이 프로토콜을 개발하기 위한 작업은 미국 국립보건원(National Institutes of Health)[AR072609]의 지원을 받았습니다.

골절 감수성에 대한 기계적 검사의 원리와 프로토콜

<ol>
	<li>Vesper, E. O., Hammond, M. A., Allen, M. R., Wallace, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Even+with+rehydration,+preservation+in+ethanol+influences+the+mechanical+properties+of+bone+and+how+bone+responds+to+experimental+manipulation.">Even with rehydration, preservation in ethanol influences the mechanical properties of bone and how bone responds to experimental manipulation.</a> Bone. 97, 49-53 (2017).</li><li>Jepsen, K. J., Silva, M. J., Vashishth, D., Guo, X. E., van der Meulen, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+biomechanical+mechanisms+in+mouse+models:+practical+guidelines+for+systematically+evaluating+phenotypic+changes+in+the+diaphyses+of+long+bones.">Establishing biomechanical mechanisms in mouse models: practical guidelines for systematically evaluating phenotypic changes in the diaphyses of long bones.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 30 (6), 951-966 (2015).</li><li>Eds Burr, D. B., Allen, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Basic and Applied Bone Biology. , (2019).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> microCT SkyScan 1272 User Manual. , (2018).</li><li>Kim, Y., Brodt, M. D., Tang, S. Y., Silva, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroCT+for+scanning+and+analysis+of+mouse+bones.">MicroCT for scanning and analysis of mouse bones.</a> Methods in Molecular Biology. 2230, 169-198 (2021).</li><li>Bouxsein, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+assessment+of+bone+microstructure+in+rodents+using+micro-computed+tomography.">Guidelines for assessment of bone microstructure in rodents using micro-computed tomography.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 25 (7), 1468-1486 (2010).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Micro-CT specimen scanner, Centre for high-throughput phenogenomics. , (2023).</li><li>ASTM International. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Standard test method for flexural properties of unreinforced and reinforced plastics and electrical insulating materials by four-point bending. , (2020).</li><li>ASTM International. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Standard test methods for flexural properties of unreinforced and reinforced plastics and electrical insulating materials. , (2017).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bruker+microCT+NRecon:+An+overview.">Bruker microCT NRecon: An overview.</a> , (2023).</li></ol>

저자는 선언할 이해 상충이 없습니다.

스캔 및 테스트 프로세스 전반에 걸쳐 문제 해결 및 최적화가 적절한 순간이 있습니다. 첫 번째는 μCT를 사용하여 뼈를 스캔할 때 발생합니다. 많은 시스템에는 하나의 물체를 잡고 스캔할 수 있는 홀더가 함께 제공되지만 맞춤형 홀더를 제작하여 동시에 여러 뼈를 스캔할 수 있습니다. 여러 뼈를 스캔하는 것은 최적화를 위한 훌륭한 포인트가 될 수 있지만, 아티팩트가 유발되지 않도록 스캔 및 ?...

뼈의 기계적 검사는 골절에 대한 뼈의 민감도와 관련된 기능적 정보를 추출하는 주요 방법입니다. 전임상 연구에서는 여러 가지 검사 방식을 사용할 수 있지만 가장 일반적인 것은 긴 뼈를 구부리는 것입니다. 이 검사는 수행하기 쉬우며 사람에서 쥐에 이르기까지 다양한 크기의 뼈에 사용할 수 있습니다. 마우스는 전임상 연구에서 가장 일반적으로 연구되는 동물 중 하나이기 때문에 이 프로토콜은 마우스의 대퇴골과 경골에 수행되는 굽힘 테스트에 중점을 둘 것입니다.
굽힘 테스트를 수행하기 전에 뼈를 적절하게 채취하고 보관해야 합니다. 가장 일반적인 보관 방법은 전통적으로 식염수에 적신 거즈에 뼈를 얼리거나, 식염수만 넣거나, 에탄올에서 뼈를 탈수하는 것입니다 1. 에탄올에 저장된 골은 냉동 보관된 골에 비해 강성과 탄성 계수가 증가하고 변형 매개변수가 감소하는 것으로 나타났습니다1. 검사 전에 뼈에 수분을 보충해도 이러한 특성이 정상 수준 1로 회복되지 않습니다. 식염수에 담그면 식염수가 팽창할 때 압력이 가해지기 때문에 뼈가 손상될 수 있습니다. 또한 마이크로 컴퓨터 단층 촬영(μCT) 스캔을 위해 뼈를 제거하기 위해 용액을 완전히 해동해야 합니다. 결과적으로, 갓 채취한 뼈를 식염수에 적신 거즈에 냉동하는 것이 표준 보관 방법이 되었으며 이 프로토콜 전체에서 권장됩니다.
뼈의 크기와 모양이 뼈의 부피 강도에 영향을 미치고 많은 질병 모델이 뼈의 크기와 형태를 크게 변화시키기 때문에 공학적 원리를 사용하여 크기의 영향을 정규화하여 조직의 거동을 추정하는 특성을 생성한다2. 이 접근 방식에는 고장 위치의 단면 형상이 필요하며, 이는 테스트 전에 뼈를 스캔하기 위해 μCT를 사용하여 가장 일반적으로 획득됩니다. μCT는 가용성과 높은 이미지 해상도로 인해 널리 사용됩니다. 더욱이, 연조직의 기여는 포함되지 않으며, 스캐닝은 뼈에 대한 화학적 고정 또는 기타 변형을 필요로 하지 않는다 3,4. 모든 형태의 CT에서 X선 소스는 물체에 초점을 맞추고 물체의 반대쪽에 있는 검출기는 결과 X선 에너지를 측정합니다. 이것은 이미지 3,5로 변환될 수 있는 샘플의 X선 그림자를 생성합니다. 스캔되는 물체가 회전하여(또는 X선 소스와 검출기가 샘플 주위를 회전하여) 물체(5)를 나타내는 3차원 데이터 세트로 재구성될 수 있는 이미지를 생성합니다.
스캔 해상도 또는 두 물체가 얼마나 가까운지, 그리고 여전히 개별적으로 분해될 수 있는지는 공칭 복셀 크기 또는 결과 이미지의 픽셀 크기를 변경하여 제어됩니다. 일반적으로 객체는 단일 복셀의 두 배 이상의 크기여야 식별될 수 있지만3 비율이 높을수록 정밀도가 향상됩니다. 또한, 더 큰 복셀은 부분적인 부피 효과를 더 잘 나타낸다: 단일 복셀이 다양한 밀도의 조직을 포함할 때, 단일 조직의 특정 밀도가 아닌 이러한 밀도의 평균이 할당되며, 이는 조직 면적과 미네랄 밀도의 과대 또는 과소 평가로 이어질 수 있다3. 이러한 문제는 더 작은 복셀 크기를 선택하여 완화할 수 있지만, 더 높은 해상도를 사용한다고 해서 부분적인 볼륨 효과가 제거되는 것은 아니며 스캔 시간이 더 길어질 수 있습니다3. 생체 외 뼈를 스캔할 때 일반적으로 쥐 뼈의 섬유주 구조를 정확하게 평가하기 위해 6-10μm의 복셀 크기가 권장됩니다. 피질 뼈에는 10-17μm의 더 큰 복셀 크기를 사용할 수 있지만 가장 작은 합리적인 복셀 크기를 사용해야 합니다. 이 프로토콜은 10μm 복셀 크기를 사용하며, 이는 주요 섬유주 특성을 구별하고 긴 스캔 시간 없이 부분 부피 효과를 최소화할 수 있을 만큼 충분히 작습니다.
뼈 조직의 높은 미네랄 밀도와 두께는 투과된 X선 에너지 스펙트럼을 크게 감쇠시키고 변화시키기 때문에 X선 에너지 및 에너지 필터 설정도 신중하게 선택해야 합니다. 일반적으로 방출된 X-선 스펙트럼은 물체(6)를 빠져나가는 스펙트럼과 동일하기 때문에, 뼈와 같은 밀도가 높은 물체에 저에너지 X-선을 사용하면 빔 경화(beam hardening)7로 알려진 인공물이 발생할 수 있다고 가정된다. 이러한 아티팩트의 발생률을 줄이기 위해 뼈 샘플을 스캔할 때 50-70kVp의 더 높은 전압이 권장됩니다5. 또한 알루미늄 또는 구리 에너지 필터를 삽입하면 보다 집중된 에너지 빔이 생성되어 아티팩트 4,7을 더욱 최소화할 수 있습니다. 이 프로토콜 전체에서 0.5mm 알루미늄 필터가 사용됩니다.
마지막으로, 스캔 회전 단계 및 회전 길이(예를 들어, 180°-360°)는 함께 캡처된 이미지의 수를 제어하며, 이는 최종 스캔(4)에서 노이즈의 양을 결정한다. 각 단계에서 여러 프레임의 평균을 내면 노이즈를 줄일 수 있지만 스캔 시간이 늘어날 수 있습니다4. 이 프로토콜은 0.7도의 회전 단계와 2의 프레임 평균을 사용합니다.
스캐닝에 대한 마지막 참고 사항: 하이드록시아파타이트 보정 팬텀은 감쇠 계수를 g/cm 35 단위의 미네랄 밀도로 변환할 수 있도록 실험용 뼈와 동일한 스캔 설정을 사용하여 스캔해야 합니다. 이 프로토콜은 0.25 g/cm3 및 0.75 g/cm3 의 하이드록시아파타이트의 팬텀을 사용하지만 다른 팬텀을 사용할 수 있습니다. 일부 스캐닝 시스템은 일상적인 시스템 보정의 일부로 내부 팬텀을 사용합니다.
스캔이 완료되면 각도 투영은 일반적으로 제조업체와 함께 제공되는 소프트웨어를 사용하여 물체의 단면 이미지로 재구성됩니다. 어떤 시스템을 사용하든 재구성 시 전체 골격을 캡처하고 골격과 비본을 인식할 수 있도록 임계값을 적절하게 설정하는 것이 중요합니다. 재구성 후에는 모든 스캔을 3차원으로 회전하여 뼈가 가로축과 일관되고 적절하게 정렬되도록 하는 것이 중요하며, 다시 제조업체의 소프트웨어를 사용해야 합니다.
회전 후, 기계적 정규화를 위한 피질 특성, 섬유주 특성 또는 파괴 형상이 필요한지 여부에 따라 분석을 위한 관심 영역(ROI)을 선택할 수 있습니다. 후자의 경우 골절 부위에서 뼈의 한쪽 끝까지의 거리를 측정하고 복셀 크기를 사용하여 스캔 파일에서 해당 슬라이스 위치를 결정하여 테스트 후 ROI를 선택해야 합니다. 선택한 영역의 길이는 100μm 이상이어야 하며, 파괴점은 ROI의 대략적인 중심에 있어야 적절한 추정치를 얻을 수 있습니다4.
ROI를 선택한 상태에서 기계적 정규화(굽힘 응력 및 변형률 계산)를 위해서는 중립 굽힘 축에서 파손이 시작된 표면까지의 최대 거리(시험 설정에 의해 결정된 장력이 가해진 표면으로 가정)와 중립축 주위의 면적 관성 모멘트(테스트 설정에 따라 다름)의 두 가지 속성이 필요합니다. 이 프로토콜은 사용자 지정 코드를 사용하여 이러한 값을 결정하는 것이 좋습니다. 코드에 액세스하려면 교신 저자에게 직접 문의하거나 https://bbml.et.iupui.edu/ 의 랩 웹 사이트를 방문하여 자세한 내용을 확인하십시오.
μCT 스캔이 완료되면 기계적 테스트를 시작할 수 있습니다. 굽힘 시험은 4점 또는 3점 구성으로 수행할 수 있습니다. 4점 굽힘 시험은 하중 지점 사이의 뼈에서 전단 응력을 제거하여 이 영역에서 순수한 굽힘이 발생할 수 있도록 하기 때문에 선호됩니다3. 그러면 뼈는 장력으로 인해 골절되어 뼈의 진정한 굽힘 특성을 더 잘 나타내는 실패를 만듭니다3. 그러나 뼈는 두 로딩 지점에서 동일한 로드를 전달하는 방식으로 로드되어야 합니다(이는 피봇팅 로딩 헤드로 촉진될 수 있음). 3점 굽힘 시험에서 하중점이 뼈와 만나는 전단 응력에 큰 변화가 있으며, 이로 인해 이 지점에서 인장3이 아닌 전단으로 인해 뼈가 파손됩니다. ASTM 표준은 굽힘을 받는 재료의 길이 대 너비 비율이 16:1이어야 하며, 이는 전단 8,9의 영향을 최소화하기 위해 지지 스팬의 길이가 뼈 너비보다 16배 더 커야 함을 의미합니다. 이것은 작은 설치류 뼈를 테스트할 때 달성이 불가능한 경우가 많기 때문에 로딩 스팬은 가능한 한 크게 만들되 단면 모양의 변화는 최대한 작게 만듭니다. 또한 4점 굽힘을 수행할 때 하부 스팬과 상부 스팬의 길이 사이의 비율은 ~3:18이어야 하며, 이는 일반적으로 경골에서 달성할 수 있지만 짧은 대퇴골에서는 어렵습니다. 또한 대퇴골의 피질 벽이 얇기 때문에 시험 중에 뼈 단면의 모양이 변하는 고리형 변형에 취약합니다(3점 굽힘에 비해 동일한 굽힘 모멘트를 유도하려면 더 큰 힘이 필요하기 때문에 4점 시험에서 강조될 수 있음). 따라서 이 프로토콜 전체에서 마우스 대퇴골에는 3점 굽힘이 사용되고 경골에는 4점 굽힘이 사용됩니다.
마지막으로, 통계 분석을 위해 연구를 적절하게 강화하는 것이 중요합니다. 기계적 테스트에 대한 일반적인 권장 사항은 일부 기계적 특성, 특히 항복 후 매개변수가 매우 가변적일 수 있으므로 차이를 감지할 수 있도록 실험 그룹당 10-12개의 뼈 표본 크기를 갖는 것입니다. 어떤 경우에는 연구 중에 발생할 수 있는 감소를 감안할 때 더 높은 동물 표본 크기로 시작하는 것을 의미할 수 있습니다. 연구를 시도하기 전에 기존 데이터를 사용한 표본 크기 분석을 완료해야 합니다.
많은 한계와 가정이 있지만, 굽힘 시험은 특히 그룹 간의 상대적 차이가 중요한 경우 매우 정확한 결과를 제공할 수 있습니다. 이러한 특성은 섬유주 구조 및 피질 형태 분석과 함께 질병 상태 및 치료 요법에 대한 더 나은 통찰력을 제공할 수 있습니다. 우리가 통제할 수 있는 실험의 측면(예: 수집, 저장, 스캔 및 테스트)에 주의를 기울이면 정확한 결과가 생성되었다는 확신을 가질 수 있습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>CTAn</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>NA</td>
			<td>CT Scan Analysis Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DataViewer</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>NA</td>
			<td>CT Scan Rotation Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrix Laboratory (MATLAB) 2023a</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>NA</td>
			<td>Coding platform used for data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NRecon</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>NA</td>
			<td>CT Scan Reconstruction software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SKYSCAN 1272-100 kV w/ 16 MP CCD detector, incl 3D Suite Software&#160;&#160;</td>
			<td>Micro Photonics Inc</td>
			<td>SKY-016814</td>
			<td>Micro-CT system that can non-destructively visualize up to 209 mPs in every virtual slice through an object&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

practical considerations for the design, execution, and interpretation of studies involving whole-bone bending tests of rodent bones

골절로 이어지는 골격계 취약성은 매년 150만 건의 골절과 180억 달러의 직접 치료 비용을 초래하는 미국의 공중 보건 위기입니다. 뼈 질환의 기저와 치료에 대한 반응을 이해하는 능력은 바람직할 뿐만 아니라 매우 중요합니다. 뼈의 기계적 검사는 골절에 대한 뼈의 민감도를 이해하고 정량화하는 데 유용한 기술입니다. 이 방법은 수행하기가 간단해 보이지만 사용자가 관리 가정과 주요 단계를 무시하는 경우 부적절하고 부정확한 결론에 도달할 수 있습니다. 이는 방법의 오용과 결과의 잘못된 해석으로 연구가 계속 발표됨에 따라 학문 전반에 걸쳐 관찰되었습니다. 이 프로토콜은 시료 크기 고려부터 조직 채취 및 저장, 데이터 분석 및 해석에 이르기까지 이러한 기술의 적용과 함께 기계적 테스트와 관련된 원칙에 대한 입문서 역할을 합니다. 이를 통해 뼈의 골절 민감성에 대한 귀중한 정보를 얻을 수 있어 학술 연구와 임상 솔루션 모두에 대한 이해를 높일 수 있습니다.

Mechanical testing of bone is the primary method to extract functional information related to a bone&#39;s susceptibility to fracture. In preclinical studies, several testing modalities can be used but by far the most common is the bending of long bones. These tests are easy to perform and can be used on bones ranging in size from human to mouse. As mice are one of the most commonly studied animals in preclinical research, this protocol will focus on bending tests performed on the femora and tibiae of mice.
Prior to performing bending tests, bones must be properly harvested and stored. The most common storage methods have traditionally been freezing bones in saline-soaked gauze, freezing in saline alone, or dehydrating bones in ethanol 1. Bones stored in ethanol have been shown to have increased stiffness and elastic modulus and decreased deformation parameters versus those stored frozen1. Even rehydrating the bones prior to testing does not recover these properties back to normal levels 1. Storing submerged in saline could cause damage to the bone since pressure is exerted as the saline expands. In addition, a complete thaw of the solution would be required to remove the bones for microcomputed tomography (&#181;CT) scanning. Consequently, freezing freshly harvested bones in saline-soaked gauze has become the standard storage method and is recommended throughout this protocol.
Because the size and shape of a bone affect its bulk strength and many disease models significantly alter bone size and morphology, engineering principles are used to normalize away the effects of size to produce properties that estimate the behavior of the tissue2. This approach requires cross-sectional geometry of the failure location, which is most commonly acquired using &#181;CT to create scans of the bones prior to testing. &#181;CT is widely used due to its availability and high image resolution. Moreover, contributions of soft tissue are not included, and scanning does not require chemical fixation or other modifications to the bone3,4. In all forms of CT, an X-ray source is focused on an object while a detector on the other side of the object measures the resulting X-ray energy. This produces an X-ray shadow of the sample that can be converted into an image3,5. The object being scanned is rotated (or the X-ray source and detector are rotated around the sample), generating images that can be reconstructed into a three-dimensional data set representing the object5.
Scan resolution, or how close together two objects can be and still be resolved individually, is controlled by changing the nominal voxel size or the size of a pixel in the resulting image. It is generally accepted that objects must be at least two times the size of a single voxel to be identified3, but a higher ratio will allow for improved precision. Further, larger voxels are more prone to partial volume effects: when a single voxel contains tissues of varying densities, it is assigned the average of these densities, rather than the specific density of a single tissue, which may lead to an over- or under-estimation of tissue areas and mineral density3. While these issues can be mitigated by choosing smaller voxel sizes, using a higher resolution does not ensure the elimination of partial volume effects and may require longer scan times3. When scanning bones ex vivo, a voxel size of 6-10 &#181;m is generally recommended to accurately assess the trabecular architecture of mouse bones. A larger voxel size of 10-17 &#181;m can be used for cortical bone, although the smallest reasonable voxel size should be used. This protocol uses a 10 &#181;m voxel size, which is small enough to differentiate key trabecular properties and minimize partial volume effects without extensive scan time.
X-ray energy and energy filter settings must also be selected carefully, as the high mineral density and thickness of bone tissue greatly attenuates and alters the transmitted X-ray energy spectrum. It is generally assumed that because the emitted X-ray spectrum is equivalent to the spectrum that exits the object6, using low-energy X-rays on dense objects such as bone can lead to an artifact known as beam hardening7. A higher voltage of 50-70 kVp is recommended when scanning bone samples to reduce the incidence of these artifacts5. In addition, inserting an aluminum or copper energy filter creates a more concentrated energy beam, further minimizing artifacts4,7. A 0.5 mm aluminum filter will be used throughout this protocol.
Finally, the scan rotation step and rotation length (e.g., 180&#176;-360&#176;), together control the number of images captured, which determines the amount of noise in the final scan4. Averaging multiple frames in each step can reduce noise but may increase scan time4. This protocol uses a rotation step of 0.7 degrees and a frame averaging of 2.
One final note about scanning: hydroxyapatite calibration phantoms should be scanned using the same scan settings as the experimental bones to enable the conversion of attenuation coefficients to mineral density in g/cm35. This protocol uses phantoms of 0.25 g/cm3 and 0.75 g/cm3 of hydroxyapatite, although different phantoms are available. Note that some scanning systems use internal phantoms as part of daily system calibration.
Once scanning is complete, the angular projections are reconstructed into cross-sectional images of the object, typically using the manufacturer&#39;s accompanying software. Whatever system is used, it is important to ensure that the whole bone is captured in the reconstruction and that thresholding is set appropriately to allow for the recognition of bone versus non-bone. After reconstruction, it is critical to rotate all scans in three dimensions so that bones are oriented consistently and properly aligned with the transverse axis, again using the manufacturer&#39;s software.
Following rotation, regions of interest (ROI) for analysis may be selected based on whether cortical properties, trabecular properties, or fracture geometry for mechanical normalization are desired. For the latter, ROIs should be selected after testing by measuring the distance from the fracture site to one end of the bone and using voxel size to determine the corresponding slice location in the scan file. The selected region should be at least 100 &#181;m in length, with the fracture point at the approximate center of the ROI, to provide adequate estimation4.
With ROIs selected, two properties are needed for mechanical normalization (to calculate bending stress and strain): the maximum distance from the neutral bending axis to the surface where failure is initiated (assumed to be the surface loaded in tension, determined by the testing setup), and the area moment of inertia around the neutral axis, (also dependent on testing setup). This protocol recommends the use of a custom code to determine these values. For access to the code, contact the corresponding author directly or visit the lab website at&#160;https://bbml.et.iupui.edu/ for more information.
Once &#181;CT scanning has been completed, mechanical testing can begin. Bending tests can be performed in either four-point or three-point configurations. Four-point bending tests are preferred as they eliminate shear stress in the bone between loading points, allowing for pure bending to occur in this region3. The bone will then fracture due to tension, creating a failure that is more representative of the true bending properties of the bone3. However, the bone must be loaded in such a way as to deliver the same load at both loading points (this can be facilitated with a pivoting loading head). In three-point bending tests, there is a large change in shear stress where the load point meets the bone, which causes the bone to break at this point due to shear, not tension3. ASTM standards recommend materials undergoing bending should have a length-to-width ratio of 16:1, meaning the length of the support span should be 16 times larger than the width of the bone to minimize impacts of shear8,9. This is often impossible to achieve when testing small rodent bones, so the loading span is simply made as large as possible but with as small of a change in cross-sectional shape as possible. Moreover, when performing four-point bending, the ratio between the lengths of the lower and upper span should be ~3:18, which can usually be achieved in the tibia, but it is difficult in the shorter femur. In addition, the thinner cortical walls of femurs make them susceptible to ring-type deformation which changes the shape of the bone cross-section during the test (this can be accentuated in four-point tests as a greater force is required to induce the same bending moment compared to three-point bending). Therefore, three-point bending will be utilized for mouse femora while four-point bending will be used for tibiae throughout this protocol.
Finally, it is important to properly power the study for statistical analysis. A general recommendation for mechanical testing is to have a sample size of 10-12 bones per experimental group to be able to detect differences, as some mechanical properties, especially postyield parameters, can be highly variable. In some cases, this may mean starting with a higher animal sample size given attrition that could occur during the study. Sample size analysis using existing data should be completed prior to attempting a study.
There are numerous limitations and assumptions, but bending tests can provide quite accurate results, especially when relative differences between groups are of interest. These properties, together with the analysis of trabecular architecture and cortical morphology, can provide better insight into disease states and treatment regimens. If care is taken with those aspects of the experiment that are in our control (e.g., harvesting, storing, scanning, and testing), we can feel confident that accurate results have been generated.

저자 스포트라이트: Enhancing Accuracy and Reproducibility in Whole Bone Bending Tests(전체 뼈 굽힘 검사의 정확성 및 재현성 향상) 

설치류 뼈의 전체 뼈 굽힘 시험과 관련된 연구의 설계, 실행 및 해석에 대한 실용적인 고려 사항

The current experimental challenges of bending tests include:Consistent placing of the bones in the same orientation, documenting the break progress of the bone during the test, and interpretation of complex results. Our protocol provides a guide not only for the testing procedure and data analysis for whole-bone bending tests, but also for sample preparation and storage. And this is the first instance where the entire protocol has been presented.Whole-bone mechanical testing is a quick and simple method to obtain measures of bone fracture susceptibility when compared to other testing methods.

CT 스캔이 완료되면 대부분의 부적절한 스캔이 재구성 중에 발견될 수 있습니다. 종종 불량한 스캔은 스캔 중 오류의 명확한 지표인 높은 정렬 불량 보정을 갖습니다. 그러나 다른 단계에서 오류가 발생할 수 있으며 데이터가 부정확해질 수도 있습니다. 이러한 오류는 계산된 개별 아키텍처 속성을 검사할 때 종종 발견될 수 있습니다. 값이 그룹의 다른 범위에서 멀리 벗어나면 스캔, ROI 및 속성 계...

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설치류 뼈의 기계적 검사는 뼈의 골절 민감도에 관한 정보를 추출하는 데 유용한 방법입니다. 적절한 실제적 이해가 부족하면 결과가 과도하게 해석되거나 타당성이 부족할 수 있습니다. 이 프로토콜은 유효하고 기능적인 데이터를 제공하기 위해 기계적 테스트가 정확하게 수행되도록 하는 가이드 역할을 합니다.

Skeletal fragility leading to fracture is an American public health crisis resulting in 1.5 million fractures each year and $18 billion in direct care ...

굽힘 시험의 현재 실험적 과제는 다음과 같습니다: 뼈를 동일한 방향으로 일관되게 배치하고, 시험 중 뼈의 파손 진행 상황을 문서화하고, 복잡한 결과를 해석하는 것입니다. 당사의 프로토콜은 전체 뼈 굽힘 테스트를 위한 테스트 절차 및 데이터 분석뿐만 아니라 샘플 준비 및 보관을 위한 가이드를 제공합니다. 그리고 이것은 전체 프로토콜이 제시된 첫 번째 사례입니다.전체 뼈 기계적 검사는 다른 검사 방법과 비교할 때 골절 감수성을 측정하는 빠르고 간단한 방법입니다.

practical-considerations-for-design-execution-interpretation-studies

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Practical Considerations for the Design, Execution, and Interpretation of Studies Involving Whole-Bone Bending Tests of Rodent Bones

581 조회수.  Indiana University-Purdue University Indianapolis. 굽힘 시험의 현재 실험적 과제는 다음과 같습니다: 뼈를 동일한 방향으로 일관되게 배치하고, 시험 중 뼈의 파손 진행 상황을 문서화하고, 복잡한 결과를 해석하는 것입니다. 당사의 프로토콜은 전체 뼈 굽힘 테스트를 위한 테스트 절차 및 데이터 분석뿐만 아니라 샘플 준비 및 보관을 위한 가이드를 제공합니다. 그리고 이것은 전체 프로토콜이 제시된 첫 번째 사례입니다.

비디오: 저자 스포트라이트: Enhancing Accuracy and Reproducibility in Whole Bone Bending Tests(전체 뼈 굽힘 검사의 정확성 및 재현성 향상) 

Skeletal fragility leading to fracture is an American public health crisis resulting in 1.5 million fractures each year and $18 billion in direct care costs. The ability to understand the mechanisms underlying bone disease and the response to treatment is not only desired, but critical. Mechanical testing of bone serves as a valuable technique for understanding and quantifying a bone&#39;s susceptibility to fracture. While this method appears simple to perform, inappropriate and inaccurate conclusions may be reached if governing assumptions and key steps are disregarded by the user. This has been observed across disciplines as studies continue to be published with misuse of methods and incorrect interpretation of results. This protocol will serve as a primer for the principles associated with mechanical testing along with the application of these techniques-from considerations of sample size through tissue harvesting and storage, to data analysis and interpretation. With this in hand, valuable information regarding a bone&#39;s susceptibility to fracture may be obtained, furthering understanding for both academic research and clinical solutions.

Mechanical testing of rodent bones is a valuable method for extracting information regarding a bone's susceptibility to fracture. Lacking proper practical understanding, the results may be overinterpreted or lack validity. This protocol will serve as a guide to ensure mechanical tests are performed accurately to provide valid and functional data.

연구

생체공학

Mechanical Testing Procedure to Check Bone&#39;s Susceptibility to Fracture

Mechanical Testing Procedure to Check Bone&#039;s Susceptibility to Fracture  

After harvesting the femur and tibia from the euthanized mouse, obtain a six to 10 micrometer resolution micro CT scan reconstructed for each sample to calculate for exercise geometry. Thaw all the bones for testing, and ensure to test all bones from the same experiment in one session. Now locate a load cell with sensitivity and capacity suitable for the specimen.Considering the failure range of the specimen, select a load cell with 50%more capacity while maximizing sensitivity. Locate the loading and support span fixtures. Install the load cell and fixtures by screwing the load cell onto the upper support of the tester, attaching the upper loading fixture to the load cell and mounting the lower fixture to the bottom support of the tester.Then select a support span length, which will remain constant for all samples. Use the shortest bone in the sample set to determine the support span distance, and properly orient the bone between the fixtures. To perform a three-point bending test of the femur.place the anterior surface of the bone against the support span, ensuring the position is within the diaphysis of the sample. Exclude the third trochanter on the proximal end and the transition point where the bone widens into the metaphysis and condyles on the distal end. Ensure the loading span is centered within the support span and contains a uniform region of the bone.Then measure and record the support span distance. Once the support span has been set and recorded, bring the lower fixture close to the upper fixture with enough room between the two for a bone to be placed. Place the bone back into saline or rehydrated with a saline bolus.Ensure all fixture parts are tight and free of movement. In the mechanical tester software, design a bending test profile with a slow displacement ramp rate to avoid viscoelastic effects to load the bone until it fails. After creating a testing profile, create distinct folders for every study group.Select a properly thawed bone, then measure and record its full length using calipers. Load the bone sample onto the fixture in the proper orientation. Alter the file name to reflect the particulars of the sample being tested and save each test in its corresponding folder.Zero the load and activate the system's mover, ensuring it's not in load or displacement control. Carefully apply a slight preload to the bone to secure its position. Avoid compromising the sample.Aim for a preload of about 0.25 Newtons. Make sure the desired bone orientation is kept consistent before moving forward. Hydrate the sample by generously dousing it with saline.On the software, initiate the bending test by selecting start or run. It's crucial to observe the sample for the duration of the test accurately, noting down any occurrences of issues. Monitor closely as the bone starts to fracture.Tests stop automatically when they reach their set limits. But if there's a failure, stop the test manually to avoid damaging the load cell. Once testing is complete, measure the length from the distal end to the breakpoint using calipers and record it.