이 연구는 중국 국립자연과학재단(31871170, 32170950, 31970915), 광둥성 자연과학재단(2021A1515010804 및 2023A1515010899), 광둥성 자연과학재단 주요 재배 프로젝트(2018B030336001), 광둥성 보조금: 뇌질환 치료를 위한 핵심 기술(2018B030332001)의 보조금으로 지원되었습니다.

모든 마우스는 상업적으로 수득하였고, 22-25°C의 실온 및 50%-60%의 상대 습도에서 12시간 빛/12시간 어두운 주기(현지 시간 08:00에 점등)로 유지하였다. 생쥐들은 먹이와 물을 지속적으로 공급받을 수 있었다. 모든 실험은 화남사범대학의 실험동물 관리 및 사용 지침에 따라 수행되었으며 기관 동물 윤리 위원회의 승인을 받았습니다. 생후 3-5개월 된 수컷 C57BL/6J 마우스를 실험에 사용하였다.
1. 마이크로 드라이브 시스템 조립
<ol><li>이동식 마이크로 드라이브를 고정하는 나사와 두 개의 스툴을 사용하여 두 개의 컴퓨터 설계 기판을 연결하고 커넥터를 하나의 기판에 연결합니다(그림 1A, Bi-iii). 나사(0.5mm/원)를 비틀어 마이크로 드라이브를 구동합니다.</li>
	<li>마이크로 드라이브가 MC 영역의 각 측면에 대해 8개의 가이드 튜브(길이 ~3cm, 내경 ~50μm, 외경 ~125μm)로 구성된 두 세트를 운반할 수 있는지 확인한 다음 동일한 길이(최소 15mm; 그림 1Biv, v).</li>
	<li>직경 35μm의 니켈 크롬 와이어 16개(~5cm 길이)를 절단한 다음 가이드 튜브에 연속적으로 로드한 다음 접착제를 도포하여 고정합니다(그림 1Bi, vi, vii).</li>
	<li>전선 절연체를 벗겨내고 노출된 각 전선을 채널 맵을 따라 커넥터에서 각 핀에 연속적으로 꼬은 다음 기준 전극 및 접지 전극을 연달아 꼬은 다음 각 핀에 전도성 페인트를 천천히 코팅합니다(그림 1Bviii-x).</li>
	<li>에폭시 수지(그림 1Axi, xii)를 사용하여 핀을 덮은 다음 임피던스 테스터를 통해 금 도금을 수행하여 전극 팁의 임피던스를 ~350kOhm으로 줄입니다(그림 1Bxiii, xiv). 임피던스 테스터의 매개 변수를 다음과 같이 설정합니다 : 10.08mM PtCl4를 포함한 금 도금 용액으로 1 초 동안 −4μA 직류.</li>
	<li>마지막으로 나사를 돌려 마이크로 드라이브를 상단으로 이동합니다. 그림 1A 와 같이 수정된 마이크로 드라이브 시스템의 전체 크기(길이 약 15mm, 너비 10mm, 높이 20mm, 무게 ~1g)를 확인합니다. 컴퓨터로 설계된 기판 및 가동 부품의 자세한 사양은 그림 1Ai, ii에서 확인하십시오.</li>
</ol>2. 전극 어레이 이식
<ol><li>수술 키트를 소독하고, 멸균 장갑을 착용하고, 수술이 시작되기 전에 의사의 멸균 흰색 가운을 입습니다.</li>
	<li>통증을 관리하기 위해 유도 챔버에서 마우스에 멜록시캄 주사제(5mg/kg)를 피하(s.c.) 주사합니다. 그런 다음 유도 챔버18,19에서 펜토바르비탈(80mg/kg)의 복강내(ip) 주사에 의해 마우스를 마취시킨다. 발가락 꼬집 반사가 여전히 존재하는 경우 펜토바르비탈(20mg/kg/h)을 보충 투여하십시오.</li>
	<li>마우스를 입체 장치에 고정하고 온도 조절기를 사용하여 직장 온도를 37°C로 유지합니다.</li>
	<li>생쥐의 양쪽 눈에 테트라사이클린 눈 연고를 바르고 수술 전에 멸균 장갑을 다시 교체합니다.</li>
	<li>쥐의 털을 면도하고 멸균 면 팁 어플리케이터를 사용하여 중앙에서 시작하여 바깥쪽으로 동심원으로 베타딘 스크럽과 알코올을 번갈아 3회 번갈아 가며 수술 부위를 소독합니다(그림 2i, ii). 두개골을 노출시키기 위해 정중선을 작게 절개(~15mm)합니다. 즉시 통증 완화를 위해 1% 리도카인을 목 근육에 국소적으로 바르십시오. 그런 다음 가위를 사용하여 잔여 조직을 제거하고 식염수 코팅된 면봉을 사용하여 두개골을 청소합니다(그림 2iii).</li>
	<li>잉크로 채워진 유리 미세 전극을 사용하여 이식을 위해 양측 MC의 원하는 위치를 표시합니다(그림 2iv, v). 선행 연구(20)에 기초하여, 양측 MC의 위치는 다음과 같다: 브레그마에서 0.74mm, 정중선에서 1.25mm.</li>
	<li>마이크로 드라이브 시스템을 보호하기 위해 4개의 스테인리스 스틸 나사(직경 0.8mm)를 이식한 다음 모든 나사를 기준 전극 및 접지 전극과 함께 연결한 다음 혼합 치과용 시멘트로 덮어 벽을 형성합니다(그림 2vi-xi).</li>
	<li>MC 영역에서 조정된 두개골의 왼쪽과 오른쪽 모두에 두개골 드릴로 두 개의 작은 구멍(~1.5mm2)을 조심스럽게 뚫습니다(그림 2xii). 양측 MC의 입체 좌표를 사용합니다 : 브레그마에서 전방 0.74mm, 정중선에서 측면 1.25mm, 경막에서 복부 0.5mm.</li>
	<li>미세한 집게로 구멍에서 경막을 조심스럽게 제거합니다(그림 2xiii).</li>
	<li>마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 10μm/s의 속도로 마이크로 드라이브 시스템을 구멍 중앙에 삽입합니다(그림 2xiv-xvii).</li>
	<li>마이크로 드라이브 시스템 삽입을 마친 후 치과용 시멘트 벽에 바셀린을 채웁니다(그림 2xviii).</li>
	<li>마이크로 드라이브 시스템의 바닥판과 치과용 시멘트 벽을 혼합된 치과용 시멘트로 결합합니다(그림 2xix).</li>
	<li>절개 부위를 식염수로 씻은 후 린코마이신 염산염과 리도카인 염산염이 함유된 겔로 국소 치료를 하여 수술 후 통증을 완화합니다.</li>
	<li>이식된 마이크로 드라이브 시스템에 전도성 동박 테이프를 감습니다(그림 2xx).</li>
	<li>마우스를 31-33°C로 유지되는 케이지로 옮기고 마우스가 마취에서 회복되는지 모니터링합니다.</li>
	<li>생쥐가 별도의 먹이로 1주일 동안 회복되도록 합니다. 린코마이신 염산염과 리도카인 염산염이 함유된 겔을 3일 동안 지속적으로 도포하여 절개 부위를 확인하고 치료합니다.</li>
</ol>3. 자유롭게 움직이는 마우스의 양측 MC에서 다중 채널 기록
<ol><li>깨어 있는 쥐의 머리를 가볍고 조심스럽게 잡습니다. 최소 0.1일 전에 마이크로 드라이브 시스템의 가동 가능한 부분(그림 1Aii)에 있는 나사를 비틀어 전극 어레이(~1mm 깊이)를 아래로 이동합니다.</li>
	<li>깨어 있는 마우스의 머리를 가볍고 조심스럽게 잡습니다. 헤드스테이지의 중앙과 헬륨 풍선(약 0.02L의 헬륨으로 채워짐)을 나사산으로 연결하여 헤드스테이지와 마이크로 드라이브 시스템의 무게를 상쇄합니다(그림 3A, B).</li>
	<li>레코딩 소프트웨어에서 30kHz로 샘플링하여 레코딩 전극 및 멀티채널 시스템을 사용하여 원시 신호를 캡처한 다음 멀티채널 시스템의 디지털-아날로그(DA) 컨버터를 사용하여 디지타이징할 수 있습니다.</li>
	<li>녹음 소프트웨어에서 10kHz로 리샘플링하여 원시 데이터에서 LFP 신호를 추출한 다음 녹음 소프트웨어의 노치 필터를 사용하여 50Hz 라인 노이즈를 제거합니다.</li>
	<li>자유롭게 움직이는 마우스에서 최소 60초 동안 안정적인 상태로 원시 데이터를 기록합니다. 녹화가 끝나면 헤드스테이지와 마이크로 드라이브 시스템 사이의 연결을 천천히 제거하고 마우스를 홈 케이지로 되돌립니다.</li>
	<li>기록된 데이터를 컴퓨터에 저장하고 오프라인으로 분석합니다(그림 4 및 그림 5).</li>
	<li>실험 종료 후 연구소의 지침에 따라 안락사를 시행한 후 3V 출력의 전원을 이용하여 전극의 위치를 확인하여 1분 동안 전해 병변을 시행한 후 조직학적 분석을 실시합니다. 냉동 마이크로톰을 사용하여 쥐의 뇌를 30μm 조각으로 자르고 MC 섹션을 수집한 다음 현미경으로 이미지를 캡처합니다(그림 3C, D).</li>
</ol>4. 스파이크 분류 및 분석
<ol><li>스파이크 정렬 소프트웨어에서 파일 > 열기 > Nev 파일을 클릭하여 30kHz로 샘플링된 스파이크 데이터를 엽니다(그림 4Ai).</li>
	<li>정보를 클릭하여 정렬되지 않은 채널을 선택한 다음 정렬 > 정렬 방법 변경 > K-평균 사용을 선택합니다. Valley-Seeking Sort > K-Means Sorting 버튼을 눌러 정렬된 단위를 구합니다(그림 4Aii, iii).</li>
	<li>File(파일) > Save as(다른 이름으로 저장)를 클릭하고, 정렬된 스파이크 데이터를 .nev 파일 이름 확장자로 저장하고, File(파일 ) > Export Per-Waveform Data(파형별 데이터 내보내기 )를 선택하여 .txt 파일 이름 확장자를 가진 PCA 결과를 내보냅니다(그림 4Aiv).</li>
	<li>신경 생리학적 데이터 분석을 위한 소프트웨어에서 File(파일) > Import Data(데이터 가져오기) > Blackrock File(블랙록 파일 )을 클릭하여 정렬된 스파이크 파일을 엽니다(그림 4Bi).</li>
	<li>Analysis( 분석) > Autocorrelograms(자동 코렐로그램) 를 클릭하여 선택한 단위에 대한 autocorrelogram을 구한 다음 -0.05초에서 X 최소값, 0.05초에서 X 최대값, 0.001에서 Bin 값으로 매개변수를 설정합니다(그림 4Bii, iii).</li>
	<li>정렬된 스파이크 데이터를 로드하고 분석 > 인터스파이 크 간격 히스토그램을 클릭하여 스파이크 간 간격 히스토그램을 구한 다음 0초의 최소 간격 값, 0.1초의 최대 간격 값, 0.001의 Bin 값으로 매개변수를 설정합니다(그림 4Biv, v).</li>
	<li>분석 > Crosscorrelograms를 클릭하여 정렬된 두 단위 이벤트 간의 교차 상관을 구한 다음 참조 이벤트 및 매개변수를 -0.1초에서 X 최소값, 0.1초에서 X 최대값, 0.001에서 Bin 값으로 설정합니다(그림 4Bvi, vii).</li>
	<li>Results > Numerical Results를 클릭하여 autocorrelogram, inter-spike interval histogram 및 cross-correlogram의 결과를 .xls 파일 이름 확장자로 저장합니다(그림 4Bviii, ix). 데이터를 분석하고 그래프를 그립니다.</li>
</ol>5. LFP 분석
<ol><li>신경 생리학적 데이터 분석을 위한 소프트웨어에서 File Import Data(파일 가져오기 데이터) > Blackrock File(Blackrock 파일 )을 클릭하여 10kHz로 샘플링된 연속 신호 데이터를 엽니다(그림 5Ai).</li>
	<li>연속에 대한 분석 > 스펙트럼을 클릭하여 선택한 채널에서 LFP에 대한 파워 스펙트럼을 분석합니다. 파라미터를 8,192에서의 주파수 값 수, 3-5에서의 다중 테이퍼 값, 총 전력 스펙트럼 밀도(PSD)의 백분율 정규화, 1Hz에서 100Hz까지의 주파수 범위로 설정합니다(그림 5Aii, iii).</li>
	<li>Analysis(분석) > Coherence for Continuous(연속 )를 클릭하여 MC의 왼쪽과 오른쪽에서 두 LFP의 일관성을 분석합니다. 참조 채널과 매개변수를 다음과 같이 설정합니다. 일관성 값, 8,192에서의 주파수 값 수, 3-5에서의 다중 테이퍼 값, 1Hz에서 100Hz까지의 주파수 범위(그림 5Aiv, v)입니다.</li>
	<li>클릭 분석 > Corr. with Cont. 변수를 사용하여 MC의 왼쪽과 오른쪽에서 두 LFP 간의 상관 관계를 분석합니다. 참조 채널(LFP 데이터) 및 매개변수를 다음과 같이 설정합니다. -0.1초에서 X 최소값, 0.1초에서 X 최대값, 0.001에서 Bin 값(그림 5Avi, vii)를 참조하십시오.</li>
	<li>Results > Numerical Results를 클릭하여 PSD의 결과, 일관성 및 상관 관계를 .xls 파일 이름 확장자와 함께 저장합니다(그림 5Aviii, ix).</li>
	<li>각 주파수 대역에 대해 대표 트레이스를 추출해야 하는 채널을 선택하고 Edit > Digital Filtering of Continuous Variables(연속 변수의 디지털 필터링)를 클릭하여 각 주파수 대역을 구한 다음 Filter Freq. 응답을 Bandpass로, IIR(Infinite Impulse Response) Butterworth에서 Filter Implementation, 2에서 Filter Order 값으로 파라미터를 설정합니다. 마지막으로 관심 주파수 범위를 설정합니다(그림 5Bi-iv). 참고: 여기에 사용된 주파수 범위는 델타(δ, 1-4Hz), 세타(θ, 5-12Hz), 베타(β, 13-30Hz), 낮은 감마(낮은 γ, 30-70Hz) 및 높은 감마(높은 γ, 70-100Hz) 진동입니다.</li>
	<li>데이터를 분석하고 그래프를 그립니다.</li>
</ol>6. 스파이크와 LFP의 상관관계
<ol><li>클릭 파일 > 데이터 가져 오기 데이터 > Blackrock 파일 신경 생리학 데이터 분석을 위해 소프트웨어에서 연속 신호 데이터 및 스파이크 데이터를 엽니 다.</li>
	<li>Analysis(분석) > Coherence Analysis(일관성 분석)를 클릭하여 선택한 채널의 스파이크와 LFP 간의 일관성을 분석합니다. 참조 변수(스파이크 타이밍) 및 매개변수를 다음과 같이 설정합니다. 일관성 값, 512에서 주파수 값의 수, 3-5에서 다중 테이퍼 값, 1Hz에서 100Hz까지의 주파수 범위에서 계산합니다(그림 5Ci, ii).</li>
	<li>Results > Numerical Results를 클릭하여 .xls 파일 이름 확장자를 사용하여 스파이크 필드 일관성의 결과를 저장합니다(그림 5Ciii, iv).</li>
	<li>데이터를 분석하고 그래프를 그립니다.</li>
</ol>

생쥐의 운동 피질에서 세포외 전기생리학적 기록

<ol>
	<li>Buzs&#225;ki, G., Anastassiou, C. A., Koch, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origin+of+extracellular+fields+and+currents--EEG,+ECoG,+LFP+and+spikes.">The origin of extracellular fields and currents--EEG, ECoG, LFP and spikes.</a> Nature Reviews Neuroscience. 13 (6), 407-420 (2012).</li><li>Singer, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synchronization+of+cortical+activity+and+its+putative+role+in+information+processing+and+learning.">Synchronization of cortical activity and its putative role in information processing and learning.</a> Annual Review of Physiology. 55, 349-374 (1993).</li><li>Arroyo-Garc&#237;a, L. 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자유롭게 움직이는 마우스의 다중 채널 기록은 신경 과학 연구에서 유용한 기술로 간주되어 왔지만 초보자가 신호를 기록하고 분석하는 것은 여전히 매우 어렵습니다. 본 연구에서는 마이크로 드라이브 시스템을 만들고 전극 이식을 수행하기 위한 간단한 지침과 스파이크 분류 소프트웨어 및 신경 생리학적 데이터 분석을 위한 소프트웨어를 통해 전기 신호를 캡처하고 분석하는 간단한 ?...

세포외 신호의 중요한 구성 요소인 국소전위(LFP)는 여러 행동에 대한 신경 코드를 형성하는 대규모 뉴런 집단의 시냅스 활동을 반영합니다1. 신경 활동에 의해 생성된 스파이크는 LFP에 기여하는 것으로 간주되며 신경 코딩에 중요합니다2. 스파이크와 LFP의 변화는 알츠하이머병과 같은 여러 뇌 질환과 두려움 등의 감정을 매개하는 것으로 입증되었습니다.3,4. 많은 연구에서 동물의 스파이크 활동이 깨어 있는 상태와 마취된 상태 간에 유의한 차이가 있음을 강조했다는 점은 주목할 가치가 있다5. 마취된 동물에서의 기록은 고도로 정의된 피질 동기화 상태에서 최소한의 인공물로 LFP를 평가할 수 있는 기회를 제공하지만, 결과는 깨어 있는 피험자에서 발견될 수 있는 것과는 어느 정도 다르다 6,7,8. 따라서 뇌에 이식된 전극을 이용하여 각성 뇌 상태에서 각종 질환의 장시간 규모와 넓은 공간적 규모에 걸친 신경 활동을 검출하는 것이 더 의미가 있다. 이 원고는 기록 및 분석을 시작하기 위해 빠르고 간단한 방법으로 스파이크 및 LFP 신호를 계산하기 위해 공통 소프트웨어를 사용하여 마이크로 드라이브 시스템을 만들고 매개변수를 설정하는 방법에 대한 초보자를 위한 정보를 제공합니다.
두피에서 기록된 뇌전도(EEG) 및 사건 관련 전위(ERP)를 사용하는 것과 같은 뇌 기능의 비침습적 기록은 인간 및 설치류 연구에서 광범위하게 사용되어 왔지만, EEG 및 ERP 데이터는 공간적, 시간적 특성이 낮기 때문에 특정 뇌 영역 내에서 근처의 수지상 시냅스 활동에 의해 생성된 정확한 신호를 감지할 수 없습니다1. 현재, 의식이 있는 동물에서 다채널 기록을 이용함으로써, 여러 행동 테스트 중에 영장류나 설치류의 뇌에 마이크로 드라이브 시스템을 이식하여 뇌의 더 깊은 층의 신경 활동을 만성적이고 점진적으로 기록할 수 있습니다 1,2,3,4,5,6,7,8,9 . 간단히 말해서, 연구자들은 뇌의 다른 부분들을 표적으로 삼기 위해 전극 또는 사극의 독립적인 포지셔닝에 사용될 수 있는 마이크로-드라이브 시스템을 구성할 수 있다(10,11). 예를 들어, Chang et al.은 가볍고 컴팩트한 마이크로-드라이브(12)를 조립함으로써 마우스에서 스파이크 및 LFP를 기록하는 기술을 기술하였다. 또한, 맞춤형 액세서리 구성 요소를 갖는 미세 가공된 실리콘 프로브는 행동 작업 동안 설치류에서 다수의 단일 뉴런 및 LFP를 기록하기 위해 상업적으로 이용 가능하다(13). 마이크로 드라이브 시스템을 조립하기 위해 다양한 설계가 사용되었지만 전체 마이크로 드라이브 시스템의 복잡성과 무게 측면에서 여전히 제한적인 성공을 거두었습니다. 예를 들어, Lansink 등은 단일 뇌 영역(14)으로부터 기록하기 위한 복잡한 구조를 갖는 다중채널 마이크로-드라이브 시스템을 보여주었다. Sato et al.은 자동 유압 포지셔닝 기능(15)을 표시하는 다채널 마이크로 드라이브 시스템을 보고하였다. 이러한 마이크로 드라이브 시스템의 주요 단점은 마우스가 자유롭게 움직이기에는 너무 무겁고 초보자가 조립하기 어렵다는 것입니다. 다채널 세포외 기록은 행동 테스트 중 신경 활동을 측정하는 데 적합하고 효율적인 기술임이 밝혀졌지만, 초보자가 복잡한 마이크로 드라이브 시스템에서 획득한 신호를 기록하고 분석하는 것은 쉽지 않습니다. 자유롭게 움직이는 마우스(16, 17)에서 다채널 세포외 기록 및 데이터 분석의 전체 동작 과정을 시작하는 것이 어렵다는 점을 감안할 때, 본 논문은 일반적으로 이용 가능한 구성요소 및 설정을 사용하여 마이크로-드라이브 시스템을 만드는 상세한 과정을 소개하기 위한 단순화된 가이드라인을 제시한다; 빠르고 간단한 방법으로 스파이크 및 LFP 신호를 계산하기 위한 공통 소프트웨어의 매개변수도 제공됩니다. 또한 이 프로토콜에서 마우스는 헬륨 풍선을 사용하여 자유롭게 움직일 수 있으며, 이는 헤드스테이지 및 마이크로 드라이브 시스템의 무게를 상쇄하는 데 기여합니다. 일반적으로 본 연구에서는 마이크로 드라이브 시스템을 쉽게 구축하고 기록 및 데이터 분석 프로세스를 최적화하는 방법을 설명합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2.54 mm pin header</td>
			<td>YOUXIN Electronic Co., Ltd.</td>
			<td>1 x 5</td>
			<td>Applying for the movable micro-drive which can slide on its stulls.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adobe Illustrator CC 2017</td>
			<td>Adobe</td>
			<td>N/A</td>
			<td>To optimize images from GraphPad.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BlackRock Microsystems</td>
			<td>Blackrock Neurotech</td>
			<td>Cerebus</td>
			<td>This systems includes headsatge, DA convert, amplifier and computer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brass nut</td>
			<td>Dongguan Gaosi Technology Co., Ltd.</td>
			<td>M0.8 brass nut</td>
			<td>The nut fixes the position of screw.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brass screw</td>
			<td>Dongguan Gaosi Technology Co., Ltd.</td>
			<td>M0.8 x 11 mm brass screw</td>
			<td>A screw that hold the movable micro-drive.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J</td>
			<td>Guangdong Zhiyuan Biomedical Technology Co., LTD.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>12 weeks of age.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tube</td>
			<td>Biosharp</td>
			<td>15 mL; BS-150-M</td>
			<td>To store mice brain with sucrose sulutions.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conducting paint</td>
			<td>Structure Probe, Inc.</td>
			<td>7440-22-4</td>
			<td>To improve the lead-connecting quality between connector pins and Ni-wires.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conductive copper foil tape</td>
			<td>3M</td>
			<td>1181</td>
			<td>To reduce interferenc.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Connector</td>
			<td>YOUXIN Electronic Co., Ltd.</td>
			<td>2 x 10P</td>
			<td>To connect the headtage to micro-drive system.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DC Power supply</td>
			<td>Maisheng</td>
			<td>MS-305D</td>
			<td>A power device for&#160; electrolytic lesion.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental cement</td>
			<td>Shanghai New Century Dental Materials Co., Ltd.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>To fix the electrode arrays on mouse&#39;s skull after finishing the implantation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital analog converter</td>
			<td>Blackrock</td>
			<td>128-Channel</td>
			<td>A device that converts digital data into analog signals.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy resin</td>
			<td>Alteco</td>
			<td>N/A</td>
			<td>To cover pins.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td>N/A</td>
			<td>To summarize data after analysis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eye scissors</td>
			<td>JiangXi YuYuan Medical Equipment Co.,Ltd.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For surgery or cutting the Ni-chrome wire.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>JiangXi YuYuan Medical Equipment Co.,Ltd.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For surgery.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>JiangXi YuYuan Medical Equipment Co.,Ltd.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For surgery or assembling the mirco-drive system.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezing microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM3050 S</td>
			<td>&#160;Cut the mouse&#8217;s brain into slices</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fused silica capillary tubing</td>
			<td>Zhengzhou INNOSEP Scientific Co., Ltd.</td>
			<td>TSP050125</td>
			<td>To&#160; serve as the guide tubes for Ni-chrome wires.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass microelectrode</td>
			<td>Sutter Instrument Company</td>
			<td>BF100-50-10</td>
			<td>To mark the desired locations for implantation using the filled ink.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism 7</td>
			<td>GraphPad Software</td>
			<td>N/A</td>
			<td>To analyze and visualize the results.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guide-tube</td>
			<td>Polymicro technologies</td>
			<td>1068150020</td>
			<td>To load Ni-chrome wires.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Headstage</td>
			<td>Blackrock</td>
			<td>N/A</td>
			<td>A tool of transmitting signals.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Helium balloon</td>
			<td>Yili Festive products Co., Ltd.</td>
			<td>24 inch</td>
			<td>To offset the weight of headstage and micro-drive system.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ink</td>
			<td>Sailor Pen Co.,LTD.</td>
			<td>13-2001</td>
			<td>To mark the desired locations for implantation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodine tincture</td>
			<td>Guangdong Hengjian Pharmaceutical Co., Ltd.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>To disinfect mouse&#39;s scalp.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lincomycin in Hydrochloride and Lidocaine&#160; hydrochloride gel</td>
			<td>Hubei kangzheng pharmaceutical co., ltd.</td>
			<td>10g</td>
			<td>A drug used to reduce inflammation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Meloxicam</td>
			<td>Vicki Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td>71125-38-7</td>
			<td>To reduce postoperative pain in mice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulators</td>
			<td>Scientifica</td>
			<td>Scientifica IVM Triple</td>
			<td>For electrode arrays implantation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>ECLIPSE Ni-E</td>
			<td>&#160;Capture the images of brain sections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nanoZ impedance tester</td>
			<td>Plexon</td>
			<td>nanoZ</td>
			<td>To measure impedance or performing electrode impedance spectroscopy (EIS) for multichannel microelectrode arrays.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NeuroExplorer</td>
			<td>Plexon</td>
			<td>NeuroExplorer</td>
			<td>A tool for analyzing the electrophysiological data.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NeuroExplorer&#160;</td>
			<td>Plexon, USA</td>
			<td>N/A</td>
			<td>A software.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-chrome wire</td>
			<td>California Fine Wire Co.</td>
			<td>M472490</td>
			<td>35 &#956;m Ni-chrome wire.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Offline Sorter</td>
			<td>Plexon</td>
			<td>Offline Sorter</td>
			<td>A tool for sorting the recorded multi-units.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCB board</td>
			<td>Hangzhou Jiepei Information Technology Co., Ltd.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Computer designed board.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pentobarbital</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3761</td>
			<td>To anesthetize mice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pentobarbital sodium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>57-33-0</td>
			<td>To anesthetize the mouse.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump</td>
			<td>Longer</td>
			<td>BT100-1F</td>
			<td>A device used for perfusion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyformaldehyde&#160;</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A500684-0500</td>
			<td>The main component of fixative solution for fixation of mouse brains&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PtCl4</td>
			<td>Tianjin Jinbolan Fine Chemical Co., Ltd.</td>
			<td>13454-96-1</td>
			<td>Preparation for gold plating liquid.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline</td>
			<td>Guangdong Hengjian Pharmaceutical Co., Ltd.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>To clean the mouse&#39;s skull.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver wire</td>
			<td>Suzhou Xinye Electronics Co., Ltd.</td>
			<td>2 mm diameter</td>
			<td>Applying for ground and reference electrodes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skull drill</td>
			<td>RWD Life Science</td>
			<td>78001</td>
			<td>To drill carefully two small holes on mouse&#39;s skull.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel screws</td>
			<td>YOUXIN Electronic Co., Ltd.</td>
			<td>M0.8 x 2</td>
			<td>To protect the micro-drive system and link the ground and reference electrodes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotaxic apparatus</td>
			<td>RWD Life Science</td>
			<td>68513</td>
			<td>To perform the stereotaxic coordinates of bilateral motor cortex.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Damao</td>
			<td>57-50-1</td>
			<td>To dehydrate the mouse brains&#160; after perfusion.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super glue</td>
			<td>Henkel AG &#38; Co.</td>
			<td>PSK5C</td>
			<td>To fix the guide tube and Ni-chrome wire.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature controller</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>TCAT-2</td>
			<td>To maintain mouse&#39;s rectal temperature at 37&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline eye ointment</td>
			<td>Guangdong Hengjian Pharmaceutical Co., Ltd.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>To protect the mouse&#39;s eyes during surgery.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thread</td>
			<td>Rapala</td>
			<td>N/A</td>
			<td>To link ballon and headstage.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vaseline</td>
			<td>Unilever plc</td>
			<td>N/A</td>
			<td>To cover the gap between electrode arrays and mouse&#39;s skull.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multichannel extracellular recording in freely moving mice

이 프로토콜은 전기생리학적 신호를 자발적 및/또는 특정 행동과 연관시킴으로써 특정 작업을 수행하는 마우스에서 신경 세포 발화 및 네트워크 국소장 전위(LFP)의 특성을 밝히는 것을 목표로 합니다. 이 기술은 이러한 행동의 기초가 되는 뉴런 네트워크 활동을 연구하는 데 유용한 도구입니다. 이 논문은 자유롭게 움직이는 의식이 있는 마우스에서 전극 이식 및 그에 따른 세포외 기록에 대한 상세하고 완전한 절차를 제공합니다. 이 연구에는 미세 전극 어레이를 이식하고, 다중 채널 시스템을 사용하여 운동 피질(MC)에서 LFP 및 신경 세포 스파이크 신호를 캡처하고, 후속 오프라인 데이터 분석을 위한 자세한 방법이 포함됩니다. 의식이 있는 동물에서 다중 채널 기록의 장점은 더 많은 수의 스파이킹 뉴런과 뉴런 아형을 얻고 비교할 수 있어 특정 행동과 관련 전기생리학적 신호 간의 관계를 평가할 수 있다는 것입니다. 특히, 본 연구에서 기술한 다채널 세포외 기록 기법 및 데이터 분석 절차는 행동하는 마우스에서 실험을 수행할 때 다른 뇌 영역에도 적용될 수 있다.

The local field potential (LFP), an important component of extracellular signals, reflects the synaptic activity of large populations of neurons, which form the neural code for multiple behaviors1. Spikes generated by neuronal activity are considered to contribute to the LFP and are important for neural coding2. Alterations in spikes and LFPs have been proven to mediate several brain diseases, such as Alzheimer&#39;s disease, as well as emotions such as fear, etc.3,4. It is worth noting that many studies have highlighted that spike activity significantly differs between awake and anesthetized states in animals5. Although recordings in anesthetized animals offer an opportunity to assess LFPs with minimal artifacts in highly defined cortical synchronization states, the results differ to some extent from what can be found in awake subjects6,7,8. Thus, it is more meaningful to detect neural activity over long time scales and large spatial scales in various diseases in an awake brain state using electrodes implanted in the brain. This manuscript provides information for beginners on how to make the micro-drive system and set the parameters using common software for computing the spike and LFP signals in a fast and straightforward way in order to get the recording and analysis started.
Although the non-invasive recording of brain functions, such as by using electroencephalograms (EEGs) and event-related potentials (ERPs) recorded from the scalp, has been used extensively in human and rodent studies, EEG and ERP data have low spatial and temporal properties and, thus, cannot detect the precise signals produced by nearby dendritic synaptic activity within a specific brain area1. Currently, by taking advantage of multichannel recording in conscious animals, neural activity in the deeper layers of the brain can be recorded chronically and progressively by implanting a micro-drive system into the brains of primates or rodents during multiple behavioral tests1,2,3,4,5,6,7,8,9. Briefly, researchers can construct a micro-drive system that can be used for the independent positioning of the electrodes or tetrodes to target different parts of the brain10,11. For example, Chang et al. described techniques to record spikes and LFPs in mice by assembling a light and compact micro-drive12. In addition, micro-machined silicon probes with custom-made accessory components are commercially available for recording multiple single neurons and LFPs in rodents during behavioral tasks13. Although various designs have been used for assembling micro-drive systems, these still have limited success in terms of the complexity and weight of the whole micro-drive system. For example, Lansink et al. showed a multichannel micro-drive system with a complex structure for recording from a single brain region14. Sato et al. reported a multichannel micro-drive system displaying an automatic hydraulic positioning function15. The main disadvantages of these micro-drive systems are that they are too heavy for mice to move freely and are difficult to assemble for beginners. Although multichannel extracellular recording has been shown to be a suitable and efficient technology for measuring neural activity during behavioral tests, it is not easy for beginners to record and analyze the signals acquired by the complex micro-drive system. Given that it is difficult to get the entire operation process of the multichannel extracellular recording and data analysis started in freely moving mice16,17, this present article presents simplified guidelines to introduce the detailed process of making the micro-drive system using commonly available components and settings; the parameters in the common software for computing the spike and LFP signals in a fast and straightforward way are also provided. Additionally, in this protocol, the mouse can move freely due to the use of a helium balloon, which contributes to offsetting the weight of headstage and micro-drive system. Generally, in the present study, we describe how to easily build a micro-drive system and optimize the processes of recording and data analysis.

저자 스포트라이트: 자유롭게 움직이는 마우스의 신경 활동을 연구하기 위한 다중 채널 세포외 기록의 발전 

자유롭게 움직이는 마우스의 다채널 세포외 기록

We aim to uncover the properties of neuronal firing and network local field potentials in behaving mice carrying out specific tasks by correlating the electrophysiological signal with behaviors. Multichannel extracellular recording by the micro-drive system has been shown to be a suitable and a efficient technology for neural activity during behavioral tests. Multichannel recording in free-moving mice has been deemed to be a useful technology in neuroscience studies, but it's still quite challenging for beginners to acquire and analyze the signals.We introduced how to perform the multichannel extracellular recording in freely-moving mice with a more steady and lightweight micro-drive system, and optimize the processes of recording and data analysis for the beginners. We are going to increase the number of channels and reduce the volume of micro-driver system in a new version.

고역 통과(250Hz) 필터를 적용하여 원시 신호에서 다중 단위 스파이크를 추출했습니다(그림 6A). 또한, PCA에 의해 정렬된 일반 마우스의 MC에서 기록된 단위를 검증하고(그림 7A-D), 마우스의 MC에 있는 단위의 밸리 폭과 파형 지속 시간을 기록했습니다. 그 결과, 생쥐에서 MC 추정 피라미드 뉴런(Pyn)의 밸리 폭과 파형 지속 시간이 추?...

Watch this Scientific Journal Video about Advancements in Multichannel Extracellular Recording for Studying Neuronal Activity in Freely Moving Mice at JoVE.com

이 프로토콜은 자유롭게 움직이는 의식이 있는 마우스의 세포외 전기생리학적 특성을 밝히기 위해 운동 피질(MC)에서 세포외 기록 방법론을 설명하고, 관심 행동의 기저에 있는 네트워크 신경 활동을 평가하는 데 유용한 국소전위(LFP) 및 스파이크의 데이터 분석을 설명합니다.

The protocol aims to uncover the properties of neuronal firing and network local field potentials (LFPs) in behaving mice carrying out specific tasks by ...

우리는 전기 생리학적 신호를 행동과 연관시킴으로써 특정 작업을 수행하는 쥐의 행동에서 신경 발화 및 네트워크 국소 필드 전위의 특성을 밝히는 것을 목표로 합니다. 마이크로 드라이브 시스템에 의한 다중 채널 세포 외 기록은 행동 테스트 중 신경 활동에 적합하고 효율적인 기술인 것으로 나타났습니다. 자유롭게 움직이는 마우스의 다중 채널 기록은 신경 과학 연구에서 유용한 기술로 간주되어 왔지만 초보자가 신호를 수집하고 분석하는 것은 여전히 매우 어렵습니다.보다 안정적이고 가벼운 마이크로 드라이브 시스템을 사용하여 자유롭게 움직이는 마우스에서 다중 채널 세포 외 기록을 수행하고 초보자를 위해 기록 및 데이터 분석 프로세스를 최적화하는 방법을 소개했습니다. 새 버전에서는 채널 수를 늘리고 마이크로 드라이버 시스템의 볼륨을 줄일 예정입니다.

multichannel-extracellular-recording-in-freely-moving-mice

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Multichannel Extracellular Recording in Freely Moving Mice

1.9K 조회수.  South China Normal University. 우리는 전기 생리학적 신호를 행동과 연관시킴으로써 특정 작업을 수행하는 쥐의 행동에서 신경 발화 및 네트워크 국소 필드 전위의 특성을 밝히는 것을 목표로 합니다. 마이크로 드라이브 시스템에 의한 다중 채널 세포 외 기록은 행동 테스트 중 신경 활동에 적합하고 효율적인 기술인 것으로 나타났습니다. 자유롭게 움직이는 마우스의 다중 채널 기록은 신경 과학 연구에?...

비디오: 저자 스포트라이트: 자유롭게 움직이는 마우스의 신경 활동을 연구하기 위한 다중 채널 세포외 기록의 발전 

The protocol aims to uncover the properties of neuronal firing and network local field potentials (LFPs) in behaving mice carrying out specific tasks by correlating the electrophysiological signals with spontaneous and/or specific behavior. This technique represents a valuable tool in studying the neuronal network activity underlying these behaviors. The article provides a detailed and complete procedure for electrode implantation and consequent extracellular recording in free-moving conscious mice. The study includes a detailed method for implanting the microelectrode arrays, capturing the LFP and neuronal spiking signals in the motor cortex (MC) using a multichannel system, and the subsequent offline data analysis. The advantage of multichannel recording in conscious animals is that a greater number of spiking neurons and neuronal subtypes can be obtained and compared, which allows the evaluation of the relationship between a specific behavior and the associated electrophysiological signals. Notably, the multichannel extracellular recording technique and the data analysis procedure described in the present study can be applied to other brain areas when conducting experiments in behaving mice.

The protocol describes the methodology of extracellular recording in the motor cortex (MC) to reveal extracellular electrophysiological properties in freely moving conscious mice, as well as the data analysis of local field potentials (LFPs) and spikes, which is useful for evaluating the network neural activity underlying behaviors of interest.

연구

신경과학

Micro-Drive System Assembly and Electrode Array Implantation for Multichannel Recording in Mice

Begin by assembling the Microdrive system. Connect two computer-designed boards using two stulls and a screw that holds the movable Microdrive, and attach the connector to one board. Ensure the Microdrive can carry two sets of eight guide tubes for each side of the motor cortex or MC region.Cut the guide tubes to the same length. Cut 16 nichrome wires, each measuring approximately five centimeters long and 35 micrometers in diameter. Load the wires into the guide tubes and apply glue to fix them.Strip the wire insulation and twine each exposed wire to each pin from the connector following the channel map and the reference and ground electrodes, then slowly coat conducting paint onto each pin. Cover the pins using epoxy resin, then perform gold plating via an impedance tester to reduce the impedance of the electrode tips to approximately 350 kiloohms. For electrode array implantation, fix the anesthetized mouse in a stereotaxic apparatus and use a temperature controller to maintain its rectal temperature at 37 degrees Celsius.Then make a small midline incision to expose the skull. Remove the residual tissue using scissors and clean the skull with sterile saline-soaked cotton buds. Using a glass microelectrode filled with ink, mark the desired locations of the bilateral MC for implantation.Next, using a skull drill, carefully drill two small holes on both the left and right sides of the coordinated skull in the MC regions. Gently remove the dura mater from the holes with fine forceps. Then insert the Microdrive system into the center of the holes, using a micromanipulator at 10 micrometers per second.After finishing the insertion, fill the petroleum jelly into the dental cement walls and join the bottom plate of the Microdrive system and the dental cement walls with the mixed dental cement.

Multichannel Recording in the Bilateral MC in Free-Moving Mice and Neurophysiological Data Analysis

For the multi-channel recording, move down the electrode arrays by twisting the screw on the movable part of the micro-drive system one day in advance. Hold the head of an awake mouse lightly and carefully. Then, link the center of the head stage and a helium balloon with a thread to offset the weight of the head stage and the micro-drive system.Capture raw signals using the recording electrodes and multi-channel systems by sampling at 30 kilohertz in the recording software. Then digitize using a digital analog converter from the multi-channel systems. Extract the local field potential, or LFP signals, from the raw data by re-sampling at 10 kilohertz.Then, using a notch filter, remove the 50-hertz line noise. For spike sorting and analysis, in the spike sorting software, click on File, then Open, and nev files to open the spike data sampled at 30 kilohertz. Click on Info to select the unsorted channel.Then choose Sort, Change Sort Method, and Use K-Means. Press the button Valley Seeking Sort, then K-Means Sorting to obtain the sorted units. Next, in the neurophysiological data analysis software, open the sorted spike file by clicking on File, Import Data, and BlackRock File.To obtain the autocorrelogram for the selected unit, click on Analysis, then Autocorrelograms, and set the parameters. Load the sorted spike data. Then, click on Analysis, and Interspike Interval Histograms to obtain the interspike interval histogram, and then set the desired parameters.Click on Analysis, then Crosscorrelograms to obtain the crosscorrelogram between two sorted unit events. And then set the reference events and parameters. For LFP analysis, click on File, Import Data, and BlackRock File, to open the continuous signal data sampled at 10 kilohertz.Then, by clicking Analysis and Spectrum for Continuous, analyze the power spectrum for the LFP from the selected channel. Next, click on Analysis, then Coherence for Continuous to analyze the coherence for two LFPs from the left and right sides of the MC.Then, click on Analysis, followed by Correlation with Continuous Variables to analyze the correlation between two LFPs from the left and right sides of the MC.Once done, click on Results, then Numerical Results to save the Power Spectrum Density, Coherence, and Correlation with a xls file name extension. To analyze correlations between the spike and LFP, click on File, then Import Data and BlackRock File to open the continuous signal data and spike data.Then, click on Analysis and Coherence Analysis to analyze the coherence between the spikes and LFP from the selected channel. Finally, click on Results, then Numerical Results to save the results of the spike field coherence with a xls file name extension. The valley width and waveform duration of the units in the MC of the mouse showed that both the valley width and waveform duration of the MC putative pyramidal neurons in mice are higher than those of the putative interneurons.The crosscorrelogram between putative pyramidal neurons and interneurons indicated that the putative pyramidal neurons spiking occurs before the putative interneurons with a window of 18 milliseconds. In the LFP analysis, the LFPs of the left and right MC in normal mice were similar in the power spectrum, suggesting synchronized activities between the left and right MC.Further, the coherence and correlation between the left and right MC were calculated. The curve of spike field coherence in the MC of a normal mouse showed a stronger low gamma coherence for the putative interneurons compared to the pyramidal neurons.