이 연구는 미국 국립안과연구소(National Eye Institute, NEI)와 국립안과학연구소(National Eye Institute, NEI) 기금 R01 EY029751-04의 지원을 받았습니다. 이 프로토콜은 Müller 세포 분리 프로토콜에 따라 수정된 버전인 Sylvia B. Smith 박사에게 감사드립니다.

동물을 대상으로 한 모든 실험은 안과 및 시력 연구에서의 동물 사용에 대한 ARVO 성명을 준수했으며 IACUC(Institute for Animal Care and Use Committee) 및 오클랜드 대학교 정책(프로토콜 번호 2022-1160)에서 승인한 동물 프로토콜에 따라 수행되었습니다.
1. 매체 및 용액 준비
<ol><li>1:1000으로 희석하여 Dulbecco Modified Eagle Medium(DMEM, 재료 표의 세부 정보)을 페니실린/스트렙토마이신으로 보충하여 Müller 세포 안구 용액을 준비합니다. 예를 들어, DMEM 10mL의 경우 페니실린/스트렙토마이신 10μL를 추가합니다. 참고: 이 제품은 제조된 간단한 무혈청 배지입니다. 또한 세포 배양 작업에 사용하기 전에 전체 배지를 37°C 수조에서 데우십시오.</li>
	<li>DMEM에 10% 소 태아 혈청(FBS, 열 비활성화) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신을 보충하여 완전한 1차 Müller 세포 성장 배지를 준비합니다. 예: (DMEM 배지 500mL + FBS 50mL + 페니실린/스트렙토마이신 5mL).</li>
	<li>200U/mL 농도의 콜라겐분해효소 IV와 함께 0.05% 트립신-EDTA 용액을 준비합니다(트립신-EDTA는 필요한 농도에 도달하기 위해 계산된 양의 콜라겐분해효소 IV 분말을 용해하는 데 사용됨).</li>
</ol>2. 적출
<ol><li>IACUC 지침에 따라 CO2 흡입을 사용하여 마우스를 윤리적으로 안락사시킵니다.<ol><li>간단히 말해서, 동물을 CO2 챔버에 넣어 100 % CO2 를 CO2 로 챔버 부피 / 분의 30-70 %의 충전 비율로 도입하여 마우스에 대한 고통을 최소화하면서 2-3 분 이내에 빠른 무의식 목표를 달성합니다.</li>
		<li>생쥐는 어린 나이(~10일)이기 때문에 적절한 안락사를 보장하기 위한 2차 방법으로 자궁경부 탈구를 수행합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>작업 영역을 70% 에탄올로 멸균한 후 멸균 언더패드에 마우스를 놓습니다.</li>
	<li>핀셋의 팔을 눈 뒤쪽에 위치시키고 안와 부위를 부드럽게 잡아 당겨 눈을 추출하고 5/45 스타일의 핀셋으로 안와 부위에 압력을 가하여 눈을 적출하여 돌출부를 일으킵니다. 알림: 해부 전에 70% 에탄올로 해부 도구를 소독한 다음 인산염 완충 식염수로 소독하십시오.</li>
	<li>눈을 천천히 적출하여 시신경이 여전히 눈과 연결되어 있는지 확인하십시오. 시신경(시각적으로 흰색 끈으로 식별됨)을 눈 뒤로 당겨야 합니다. 참고: 이 단계는 현미경으로 수행할 필요가 없으며 멸균된 벤치에서 수행할 수 있습니다.</li>
</ol>3. 적출된 눈의 치료
<ol><li>15mL 원심분리기 튜브를 알루미늄 호일로 덮고 튜브에 10mL의 Müller cell eye 용액을 채웁니다.</li>
	<li>절개된 눈을 Müller 세포 안구 용액이 들어 있는 15mL 튜브에 넣고 실온에서 하룻밤 또는 약 18시간 동안 그대로 둡니다.</li>
	<li>18시간 후 아이 용액을 디캔팅하고 따뜻한(37°C) 인산염 완충 식염수(PBS) 2-3mL로 눈을 잠시 헹굽니다.</li>
	<li>PBS를 디캔팅하고 눈을 10mL의 트립신 용액이 들어 있는 100mm 페트리 접시로 이동합니다. (1.3 단계에서 준비). 참고: 트립신은 적출된 눈 전체에 사용되며, 박리 중에 망막층에서 세포를 분리하는 것을 용이하게 하는 해리제 역할을 합니다. 절개된 망막에는 RPE 세포를 포함한 많은 세포가 있는데, 이 세포들은 끈적거리고 Müller 세포 배양을 오염시킬 가능성이 가장 높다14. 현미경 검사는 5일 동안 분리한 후(첫 번째 배지 교체 중) RPE 세포가 플레이트에서 분리되어 죽었다는 것을 명확하게 보여주었습니다13. RPE 분리에 사용되는 배지는 DMEM/F-12이며, DMEM(Müller 세포 분리에 사용)과 조성이 다르며 피루브산나트륨과 저포도당을 함유하고 있습니다.</li>
	<li>접시를 인큐베이터에 넣고 37 ° C 및 5 % CO2 에서 1.5-2 시간 동안 배양합니다.</li>
	<li>배양 후 약 5mL의 완전한 1차 Müller 세포 성장 배지가 들어 있는 60mm 페트리 접시에 눈을 옮깁니다.</li>
</ol>4. 해부
참고: 이 절차는 배양 후드의 멸균 환경에서 수행해야 합니다. 따라서 모든 도구 및 해부 현미경과 함께 후드 표면을 70% 알코올로 철저히 살균하는 것이 중요합니다. 비디오는 더 나은 가시성과 더 명확한 시연 목적을 위해 후드 외부에서 녹화되었다는 점은 주목할 가치가 있습니다.
<ol><li>멸균된 실험실 등급 조직의 작은 조각을 접시에 넣어 해부 중에 눈을 안정시키는 데 도움이 됩니다. 눈을 해부 현미경 아래에 놓고 해부를 시작합니다. 알림: 실험실 등급의 조직을 사용하면 액체가 채워진 접시(완전한 미디어)에서 눈의 움직임을 용이하게 하여 정확한 절개를 보장합니다.</li>
	<li>Vannas 가위와 M5S 스타일 핀셋을 사용하여 결합 조직, 외안근 및 시신경을 제거합니다.<ol><li>M5S 스타일 핀셋으로 눈을 잡고 Vannas 가위 또는 주사기 바늘로 ora serrata 부분을 절개합니다. 참고: 눈의 앞쪽과 뒤쪽 부분 사이에는 오라 세라타(ora serrata)라고 하는 연한 파란색 원형 선이 있으며, 이는 절개 중 정확한 방향을 위한 랜드마크로 사용할 수 있습니다.</li>
		<li>M5S 스타일의 핀셋으로 절개 부위를 잡고 눈의 뒤쪽에서 각막을 당기거나 찢습니다. 망막의 무결성이 손상되지 않도록 조금씩 당깁니다. 참고: 이 단계는 안구의 뒤쪽 부분(신경 및 색소 망막)에서 눈의 앞부분(각막, 홍채 및 수정체)을 제거하는 것입니다.</li>
		<li>망막층의 온전함을 유지하려면 신경 망막에서 망막 색소 상피를 부드럽게 당겨 제거합니다. 신경 망막은 가능한 한 격리의 순도를 보장하기 위해 검은 반점이 없어야 하는데, RPE 층은 일반적으로 끈적거리고 신경 망막에 붙어 있기 때문입니다.</li>
		<li>절개된 신경 망막을 작은 조각으로 잘라 접시에 모아 접시에 세포가 균일하게 퍼지도록 합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>4mL의 완전한 1차 Müller 세포 성장 배지가 들어 있는 T25 플라스크에 신경 망막을 플레이트합니다.</li>
	<li>마지막으로 플라스크를 인큐베이터에 넣고 37 ° C 및 5 % CO2 에서 배양합니다.</li>
</ol>5. primary Müller glial cell의 배양
<ol><li>세포 성장을 촉진하기 위해 3-5일 동안 플라스크를 움직이지 마십시오.</li>
	<li>5일째 되는 날과 그 이후에는 세포가 90% 합류할 때까지 격일로 매체를 교체합니다.</li>
</ol>6. 일차 Müller 신경교세포(primary Müller glial cells)의 passaging
<ol><li>Müller 세포 배양 배지를 흡인한 다음 PBS에서 2mL의 세척을 하고 PBS를 흡인합니다. 0.25% 트립신-EDTA(1x) 2mL 또는 플레이트를 덮을 만큼의 첨가합니다.</li>
	<li>실온에서 5-10분 동안 배양합니다.</li>
	<li>현미경 아래의 플레이트에서 셀이 분리되었는지 확인합니다. 그런 다음 세포 현탁액을 수집하고 4mL의 사전 따뜻한(37°C) 완전한 1차 Müller 세포 성장 배지(1.2단계에서 준비)를 수집 튜브에 추가합니다.</li>
	<li>300 x g에서 7분 동안 원심분리기. 상층액을 흡인한 후 펠릿을 10mL의 완전한 1차 Müller 세포 성장 배지에 재현탁시킵니다. 세포 수는 절개된 눈의 수에 따라 달라질 수 있기 때문에 파종 및 배양 전에 세포를 세는 것이 좋습니다. 권장되는 파종 밀도는 T75 플라스크에서 3.0 x 106 셀입니다. 알림: 세포는 최대 4-5회까지 통과할 수 있습니다. 그러나 가장 일관된 실험 결과는 1-2 구절 후에 발견됩니다.</li>
</ol>7. 면역형광(Immunofluorescence)
참고: 면역형광 프로토콜을 사용하여 Müller 세포 특이성을 염색하고 검증하십시오. 다음은 immunofluorescent protocol에 대한 간략한 개요입니다. 이 단계는 첫 번째 구절12 이후에 수행됩니다.
<ol><li>세포를 Cell Culture Chamber Slide(8웰 챔버 슬라이드의 경우 웰당 30,000개의 세포)에 파종합니다.</li>
	<li>37 ° C 및 5 % CO2 에서 완전한 Müller 세포 배양 배지 (단계 1.2에서 준비)에서 24-48 시간 동안 분리 된 세포를 배양합니다.</li>
	<li>매체를 흡인하고 셀이 250-300% 합류할 때 각 웰에 1x PBS의 250-90μL로 챔버 슬라이드를 세척합니다.</li>
	<li>각 웰의 250-300 μL에 4% 파라포름알데히드를 넣고 10-15분 동안 슬라이드를 고정한 다음 PBS/TX-100(각 5분/3회)으로 세척합니다.</li>
	<li>37°C에서 1시간 동안 차단 버퍼를 추가합니다( 재료 표 참조).</li>
	<li>차단 용액을 흡인한 다음 Müller 세포에 특이적인 1차 항체를 추가하여 글루타민 합성효소 및 비멘틴 5,12를 사용하여 분리된 세포의 순도를 확인합니다. 37 °C에서 3 시간 동안 배양합니다 (150-200 μL/slide 부피의 차단 완충액에서 1:100-1:200의 항체 농도 사용). PBS/TX-100 세척(각 5분 및 10분)으로 슬라이드를 세척합니다. 참고: 이러한 항체는 Müller 세포를 식별하고 Müller 세포 배양의 성공과 순도를 보장하기 위한 특징이기 때문에 선택되었습니다.</li>
	<li>2차 항체(150-200 μL/슬라이드의 차단 완충액에서 1:1000 범위의 항체 농도)를 추가하고 37°C에서 1시간 동안 배양합니다. 그런 다음 PBS/Triton X-100으로 3회(각 5-10분) 세척합니다.</li>
	<li>커버슬립으로 슬라이드를 덮기 전에 DAPI 장착 매체 한 방울을 적용하여 핵에 라벨을 붙입니다. 커버슬립을 놓을 때 기포를 피하십시오.</li>
	<li>형광 현미경을 사용하여 슬라이드를 확인하고 이미지를 캡처합니다( 재료 표 참조). 참고: 셀은 10x 배율에서 359/461 (예: 10x 배율)에서 DAPI로 위치합니다. 더 높은 배율은 세포를 캡처할 수 있습니다. 다른 파장은 선택한 색상에 따라 다릅니다. 녹색(GFP)- 예: 488/510. 붉은 색 (Cy3) - 예 / em 555/569.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Liu, Y., Wang, C., Su, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+signaling+in+m&#252;ller+glia:+Progenitor+cells+for+regenerative+and+neuroprotective+responses+in+pharmacological+models+of+retinal+degeneration.">Cellular signaling in m&#252;ller glia: Progenitor cells for regenerative and neuroprotective responses in pharmacological models of retinal degeneration.</a> J Ophth. 2019, 5743109 (2019).</li><li>Goldman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M&#252;ller+glial+cell+reprogramming+and+retina+regeneration.">M&#252;ller glial cell reprogramming and retina regeneration.</a> Nat Rev Neurosci. 15 (7), 431-442 (2014).</li><li>Hamon, A., Roger, J. E., Yang, X. -. J., Perron, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M&#252;ller+glial+cell-dependent+regeneration+of+the+neural+retina:+An+overview+across+vertebrate+model+systems.">M&#252;ller glial cell-dependent regeneration of the neural retina: An overview across vertebrate model systems.</a> Dev Dyn. 245 (7), 727-738 (2016).</li><li>Kobat, S. G., Turgut, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Importance+of+M&#252;ller+cells.">Importance of M&#252;ller cells.</a> Beyoglu Eye J. 5 (2), 59-63 (2020).</li><li>Liu, X., Tang, L., Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+M&#252;ller+cell+isolation+and+culture.">Mouse M&#252;ller cell isolation and culture.</a> Bio Protoc. 7 (15), e2429 (2017).</li><li>Bringmann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M&#252;ller+cells+in+the+healthy+and+diseased+retina.">M&#252;ller cells in the healthy and diseased retina.</a> Prog Ret Eye Res. 25 (4), 397-424 (2006).</li><li>de Melo Reis, R. A., Ventura, A. L. M., Schitine, C. S., de Mello, M. C. F., de Mello, F. 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H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ultrastructure+of+isolated+glial+(M&#252;ller)+cells+from+the+turtle+retina.">The ultrastructure of isolated glial (M&#252;ller) cells from the turtle retina.</a> Anat Rec. 202 (2), 275-283 (1982).</li><li>Shanmugam, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progesterone+receptor+membrane+component+1+(PGRMC1)+expression+in+murine+retina.">Progesterone receptor membrane component 1 (PGRMC1) expression in murine retina.</a> Curr Eye Res. 41 (8), 1105-1112 (2016).</li><li>Moustafa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=12-HETE+activates+M&#252;ller+glial+cells:+The+potential+role+of+GPR31+and+miR-29.">12-HETE activates M&#252;ller glial cells: The potential role of GPR31 and miR-29.</a> Prostag Oth Lipid M. 171, 106805 (2024).</li><li>Pereiro, X., Ruzafa, N., Acera, A., Urcola, A., Vecino, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+a+method+to+isolate+and+culture+adult+porcine,+rats+and+mice+m&#252;ller+glia+in+order+to+study+retinal+diseases.">Optimization of a method to isolate and culture adult porcine, rats and mice m&#252;ller glia in order to study retinal diseases.</a> Front Cell Neurosci. 14, 7 (2020).</li></ol>

저자는 이 문서의 내용과 관련이 있다고 선언할 이해 상충이 없습니다.

생쥐에서 원발성 망막 색소 상피(RPE)를 분리하는 것은 이전에 우리 연구실에서 문서화되었습니다. 이 원고는 1차 Müller 세포 분리를 위한 자세한 시연 프로토콜을 설명합니다. 이 절차에는 쥐의 눈에서 분리한 Müller 세포의 적출, 치료, 절개, 수집, 파종, 배양 및 특성 분석이 포함됩니다. 이는 이전 간행물에서 발견된 이전에 성공한 프로토콜과 최근 간행물1 ...

뮐러 세포(Müller cell, MC)는 망막 조직에서 발견되는 가장 풍부하고 주요한 신경교세포(glial cell)입니다. 그들은 망막 내에서 구조적 무결성과 대사 기능을 제공하는 데 핵심적인 역할을 합니다1. MC의 전략적 구조는 망막 두께 전체에 퍼져 있어 망막을 지지합니다. 스캐폴드와 같은 특성 외에도 망막 뉴런의 대사 기능을 가지고 있어 포도당과 젖산을 포함한 에너지 기질을 공급합니다. 이러한 기능은 건강한 신경 기능을 유지하는 데 매우 중요합니다. 손상된 MC는 연령 관련 황반 변성, 당뇨병성 망막병증 및 녹내장을 포함한 다양한 망막 질환에 기여하는 것으로 보고되었습니다 2,3. MC는 망막의 재생 치료를 위한 내인성 세포 공급원이 될 수 있다1. 이들은 또한 망막의 상당 부분을 구성하며, 강력한 증거에 따르면 여러 종에서 이러한 세포가 누락된 뉴런을 대체하도록 자극될 수 있습니다2. 망막은 뉴런과 유익하게 협력하며, 원뿔 모양으로 분지된 뮐러 세포의 끝 부분은 혈관을 조밀하게 풀어내고 망막의 신경 구성 요소를 연결합니다. 뉴런 발달과 뉴런 가소성을 유지하기 위해 뮐러 세포는 뉴런의 부드러운 기질로 작용하여 기계적 외상으로부터 뉴런을 보호한다3. 또한 병리학적 상황에서 Müller 세포는 손실된 광수용체와 뉴런을 복제하거나 재생하는 신경 전구 세포 또는 줄기 세포로 분화할 수있습니다 2,3,4. 뮐러 세포(Müller cell)는 자기 재생 및 분화(self-renewal and differentiation)를 위한 다양한 수준의 잠재력을 포함하여 망막 줄기 세포의 특성을 유지합니다 5,6. 뮐러 신경교세포(Müller glial cell)는 신경영양인자(neurotrophic factor)를 생성하고, 신경전달물질을 흡수 및 재활용하며, 이온을 공간적으로 완충하고, 망막의 항상성을 유지하기 위해 혈액-망막 장벽을 유지하는 중요한 망막 계통을 가지고 있습니다 7,8,9. 이는 망막 변성과 관련된 질병을 치료하기 위한 세포 기반 치료에서 유망한 도구로서 Müller 세포의 잠재력을 강조합니다. 뮐러 세포(Müller cell)는 망막 전체에 분포되어 있는 주요 신경교세포(glia)로, 뉴런과 혈관에 연결되어 있습니다. 망막 세포는 망막 세포의 생존력과 안정성을 유지하기 위해 필수적인 구조적 및 대사적 지원을 제공하는 중요한 보호 역할을 합니다. 불행히도, 문헌에서 망막10,11로부터의 일차 뮐러 세포 분리에 대한 프로토콜은 거의 발견되지 않는다.
당사는 mouse primary Müller 세포를 신뢰성 있게 분리하고 배양하기 위한 향상된 접근법을 제시합니다. 이 프로토콜은 야생형 C57BL/6 마우스 및 형질전환 마우스12,13에서 Müller 세포를 분리하기 위해 우리 그룹에서 사용되었습니다. 성별 선호도가 없는 5일에서 11일 사이의 생쥐가 이 프로토콜에 사용됩니다. 세포는 최대 4 번 통과되었습니다. 그러나 P4가 되면 플라스크에 더 이상 붙지 않게 되고, 건강한 문화를 성장시키기가 어려워집니다. 배양액은 종종 RPE(Retinal Pigmented Epithelial) 세포로 오염되므로 세포주에 대한 추가 실험을 수행하기 전에 세포를 한 번 이상 통과시켜야 합니다. Passaging을 통해 오염 물질로부터 추가로 격리할 수 있습니다. 따라서 제시된 프로토콜은 마우스 뮐러 세포를 분리하는 빠르고 효과적인 방법을 제공하며, 이는 치료 표적을 연구하고 망막 질환에 대한 잠재적 치료법을 평가하기 위한 신뢰할 수 있는 플랫폼으로 사용될 수 있습니다14.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Beaker : 100mL</td>
			<td>KIMAX</td>
			<td>14000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase IV&#160;</td>
			<td>Worthington&#160;</td>
			<td>LS004188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Graduated Transfer Pipettes :3.2mL Sterile</td>
			<td></td>
			<td>13-711-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (1X)&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>11885084</td>
			<td>Media to grow M&#252;ller cells&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>gibco</td>
			<td>26140079</td>
			<td>For complete Muller cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamine synthase</td>
			<td>Cell signalling</td>
			<td>80636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heracell VISO 160i CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>50144906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimberly-Clark</td>
			<td>34155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-Lok Syringe with attached needle 21 G x 1 1/2 in., sterile, single use, 3 mL</td>
			<td>B-D</td>
			<td>309577</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Centrifuge Tube: 2 mL</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>11L819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen Strep</td>
			<td>gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>For complete M&#252;ller cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer saline (PBS)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>J62851.AP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Positive Action Tweezers, Style 5/45</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>72703-DZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors Iris Standard Straight 11.5cm</td>
			<td>GARANA INDUSTRIES</td>
			<td>2595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall St8 Centrifuge</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>75007200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stemi 305 Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Blade, #11, Stainless Steel</td>
			<td>Bard-Parker</td>
			<td>371211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suspension Culture Dish 60mm x 15mm Style</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dish : 100x20mm style</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tornado Tubes: 15mL</td>
			<td>Midsci</td>
			<td>C15B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tornado Tubes: 50mL</td>
			<td>Midsci</td>
			<td>C50R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers 5MS, 8.2cm, Straight, 0.09x0.05mm Tips</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>501764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers Positive Action Style 5, Biological, Dumostar, Polished Finish, 110 mm OAL</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences Dumont</td>
			<td>50-241-57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Underpads, Moderate : 23&#34; X 36&#34;</td>
			<td>McKesson</td>
			<td>4033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Spring Scissors - 2.5mm Cutting Edge</td>
			<td>FST</td>
			<td>15000-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vimentin&#160;</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>MA5-11883</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss AxioImager Z2</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Zen Blue 2.6</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of primary mouse retinal glial m&#252;ller cells

망막의 주요 지지 세포는 망막 신경교세포(retinal glial Müller cell)입니다. 그들은 전체 망막 표면을 덮고 있으며 망막 혈관과 망막 뉴런 모두에 매우 근접해 있습니다. 뮐러 세포는 성장하기 때문에 건강한 망막에서 신경전달물질, 레티노산 화합물 및 이온(예: 칼륨 K+)의 흡수 및 재활용을 포함하여 여러 가지 중요한 작업을 수행합니다. 혈류를 조절하고 혈액-망막 장벽을 유지하는 것 외에도 신진대사와 망막에 영양분 공급을 조절합니다. 이 원고에는 1차 마우스 Müller 세포를 분리하기 위한 확립된 절차가 제시되어 있습니다. 안구 질환의 다양한 마우스 모델과 관련된 기본 분자 과정을 더 잘 이해하기 위해 Müller 세포 분리는 탁월한 접근 방식입니다. 이 원고는 마우스에서 Müller 세포를 분리하기 위한 자세한 절차를 간략하게 설명합니다. 적출에서 파종에 이르기까지 전체 과정은 약 몇 시간 동안 지속됩니다. 파종 후 5-7일 동안은 분리된 세포가 방해받지 않고 자랄 수 있도록 배지를 변경해서는 안 됩니다. 형태학과 뚜렷한 면역형광 마커를 사용한 세포 특성 분석은 프로세스의 다음 단계입니다. 세포의 최대 통로는 3-4회입니다.

분리된 Müller 세포의 특이성, 순도 및 장벽 기능 검증 분리된 Müller 세포의 생존력, 형태 및 독특한 특성을 확인하기 위해 세포를 광학 현미경으로 검사했습니다. P0 및 P1 이미지가 기록되었습니다(그림 1A). RPE 세포로 분리된 Müller 세포의 오염을 확인하고 순도를 확인하기 위해 RPE 세포 마커인 RPE65에 특이적인 항체를 사용하여 면역형광 염색(IF)을 수행했습니?...

이 원고는 쥐의 눈에서 망막 신경교세포(retinal glial Müller cell)를 분리하기 위한 자세한 프로토콜을 설명합니다. 프로토콜은 쥐 눈의 적출 및 절개로 시작하여 Müller 세포의 분리, 파종 및 배양으로 이어집니다.

Primary Mouse Retinal Glial Müller 세포의 분리

The primary supporting cell of the retina is the retinal glial M&#252;ller cell. They cover the entire retinal surface and are in close proximity to both ...

isolation-of-primary-mouse-retinal-glial-mller-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of Primary Mouse Retinal Glial M&#252;ller Cells

958 조회수.  Oakland University. 이 원고는 쥐의 눈에서 망막 신경교세포(retinal glial Müller cell)를 분리하기 위한 자세한 프로토콜을 설명합니다. 프로토콜은 쥐 눈의 적출 및 절개로 시작하여 Müller 세포의 분리, 파종 및 배양으로 이어집니다.

비디오: Primary Mouse Retinal Glial Müller 세포의 분리

Isolation of Retinal Stem Cells from the Mouse Eye

The adult mouse retinal stem cell (RSC) is a rare quiescent cell found within the ciliary epithelium (CE) of the mammalian eye1,2,3. The CE is made up of non-pigmented inner and pigmented outer cell layers, and the clonal RSC colonies that arise from a single pigmented cell from the CE are made up of both pigmented and non-pigmented cells which can be differentiated to form all the cell types of the neural retina and the RPE. There is some controversy about whether all the cells within the spheres all contain at least some pigment4; however the cells are still capable of forming the different cell types found within the neural retina1-3. In some species, such as amphibians and fish, their eyes are capable of regeneration after injury5, however; the mammalian eye shows no such regenerative properties. We seek to identify the stem cell in vivo and to understand the mechanisms that keep the mammalian retinal stem cells quiescent6-8, even after injury as well as using them as a potential source of cells to help repair physical or genetic models of eye injury through transplantation9-12. Here we describe how to isolate the ciliary epithelial cells from the mouse eye and grow them in culture in order to form the clonal retinal stem cell spheres. Since there are no known markers of the stem cell in vivo, these spheres are the only known way to prospectively identify the stem cell population within the ciliary epithelium of the eye.

In this video, we will demonstrate how to isolate retinal stem cells from the ciliary epithelium of the mouse eye and grow them in culture to form clonal retinal spheres. The spheres that are isolated possess the cardinal properties of stem cells: self-renewal and multipotentiality.

마우스 아이의 망막 줄기 세포의 분리

The adult mouse retinal stem cell (RSC) is a rare quiescent cell found within the ciliary epithelium (CE) of the mammalian eye1,2,3. The CE is made up of ...

연구

생물학

Isolation of Primary Mouse Trophoblast Cells and Trophoblast Invasion Assay

The placenta is responsible for the transport of nutrients, gasses and growth factors to the fetus, as well as the elimination of wastes. 
Thus, defects in placental development have important consequences for the fetus and mother, and are a major cause of embryonic lethality. The major cell type of the 
fetal portion of the placenta is the trophoblast. Primary mouse placental trophoblast cells are a useful tool for studying normal and abnormal placental development, 
and unlike cell lines, may be isolated and used to study trophoblast at specific stages of pregnancy. In addition, primary cultures of trophoblast from transgenic
mice may be used to study the role of particular genes in placental cells. The protocol presented here is based on the description by Thordarson et al.1, in which a 
percoll gradient is used to obtain a relatively pure trophoblast cell population from isolated mouse placentas. It is similar to the more widely used methods for 
human trophoblast cell isolation2-3. Purity may be assessed by immunocytochemical staining of the isolated cells for cytokeratin 74. Here, the isolated cells are 
then analyzed using a matrigel invasion assay to assess trophoblast invasiveness in vitro5-6. The invaded cells are analyzed by immunocytochemistry and stained 
for counting.

In this protocol, we describe the dissection of placentae from the mouse on pregnancy d10.5, followed by isolation of trophoblast cells using a Percoll gradient. We then demonstrate use of the isolated cells in a matrigel invasion assay.

기본 마우스 Trophoblast 셀 및 Trophoblast의 침략 분석의 절연

The placenta is responsible for the transport of nutrients, gasses and growth factors to the fetus, as well as the elimination of wastes.  
Thus, defects ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology and other related subjects. The method based on two-step collagenase perfusion for isolation of intact hepatocytes was first introduced by Berry and Friend in 1969 1 and, since then, has undergone many modifications. The most commonly used technique was described by Seglenin 1976 2. Essentially, hepatocytes are dissociated from anesthetized adult rats by a non-recirculating collagenase perfusion through the portal vein. The isolated cells are then filtered through a 100 &mu;m pore size mesh nylon filter, and cultured onto plates. After 4-hour culture, the medium is replaced with serum-containing or serum-free medium, e.g. HepatoZYME-SFM, for additional time to culture. These procedures require surgical and sterile culture steps that can be better demonstrated by video than by text. Here, we document the detailed steps for these procedures by both video and written protocol, which allow consistently in the generation of viable hepatocytes in large numbers.

Primary hepatocytes provide a valuable tool to evaluate biochemical, molecular, and metabolic functions in a physiologically relevant experimental system. We describe a reliable protocol for rat in situ liver perfusion, which consistently generates viable hepatocytes up to 1.0 &times; 108 cells per preparation with cell viability between 88 ~ 96%.

쥐 간장 세포의 분리 및 차 문화

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Isolation of Immune Cells from Primary Tumors

Tumors create a unique immunosuppressive microenvironment (tumor microenvironment, TME) whereby leukocytes are recruited into the tumor by various chemokines and growth factors 1,2. However, once in the TME, these cells lose the ability to promote anti-tumor immunity and begin to support tumor growth and down-regulate anti-tumor immune responses 3-4. Studies on tumor-associated leukocytes have mainly focused on cells isolated from tumor-draining lymph nodes or spleen due to the inherent difficulties in obtaining sufficient cell numbers and purity from the primary tumor. While identifying the mechanisms of cell activation and trafficking through the lymphatic system of tumor bearing mice is important and may give insight to the kinetics of immune responses to cancer, in our experience, many leukocytes, including dendritic cells (DCs), in tumor-draining lymph nodes have a different phenotype than those that infiltrate tumors 5,6 . Furthermore, we have previously demonstrated that adoptively-transferred T cells isolated from the tumor-draining lymph nodes are not tolerized and are capable of responding to secondary stimulation in vitro unlike T cells isolated from the TME, which are tolerized and incapable of proliferation or cytokine production 7,8. Interestingly, we have shown that changing the tumor microenvironment, such as providing CD4+ T helper cells via adoptive transfer, promotes CD8+ T cells to maintain pro-inflammatory effector functions 5. The results from each of the previously mentioned studies demonstrate the importance of measuring cellular responses from TME-infiltrating immune cells as opposed to cells that remain in the periphery. To study the function of immune cells which infiltrate tumors using the Miltenyi Biotech isolation system9, we have modified and optimized this antibody-based isolation procedure to obtain highly enriched populations of antigen presenting cells and tumor antigen-specific cytotoxic T lymphocytes. The protocol includes a detailed dissection of murine prostate tissue from a spontaneous prostate tumor model (TRansgenic Adenocarcinoma of the Mouse Prostate -TRAMP) 10 and a subcutaneous melanoma (B16) tumor model followed by subsequent purification of various leukocyte populations.

In this report, we describe a protocol for isolating highly purified populations of leukocytes that infiltrate tumors. This protocol is adapted from the Miltenyi Biotech protocol to enhance yield and purity for isolating cells from complex tumor tissue.

일차 종양에서 면역 세포의 분리

Tumors create a unique immunosuppressive microenvironment (tumor microenvironment, TME) whereby leukocytes are recruited into the tumor by various ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one week. More than 20 x 106 acinar cells can be obtained from a single murine pancreas. This protocol offers the possibility to independently process as many as 10 pancreases in parallel. Because it preserves acinar architecture, this model is well suited for studying the physiology of the exocrine pancreas in vitro in contrast to cell lines established from pancreatic tumors, which display many genetic alterations resulting in partial or total loss of their acinar differentiation.

In this publication, we describe a rapid and convenient procedure for isolating and culturing primary pancreatic acinar cells from the murine pancreas. This method constitutes a valuable approach to study the physiology of fresh primary normal/untransformed exocrine pancreatic cells.

마우스 기본 췌장 포상 세포의 분리 및 문화

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an important model for cardiovascular disease research. This study demonstrates a simple method to isolate and culture endothelial cells from the mouse aorta without any special equipment. To isolate endothelial cells, the thoracic aorta is quickly removed from the mouse body, and the attached adipose tissue and connective tissue are removed from the aorta. The aorta is cut into 1 mm rings. Each aortic ring is opened and seeded onto a growth factor reduced matrix with the endothelium facing down. The segments are cultured in endothelial cell growth medium for about 4 days. The endothelial sprouting starts as early as day 2. The segments are then removed and the cells are cultured continually until they reach confluence. The endothelial cells are harvested using neutral proteinase and cultured in endothelial cell growth medium for another two passages before being used for experiments. Immunofluorescence staining indicated that after the second passage the majority of cells were double positive for Dil-ac-LDL uptake, Lectin binding, and CD31 staining, the typical characteristics of endothelial cells. It is suggested that cells at the second to third passages are suitable for in vitro and in vivo experiments to study the endothelial biology. Our protocol provides an effective means of identifying specific cellular and molecular mechanisms in endothelial cell physiopathology.

The vascular endothelial cells play a significant role in many important cardiovascular disorders. This article describes a simple method to isolate and expand endothelial cells from the mouse aorta without using any special equipment. Our protocol provides an effective means of identifying mechanisms in endothelial cell physiopathology.

분리 및 마우스 대동맥 내피 세포의 차 문화

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Primary Cell Cultures from the Mouse Retinal Pigment Epithelium

The retinal pigment epithelium (RPE) is a highly polarized multi-functional epithelium that is located between the neural retina and the choroid of the eye. It is a single sheet of pigmented cells that are hexagonally packed and connected by tight junctions. The main functions of the RPE include absorption of light, phagocytosis of the shed photoreceptor outer segments, spatial buffering of ions, transport of nutrients, ions and water as well as active involvement in the visual cycle. With such important and diverse functions, it is critically important to study the biology of RPE cells. A number of RPE cell lines have been established; however, passaged and immortalized cells are known to quickly lose some of the morphological and physiological characteristics of natural RPE cells. Thus, primary cells are more suitable for studying different aspects of RPE cell biology and function. Mouse primary RPE cell culture is very useful to researchers since mouse models are widely used in biological studies, however collecting RPE cells from mouse is also very challenging due to their small size. Here, we present a protocol for establishing primary mouse RPE cell cultures which includes enucleation and dissection of the eyes and isolation of the RPE sheets to yield the cells for culturing. This method enables efficient cell recovery. The RPE cells obtained from two mice&#160;can reach confluency on one 12 mm polyester membrane insert pre-loaded in culture plate after one week of culture and display some of the original properties of bona fide RPE cells such as hexagonal shape and pigmentation after two weeks of culture.

The retinal pigment epithelium (RPE) is a multi-functional epithelium of the eye. Here we present a protocol to establish primary cell cultures derived from the murine RPE.

마우스 망막 안료 상피에서 1 차 셀 문화

The retinal pigment epithelium (RPE) is a highly polarized multi-functional epithelium that is located between the neural retina and the choroid of the ...

Isolation of Enteric Glial Cells from the Submucosa and Lamina Propria of the Adult Mouse

The enteric nervous system (ENS) consists of neurons and enteric glial cells (EGCs) that reside within the smooth muscle wall, submucosa and lamina propria. EGCs play important roles in gut homeostasis through the release of various trophic factors and contribute to the integrity of the epithelial barrier. Most studies of primary enteric glial cultures use cells isolated from the myenteric plexus after enzymatic dissociation. Here, a non-enzymatic method to isolate and culture EGCs from the intestinal submucosa and lamina propria is described. After manual removal of the longitudinal muscle layer, EGCs were liberated from the lamina propria and submucosa using sequential HEPES-buffered EDTA incubations followed by incubation in commercially available non-enzymatic cell recovery solution. The EDTA incubations were sufficient to strip most of the epithelial mucosa from the lamina propria, allowing the cell recovery solution to liberate the submucosal EGCs. Any residual lamina propria and smooth muscle was discarded along with the myenteric glia. EGCs were easily identified by their ability to express glial fibrillary acidic protein (GFAP). Only about 50% of the cell suspension contained GFAP+ cells after completing tissue incubations and prior to plating on the poly-D-lysine/laminin substrate. However, after 3 days of culturing the cells in glial cell-derived neurotrophic factor (GDNF)-containing culture media, the cell population adhering to the substrate-coated plates comprised of &#62;95% enteric glia. We created a hybrid mouse line by breeding a hGFAP-Cre mouse to the ROSA-tdTomato reporter line to track the percentage of GFAP+ cells using endogenous cell fluorescence. Thus, non-myenteric enteric glia can be isolated by non-enzymatic methods and cultured for at least 5 days.

Here, we describe the isolation of enteric-glial cells from the intestinal-submucosa using sequential EDTA incubations to chelate divalent cations and then incubation in non-enzymatic cell recovery solution. Plating the resultant cell suspension on poly-D-lysine and laminin results in a highly enriched culture of submucosal glial cells for functional analysis.

Submucosa 및 성인 마우스의 Lamina Propria 장의 Glial 세포의 고립

The enteric nervous system (ENS) consists of neurons and enteric glial cells (EGCs) that reside within the smooth muscle wall, submucosa and lamina ...

Isolation, Characterization, And High Throughput Extracellular Flux Analysis of Mouse Primary Renal Tubular Epithelial Cells

Mitochondrial dysfunction in the renal tubular epithelial cells (TECs) can lead to renal fibrosis, a major cause of&#160;chronic kidney disease (CKD). Therefore, assessing mitochondrial function in primary TECs may provide valuable insight into the bioenergetic status of the cells, providing insight into the pathophysiology of CKD. While there are a number of complex protocols available for the isolation and purification of proximal tubules in different species, the field lacks a cost-effective method optimized for&#160;tubular cell isolation without the need for purification. Here, we provide an isolation protocol that allows for studies focusing on both primary mouse proximal and distal renal TECs. In addition to cost-effective reagents and minimal animal procedures required in this protocol, the isolated cells maintain high energy levels after isolation and can be sub-cultured up to four&#160;passages, allowing for continuous studies. Furthermore, using a high throughput extracellular flux analyzer, we assess the mitochondrial respiration directly in the isolated TECs in a 96-well plate for which we provide recommendations for the optimization of cell density and compound concentration. These observations suggest that this protocol can be used for renal tubular ex vivo studies with a consistent, well-standardized production of renal TECs. This protocol may have broader future applications to study mitochondrial dysfunction associated with renal disorders for drug discovery or drug characterization purposes.

This protocol provides a cost-effective approach to isolate and characterize mouse primary renal tubular cells that can subsequently be sub-cultured to assess renal biological functions ex vivo, including mitochondrial bioenergetics.

마우스 기본 신장 관 상피 세포의 고립, 특성, 및 높은 처리량 세포 외 유출 분석

Mitochondrial dysfunction in the renal tubular epithelial cells (TECs) can lead to renal fibrosis, a major cause of&#160;chronic kidney disease (CKD). ...

Efficient Dissection and Culture of Primary Mouse Retinal Pigment Epithelial Cells

Eye disorders affect millions of people worldwide, but the limited availability of human tissues hinders their study. Mouse models are powerful tools to understand the pathophysiology of ocular diseases because of their similarities with human anatomy and physiology. Alterations in the retinal pigment epithelium (RPE), including changes in morphology and function, are common features shared by many ocular disorders. However, successful isolation and culture of primary mouse RPE cells is very challenging. This paper is an updated audiovisual version of the protocol previously published by Fernandez-Godino et al. in 2016 to efficiently isolate and culture primary mouse RPE cells. This method is highly reproducible and results in robust cultures of highly polarized and pigmented RPE monolayers that can be maintained for several weeks on Transwells. This model opens new avenues for the study of the molecular and cellular mechanisms underlying eye diseases. Moreover, it provides a platform to test therapeutic approaches that can be used to treat important eye diseases with unmet medical needs, including inherited retinal disorders and macular degenerations.

This protocol, which was originally reported by Fernandez-Godino et al. in 20161, describes a method to efficiently isolate and culture mouse RPE cells, which form a functional and polarized RPE monolayer within one week on Transwell plates. The procedure takes approximately 3 hours.

1차 마우스 망막 색소 상피 세포의 효율적인 해부 및 배양

Eye disorders affect millions of people worldwide, but the limited availability of human tissues hinders their study. Mouse models are powerful tools to ...