이 프로토콜은 종양 미토콘드리아 기능을 측정하기 위한 간단하고 신속한 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 임상 번역 종양학에 광범위하게 적용되며 암의 발병 및 진행에서 미토콘드리아의 역할에 대한 진단 및 기계론적 해석을 향상시키는 데 도움이 될 것입니다. 이 기술의 주요 장점은 조직을 균질화하여 제조를 단순화하고 확산의 한계를 완화하면서 미토콘드리아의 수율을 최대화하는 것입니다.
이 기술은 새로 생검 또는 절제된 종양 조직을 사용하여 종양 미토콘드리아 기능의 정량적 평가와 임상 및 진단 설정에 있는 잠재적인 응용을 제공합니다. 먼저 미토콘드리아 호흡 배지 또는 MiR05의 1밀리리터를 함유한 유리 균질화제를 젖은 얼음 위에 단단히 끼우는 유리 봉제에 넣습니다. 생검 보존 용액 또는 생검의 1 밀리리터에 조직을 얼음 차가운 페트리 접시에 놓습니다.
종양을 각각 약 5~10밀리그램의 작은 조각으로 자르고 남은 종양 조각을 얼음 위에 보관한 10밀리리터에 다시 넣습니다. 필터 용지에 티슈 섹션을 조심스럽게 얼룩진 후, 작은 플라스틱 타르 계량 보트에 놓고 초기 젖은 무게를 기록하십시오. 사용하지 않은 조각을 BIOPS의 10 밀리리터 원추형 튜브에 다시 배치하여 지속적인 보존을 위해 하십시오.
조직 섹션을 MiR05가 함유된 얼음 냉균질제에 잠급니다. 0.09 ~ 0.16 밀리미터의 클리어런스 범위의 유리 유봉을 사용하여 5 ~ 7 개의 위아래로 스트로크를 완료하여 종양 조직을 부드럽게 방해합니다. 각 스트로크에 대해 유봉을 시계 방향으로/반시계 방향으로 세 번 회전시키면서 유봉을 아래로 밀고 유봉을 다시 당기면서 세 번 더 회전합니다.
조직이 뇌졸중 사이에 균질화의 바닥에 정착할 수 있도록 허용하지만 발포를 방지하기 위해 유체 부피 위에 유봉을 완전히 가져 오는 것을 피하십시오. 15밀리리터 원컬 튜브에 동형어를 붓고 얼음 위에 놓습니다. 페일과 균질화로 신선한 MiR05의 1 ~3 밀리리터가 남은 조직 균질화세척을 합니다.
MiR05 세척을 동종 구균이 들어 있는 원색 튜브에 붓습니다. 이 단계를 2~3회 반복하여 동종모네이트의 완전한 전송을 보장합니다. 조직 균질화 농도를 정확하게 계산하려면 결합 조직을 포함하는 남은 비균질화 물질에 대해 균질화및 균질화물질을 주의 깊게 검사합니다.
핀셋으로 도달할 수 없는 균질화 물질로부터 비균질화 물질을 제거하기 위해, MiR05를 균질화기에 첨가한 후, 조직을 포함한 부피를 피펫으로 흡인시키고 페트리 접시로 이동한다. 피펫으로 그들을 흡입하여 동형 관의 바닥에 있는 큰 조각에 정착된 비균질화 물질을 제거하고 원물 튜브의 캡에 놓습니다. 페트리 접시 또는 원물 튜브 캡에서 핀셋으로 조직을 제거하고 필터 용지에 얼룩을 냅니다.
원추형 튜브 캡에서 남은 동형모를 원추형 튜브에 다시 넣습니다. 튜브를 캡한 다음 혼합하는 반전. 균질화 및 균질화균재를 추가비균질화 물질에 대해 재검사하고 필요한 경우 균질화되지 않은 물질을 제거하는 단계를 반복한다.
균질화로부터 회수된 비균질화 물질의 질량을 계량및 기록한다. 전달된 심하게 손상되지 않은 조직에 대한 균질제제를 검사하고, 비균질화 조각을 제거하고 필요에 따라 무게를 측정합니다. 최종 샘플 중량을 계산하기 위해 초기 젖은 중량에서 계량 보트, 균질화 및 균질화에서 회수된 조직 중량을 빼는다.
최종 샘플 중량을 사용하여 MiR05를 추가하여 원하는 농도로 동종모네이트를 가져옵니다. 동형모의 무게와 준비되면 가능한 한 빨리 분석진행합니다. 샘플이 기기로 전송될 때까지 젖은 얼음에 보관하십시오.
기기가 보정되고 샘플이 준비되면 비틀기 동작으로 스토퍼를 제거하고 챔버 내부에서 MiR05를 흡인하여 챔버 내부에 노출된 멤브레인을 피하십시오. 동종균을 잘 섞고 챔버에 균주형2.25 밀리리터를 추가합니다. 하나의 균모가 여러 챔버에 추가되고 있다고 가정, 동일한 조직 분포를 보장하기 위해 균모를 혼합하는 동안 각 챔버에 한 번에 호모게네이트의 파이펫 1 밀리리터.
F4를 클릭하여 이벤트의 이름을 지정하고 타임스탬프를 클릭한 다음 Okay를 클릭합니다. 무딘 18 게이지 바늘을 사용하여 조절기 및 가스 튜브로 산소 탱크에서 산소로 50 밀리리터 주사기를 채웁니다. 약 500 마이크로 몰라 산소에 그들을 과산소를 챔버에 직접 산소를 주입.
스토퍼를 느슨하게 삽입하고 산소가 약 480 마이크로 몰라에 도달 할 때까지 닫을 때까지 기다립니다. 비틀기 동작으로 챔버를 천천히 닫고 호흡이 약 15~20분 동안 평형화되도록 합니다. 필요한 경우 스토퍼의 중앙 모세관을 MiR05로 채웁니다.
전용 현미경을 사용하여 기판, 분리기 및 억제제를 완전히 닫힌 챔버에 주입하여 각 챔버의 이벤트를 실시간으로 지정하고 타임스탬프를 찍습니다. 필요에 따라 산소 농도 및 산소 경사 음척도를 조정하려면 F6를 선택합니다. 각 주입 후, 수용성 화합물에 대한 물에 주사를 세 번 세척하고, 에탄올 용해 화합물에 대한 70 %에탄올.
0.8-어금니 마레이의 5개의 마이크로리터를 추가하고 다음 주사로 즉시 진행합니다. 주사 주사기를 물에 세 번 씻으시면 됩니다. 즉시 1-어금니 피루바테의 5개의 마이크로리터를 추가하고 호흡이 안정될 때까지 기다립니다.
주사기를 세척한 후 0.5-어금니 ADP의 10마이크로리터를 추가하고 ADP 응답이 안정화될 때까지 기다립니다. 주사기를 씻고 2-어금니 글루타민의 5 마이크로리터를 추가하고 호흡이 안정될 때까지 기다립니다. 주사기를 씻은 다음 4 밀리머 사이토크롬-C의 마이크로리터 5기를 추가하고 호흡이 안정될 때까지 기다립니다.
주사기를 세척 한 후, 1-어금니 의 20 마이크로 리터를 추가하고 호흡이 안정 될 때까지 기다립니다. 1 밀리머 FCCP의 0.5- 1-마이크로리터 증분을 적시하고 각 주입 후 호흡이 안정화될 때까지 기다립니다. 호흡이 추가로 증가하지 않는 때까지 계속하십시오.
사출 주사기를 70%에 탄올로 3회 세척합니다. 150 마이크로몰라 로테론의 2개의 마이크로리터를 추가하고 호흡이 안정될 때까지 기다립니다. 더 이상 억제가 없는지 확인하기 위해 로테논의 또 다른 마이크로리터를 추가합니다.
호흡의 감소가있는 경우, 호흡의 감소가 없을 때까지 추가 주사를 계속, 다음 70 %에탄올에서 세 번 주사 주사기를 세척. 125 마이크로몰라 항마이신 A의 2개의 마이크로리터를 추가하고 호흡이 안정될 때까지 기다립니다. 더 이상 억제가 없는지 확인하기 위해 항마이신 A의 또 다른 마이크로리터를 추가합니다.
호흡의 감소가 있는 경우에, 호흡에 있는 감소가 없을 때까지 추가 주사를 계속하십시오. 70%에탄올로 주사기를 세 번 씻으시다. 챔버의 산소 농도를 확인합니다.
농도가 125 마이크로몰라 이하인 경우, 산소가 호흡 플럭스를 제한하지 않도록 실내 공기에 재산소, 또는 약간 과산소를 합니다. 0.8-어금니 아스콜베이트 5개의 마이크로리터를 추가합니다. 주사기를 70%에 탄올로 3번 씻으시다.
즉시 0.2-어금니 TMPD의 10 마이크로 리터를 추가하고 호흡의 증가를 기다립니다. 에탄올로 주사기를 세척한 후, 아스코르바테 TMPD 고원의 호흡 플럭스가 즉시 4-어자 나트륨 아지드 25마이크로리터를 추가합니다. 파일을 클릭하여 종료하고 저장 하고 연결을 끊습니다.
그것은 관찰 되었다 40 조직 균모의 밀리 리터 당 밀리 그램 급속 한 산소 고갈 귀 착되 었. 산소 소비는 조직 균모제의 밀리리터 당 30 및 20 밀리그램으로 실질적으로 둔화되었지만 기판이나 ADP가 없는 상태에서 는 여전히 짧은 시간에 급격히 감소했습니다. 조직 균모의 밀리 리터 농도 당 10 밀리 그램 최적의 산소 소비 속도 결과.
SUIT 프로토콜은 NADH 및 간결한 산화 인산화 및 전자 전달뿐만 아니라 복잡한 IV 활성을 평가하기 위해 사용되었습니다. Cytochrome C 릴리스는 피루바테와 말린, 또는 간결하고 로테네네의 존재에서 평가되었다, 둘 다 호모게네이트 준비가 미토콘드리아를 손상하지 않았다는 것을 밝혔다. 그것은 또한 NADH 연결 산화 인 산화 EO771 종양에서 무시할 수 있었다 는 것을 발견 되었다.
최대 전자 흐름을 구동하는 FCCP의 적정은 EO771 종양에서 산화보다는 인산화가 호흡으로 제한되었다는 것을 밝혔습니다. 종양 균모전 호흡 프로파일은 종양에서 N 및 S-연결된 기판에 의해 지원되는 감소된 최대 전자 전달을 제외하고, 이식되지 않은, 디지토닌-투과성 EO771 세포의 것과 유사하였다. 간결한 호흡 역학은 최대 속도가 달성될 때까지 ADP를 정복하는 단계적 적정에 의해 더욱 평가되었다.
간결하고 로테네인이 있는 ADP의 반 최대 농도는 37.5 마이크로몰라였으며, 최대 속도는 밀리그램당 초당 약 10.5피코몰이었다. 일상적인 치료에 설정된 악기와 조직 처리는 이러한 실험의 성공을 위해 매우 중요합니다. 이러한 절차에 따라 금리 정상화에 대한 다른 질량 또는 마커별 접근 방식은 관심 문제에 따라 적용될 수 있습니다.
일반적인 측정은 정석 신디사이저의 총 단백질 정량화 및 효소 활성을 포함하지만 모델 시스템, 통계 적 설계 및 연구 질문에 따라 다릅니다.
