STLVs) with a co-axial oxygenator in the center, or (2) High Aspect Ratio Vessels (HARVs) with oxygenation via a flat, silicone rubber gas transfer membrane. These vessels allow efficient gas transfer while avoiding bubble formation and consequent turbulence. These conditions result in laminar flow and minimal shear force that models reduced gravity (microgravity) inside the culture vessel. Here we describe the development of a multicellular 3-D organotypic model of the human intestinal mucosa composed of an intestinal epithelial cell line and primary human lymphocytes, endothelial cells and fibroblasts cultured under microgravity provided by the RWV bioreactor.

Cells growing in a three-dimensional (3-D) environment represent a marked improvement over cell cultivation in 2-D environments (e.g., flasks or dishes). Here we describe the development of a multicellular 3-D organotypic model of the human intestinal mucosa cultured under microgravity provided by rotating-wall-vessel (RWV) bioreactors.

인간의 장 점막의 다세포 3 차원의 Organotypic 모델의 개발은 미세 중력 하에서 성장

Because cells growing in a three-dimensional (3-D) environment have the potential to bridge many gaps of cell cultivation in 2-D environments (e.g., ...

In Vitro Permeation of FITC-loaded Ferritins Across a Rat Blood-brain Barrier: a Model to Study the Delivery of Nanoformulated Molecules

Brain microvascular endothelial cells, supported by pericytes and astrocytes endfeet, are responsible for the low permeation of large hydrosoluble drugs through the blood-brain barrier (BBB), causing difficulties for effective pharmacological therapies. In recent years, different strategies for promoting brain targeting have aimed to improve drug delivery and activity at this site, including innovative nanosystems for drug delivery across the BBB. In this context, an in vitro approach based on a simplified cellular model of the BBB provides a useful tool to investigate the effect of nanoformulations on the trans-BBB permeation of molecules. This study describes the development of a double-layer BBB, consisting of co-cultured commercially available primary rat brain microvascular endothelial cells and astrocytes. A multiparametric approach for the validation of the model, based on the measurement of the transendothelial electrical resistance and the apparent permeability of a high molecular weight dextran, is also described. As proof of concept for the employment of this BBB model to study the effect of different nanoformulations on the translocation of fluorescent molecules across the barrier, we describe the use of fluorescein isothiocyanate (FITC), loaded into ferritin nanoparticles. The ability of ferritins to improve the trans-BBB permeation of FITC was demonstrated by flux measurements and confocal microscopy analyses. The results suggest this is a useful system for validating nanosystems for delivery of drugs across the BBB.

In Vitro Permeation of FITC-loaded Ferritins Across a Rat Blood-brain Barrier: a Model to Study the Delivery of Nanoformulated Molecules

A method to establish an in vitro model of blood-brain barrier based on a co-culture of rat brain microvascular endothelial cells and astrocytes is described and validated. This system proved to be a valid tool to study the effect of nanoformulation on the trans-barrier permeation of fluorescent molecules.

쥐 뇌 혈관 벽의 맞은 편에 FITC로드 Ferritins의 생체 외 투과 년 : 모델 Nanoformulated 분자의 배달을 공부하기

Brain microvascular endothelial cells, supported by pericytes and astrocytes endfeet, are responsible for the low permeation of large hydrosoluble drugs ...

Lucifer Yellow - A Robust Paracellular Permeability Marker in a Cell Model of the Human Blood-brain Barrier

The blood-brain barrier BBB consists of endothelial cells that form a barrier between the systemic circulation and the brain to prevent the exchange of non-essential ions and toxic substances. Tight junctions (TJ) effectively seal the paracellular space in the monolayers resulting in an intact barrier. This study describes a LY-based fluorescence assay that can be used to determine its apparent permeability coefficient (Papp) and in turn can be used to determine the kinetics of the formation of confluent monolayers and the resulting tight junction barrier integrity in hCMEC/D3 monolayers. We further demonstrate an additional utility of this assay to determine TJ functional integrity in transfected cells. Our data from the LY Papp assay shows that the hCMEC/D3 cells seeded in a transwell setup effectively limit LY paracellular transport 7 days-post culture. As an additional utility of the presented assay, we also demonstrate that the DNA nanoparticle transfection does not alter LY paracellular transport in hCMEC/D3 monolayers.

We present a fluorescence assay to demonstrate that Lucifer Yellow (LY) is a robust marker to determine the apparent paracellular permeability of hCMEC/D3 cell monolayers, an in vitro model of the human blood-brain barrier. We used this assay to determine the kinetics of a confluent monolayer formation in cultured hCMEC/D3 cells.

루시퍼 옐로우 - 인간 혈액-뇌 장벽의 세포 모델에서 강력한 파라셀룰러 투과성 마커

The blood-brain barrier BBB consists of endothelial cells that form a barrier between the systemic circulation and the brain to prevent the exchange of ...

Simultaneous Quantification of Selected Kynurenines Analyzed by Liquid Chromatography-Mass Spectrometry in Medium Collected from Cancer Cell Cultures

The kynurenine pathway and the tryptophan catabolites called kynurenines have received increased attention for their involvement in immune regulation and cancer biology. An in vitro cell culture assay is often used to learn about the contribution of different tryptophan catabolites in a disease mechanism and for testing therapeutic strategies. Cell culture medium that is rich in secreted metabolites and signaling molecules reflects the status of tryptophan metabolism and other cellular events. New protocols for the reliable quantification of multiple kynurenines in the complex cell culture medium are desired to allow for a reliable and quick analysis of multiple samples. This can be accomplished with liquid chromatography coupled with mass spectrometry. This powerful technique is employed in many clinical and research laboratories for the quantification of metabolites and can be used for measuring kynurenines.
Presented here is the use of liquid chromatography coupled with single quadrupole mass spectrometry (LC-SQ) for the simultaneous determination of four kynurenines, i.e., kynurenine, 3-hydroxykynurenine, 3-hydroxyanthranilic, and xanthurenic acid in the medium collected from in vitro cultured cancer cells. SQ detector is simple to use and less expensive compared to other mass spectrometers. In the SQ-MS analysis, multiple ions from the sample are generated and separated according to their specific mass-to-charge ratio (m/z), followed by the detection using a Single Ion Monitoring (SIM) mode.
This paper draws the attention on the advantages of the reported method and indicates some weak points. It is focused on critical elements of LC-SQ analysis including sample preparation along with chromatography and mass spectrometry analysis. The quality control, method calibration conditions and matrix effect issues are also discussed. We described a simple application of 3-nitrotyrosine as one analog standard for all target analytes. As confirmed by experiments with human ovary and breast cancer cells, the proposed LC-SQ method&#160;generates reliable results and can be further applied to other in vitro cellular models.

Described here is a protocol for the determination of four different tryptophan metabolites generated in the kynurenine pathway (kynurenine, 3-hydroxykynurenine, xanthurenic acid, 3-hydroxyanthranilic acid) in the medium collected from cancer cell cultures analyzed by liquid chromatography coupled with a single quadrupole mass spectrometry.

암 세포 배양에서 수집된 매체에서 액체 크로마토그래피 질량 분광법에 의해 분석된 선택된 Kynurenines의 동시 정량화

The kynurenine pathway and the tryptophan catabolites called kynurenines have received increased attention for their involvement in immune regulation and ...

Transplantation of a 3D Bioprinted Patch in a Murine Model of Myocardial Infarction

Testing regenerative properties of 3D bioprinted cardiac patches in vivo using murine models of heart failure via permanent left anterior descending (LAD) ligation is a challenging procedure and has a high mortality rate due to its nature. We developed a method to consistently transplant bioprinted patches of cells and hydrogels onto the epicardium of an infarcted mouse heart to test their regenerative properties in a robust and feasible way. First, a deeply anesthetized mouse is carefully intubated and ventilated. Following left lateral thoracotomy (surgical opening of the chest), the exposed LAD is permanently ligated and the bioprinted patch transplanted onto the epicardium. The mouse quickly recovers from the procedure after chest closure. The advantages of this robust and quick approach include a predicted 28-day mortality rate of up to 30% (lower than the 44% reported by other studies using a similar model of permanent LAD ligation in mice). Moreover, the approach described in this protocol is versatile and could be adapted to test bioprinted patches using different cell types or hydrogels where high numbers of animals are needed to optimally power studies. Overall, we present this as an advantageous approach which may change preclinical testing in future studies for the field of cardiac regeneration and tissue engineering.

This protocol aims to transplant a 3D bioprinted patch onto the epicardium of infarcted mice modeling heart failure. It includes details regarding anesthesia, the surgical chest opening, permanent ligation of the left anterior descending (LAD) coronary artery and application of a bioprinted patch onto the infarcted area of the heart.

심근 경색의 뮤린 모델에서 3D 생체 인쇄 패치의 이식

Testing regenerative properties of 3D bioprinted cardiac patches in vivo using murine models of heart failure via permanent left anterior descending (LAD) ...

조직 손상을 줄이기 위한 새로운 최소 침습 느린 주입 방법

A Novel Cell Injection Method with Minimum Invasion

Directly injecting cells into tissues is a necessary process in cell administration and/or replacement therapy. The cell injection requires a sufficient amount of suspension solution to allow the cells to enter the tissue. The volume of the suspension solution affects the tissue, and this can cause major invasive injury as a result of the cell injection. This paper reports on a novel cell injection method, called slow injection, that aims to avoid this injury. However, pushing out the cells from the needle tip requires a sufficiently high injection speed according to Newton's law of shear force. To solve the above contradiction, a non-Newtonian fluid, such as gelatin solution, was used as the cell suspension solution in this work. Gelatins solution have temperature sensitivity, as their form changes from gel to sol at approximately 20 &#176;C. Therefore, to maintain the cell suspension solution in the gel form, the syringe was kept cooled in this protocol; however, once the solution was injected into the body, the body temperature converted it to a sol. The interstitial tissue fluid flow can absorb excess solution. In this work, the slow injection technique allowed cardiomyocyte balls to enter the host myocardium and engraft without surrounding fibrosis. This study employed a slow injection method to inject purified and ball-formed neonatal rat cardiomyocytes into a remote area of myocardial infarction in the adult rat heart. At 2 months following the injection, the hearts of the transplanted groups showed significantly improved contractile function. Furthermore, histological analyses of the slow-injected hearts revealed seamless connections between the host and graft cardiomyocytes via intercalated disks containing gap junction connections. This method could contribute to next-generation cell therapies, particularly in cardiac regenerative medicine.

저자 스포트라이트: 최소 침습을 위한 새로운 세포 주입 방법  

This method eliminates any major invasion during cell injections caused by the cell suspension solution.

침습을 최소화하는 새로운 세포 주입 방법

Directly injecting cells into tissues is a necessary process in cell administration and/or replacement therapy. The cell injection requires a sufficient ...