우리는 동물 보호와의 기술 지원을 AniCan의 직원 (CRCL, 리옹) 감사합니다. 이 작품은 협회 부어 라 공들인 쉬르 르 암으로, 문화원 국립 뒤 암에 의해, 그리고에서 장학금으로 문화원 국립 드 라 상테 엣 드 라 공들인 Médicale (INSERM Avenir에서 프로그램), 리그 국립 Contre 르 암에 의해 지원되었다 프랑스 Ministère 드 난 Enseignement 수피 리어 엣 드 라 공들인에서 문화원 국립 뒤 암 (JG), (RMP와 DFV)에서와 협회 부어 라 공들인 쉬르 르 암에서 리그 국립 Contre 르 암 (JG), ( DFV).

모든 절차는 정부 기관의 규정에 따라 윤리위원회의 승인 ( &quot;위원회 (CCT) D&#39; 평가 한국 통신 프 센터 레온 베라, à L&#39; Animalerie 드 운송 드 난 ENS, AU PBES 등 누구나 LABORATOIRE P4&quot;(CECCAPP)).되었다 마우스는 &quot;Plateforme AniCan, 센터 레온 베라&quot;(리옹, 프랑스)에서 특정 병원균이없는 동물 시설의 유지 관리 및 제도적 지침에 처리 하였다. 절차의 개략도는 그림 1에 표시됩니다. 1. 췌장의 해부 및 Dilaceration (0 일) 매우 빠른 해부 추출의 최적의 수율 중요하며, 문화에 세포의 좋은 가능성을 확보 할 수 있습니다. 췌장 분리에 필요한 시간을 줄이기 위해 모든 악기 및 장비는 마우스를 안락사 전에 준비해야합니다. <ol><li><html> CO 2 질식 또는 자궁 경부 전위 마우스를 안락사. </li></ol> 이 단계에서 모든 절차는 무균 해부 장비와 멸균 분위기 (미생물 학적 안전 캐비닛, 레벨 II)에서 수행해야합니다. <ol start="2"><li> 마우스를 고정하고 70 % 에탄올로 마우스 복부를 스프레이. 모든 해부 가위와 집게, 성기 영역에서 V 자형 절개를 완전히 복강을 열고 다이아 프램에 그것을 계속합니다. </li><li> 다이아 프램에 간 엽 (叶)의 위치, 몸의 구멍은 충분히 열려 있으면 그들은 남아 있어야합니다. 왼쪽으로 복강 외부 창자와 콜론을 당겨 직장을 찾을 수 있습니다. 곡선 포셉 및 해부 가위, 알고 섹션 직장을의 쌍. </li><li> 포셉의 동일한 쌍을주의 깊게 왼쪽에 소장을 잡아 당겨 배에 직장에서 완전히 장을 풀다. </li></ol>이 단계에서 ENT &quot;&gt;, 췌장은 위장과 창자의 시작 사이에 작은 지구로 구분할 수 있습니다. 비장과 그것의 ligations이 그대로 유지됩니다. <ol start="5"><li> 주의 창자를 따라 췌장을 절감하고 소화관의 나머지 비장으로 해방, Noyes 가위와 집게의 쌍을 사용. </li><li> 비장과 절합니다 (그림 2)에 연결된 췌장을 잡아. </li></ol> 이 단계에서, 더 장간막 지방 조직 및 / 또는 기타 주변 조직이 (비장, 대장 등) 세포의 오염을 방지하기 위해, 췌장 수집하지 할 수 있는지 확인하십시오. 프로 시저의 나머지 모든 버퍼는 단일 포상 세포 외분비 췌장 조직의 완전한 분리를 방지하기 위해 칼슘 이온 칼슘 2 + 킬레이트없이 준비해야합니다. <ol start="7"><li> 행크의 균형 소금 솔루션 (HBSS) 1X 두 번 췌장을 씻어. </li></ol> 이 단계에서, 같은 지방 조직이 가라 앉을 것 췌장 반대로, 그것은 여전히​​ 췌장에 부착 된 오염 물질의 흰색 지방 조직을 시각화하고 빠르게 제거하는 간단하게 뜰 것이다. 췌장 세포 배양 시설로 이송해야하는 경우, 그것은 HBSS 1X에서 얼음에 보관해야합니다. <ol start="8"><li> HBSS 1X의 5 ML을 포함하는 멸균 페트리 접시에있는 췌장을 전송합니다. Noyes 가위와 메스를 사용하여, 1-3mm 3 (그림 3A)의 작은 조각의 췌장을 슬라이스. </li></ol> 2. 췌장 효소 및 기계 Dissociations (0 일) <ol><li> 멸균 50 ML의 폴리 프로필렌 튜브에 그들을 전송합니다. </li><li> 450 XG 4에서 2 분 동안 원심 분리기 ° C. 기음과 세포 조각과 혈액 세포를 제거하는 상층 액을 버린다. </li><li> 콜라게나 IA 솔루션의 10 ML (HBSS 1X 10 MM의 HEPES, collagena 200 U / mL를 함유 추가췌장 섹션 SE IA, 0.25 ㎎ / 트립신 억제제 ML). 25 ML 혈청 피펫 사용, 25cm 2 플라스크에 전송할 수 있습니다. 37 ~ 30 분 정도 품어 ° C. 이 시간 (매 5 분) 동안 감소 크기의 멸균 피펫 (25, 10, 5 ML 혈청 피펫)에서 정력적으로 열 번 정도 앞뒤로 췌장 조각을 이동하여 기계적 분리를 수행합니다. </li></ol> 이 단계에서, 그것은 자주 췌장 섹션의 효소 분리의 정도를 모니터링하는 것이 필수적입니다. <ol start="4"><li> 췌장 조직이 잘 해리 것으로 보이는 경우 (췌장 조각의 실종과 솔루션의 증가 탁도에 따라) (그림 3B), 감기의 10 ML을 추가하여 효소 반응을 정지 (HBSS 1X 5를 포함하는 세척 완충 용액 % 태아 소 혈청 (FBS), 10 MM의 HEPES). </li><li> 멸균 50 ML의 폴리 프로필렌 튜브와 CENTR에 그것을 전송450 XG에 2 분, 4 ° C.에 대한 ifuge 조심스럽게 기음과 콜라게나 IA 솔루션을 제거하는 상층 액을 버린다. </li><li> resuspend을 버퍼에 세척 용액 10ml로 펠렛을 씻으십시오. 450 XG 4에서 3 분 동안 원심 분리기 ° C. 조심스럽게 기음과 상층 액을 버린다. 이 단계를 두 번 더 반복합니다. </li></ol> 3. 여과 및 시드 것은 (0 일) Acini을 분산 <ol><li> 2.5 % FBS가 포함 된 Waymouth의 매체 7 ML에있는 세포 펠렛을 resuspend, 1 % 페니실린 - 스트렙토 마이신 혼합 (PS), 0.25 ㎎ / 트립신 억제제, 25 NG / 재조합 인간 표피 성장 인자 (EGF)의 ML의 ML. </li><li> 그것은 비 소화 조각을 (덕트, 혈관, 및 랑게르한스 섬) 유지 필터를 100 μm의를 통과함으로써 여과 세포 혼합물. 췌장 포상 구조 (10 ~ 15 세포의 acinus)를 통해 전달합니다. </li><li> Waymouth의 매체를 포함하는 FBS, PS, 트립신 INH 6 ml의 필터를 씻어ibitor 및 EGF. </li></ol> 이 단계 후에, 세포는 acini 분리를 방지하기 위해 매우 신중하게 처리해야합니다. <ol start="4"><li> 씨앗 6 - 잘 배양 접시에서 분리 된 acini (물론 당 2 ㎖) (그림 3C). ° C % 5에서 (v / v)의 CO 2 분위기 37 문화를. </li></ol> 이 단계 후에, 포상 세포 현탁액 배양한다. 4. 포상 세포 배양 (일 1 ~ 10) <ol><li> 스물 네 시간 후에, 오염 물질의 세포 (그림 4) 야간 부착 한 세포 잔해를 제거하기 위해, 새로운 6 - 잘 배양 접시에 (서스펜션) acini를 전송합니다. </li></ol> 세포 배양은 몇 일 또는 실험 조건 세포가 단층으로 성장이 필요한 경우, 그것은 매트릭스 비계에 전송 및 씨앗 acini에 추천 확장해야하는 경우. <ol start="2"><li> 참조 전날매트릭스 지원에 땡 (0 일), 코트 유형 6 - 잘 배양 접시 콜라겐 (5 ㎍ / cm 2). (0.02 M 초산 50 ㎍ / ㎖, 0.2 μm의 필터링) 각 well에 I 형 콜라겐 용액 1 ㎖를 추가하고 37 ° C (또는 하룻​​밤에에서 1 시간 동안 소성에가에 수동적으로 흡착 할 수 ° C ). </li><li> 타입 I 콜라겐 솔루션을 기음과 인산염 식염수 1X 잘 두 번 코팅을 씻어. </li><li> 사용하기 전에 (미생물 안전 캐비닛 아래에) 최소한 12 시간 건조에 잘 코팅 할 수 있습니다. </li><li> 형 앞에서 설명한 것과 같은 조건에서 콜라겐 코팅 6 - 잘 문화 요리와 문화 그 (37 ° C % 5에서 (v / v)의 CO 2 분위기)에 고립 된 차 acini를 (단계 4.1에서 얻은)로 이동 . 세포 2 일 유형 I 콜라겐 기질을 준수합니다. </li><li> 3 일에 준수하지 않는 가능한 세포를 제거하기 위해 문화 매체를 변경합니다. 문화 시간에 세포가 점진적으로 SP됩니다콜라겐 함유 지원을 참조하십시오. 배양액을 3 일마다 (그림 5)을 변경합니다. </li></ol> 얻은 격리 포상 세포 토마 셀 계산 챔버를 사용하여 완전한 기계적 분리 한 후 계산 할 수 있습니다. 고립 포상 세포는 나중에 문화에 유지 될 수 없습니다. 얻은 포상 문화의 품질 등 시노, 췌장 전사 인자 1 소단위 알파, 또는 carboxypeptidase가의 A1 (면역 세포 나 면역 실험에 의해) 등의 포상 특정 마커의 발현을 확인하여 제어 할 수 있습니다.

<ol>
	<li>Lardon, J., Bouwens, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metaplasia+in+the+pancreas.">Metaplasia in the pancreas.</a> Differentiation. 73, 278-286 (2005).</li><li>Sphyris, N., Logsdon, C. D., Harrison, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+retention+of+zymogen+granules+in+cultured+murine+pancreatic+acinar+cells+and+induction+of+acinar-ductal+transdifferentiation+in+vitro.">Improved retention of zymogen granules in cultured murine pancreatic acinar cells and induction of acinar-ductal transdifferentiation in vitro.</a> Pancreas. 30, 148-157 (2005).</li><li>Amsterdam, A., Jamieson, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+characterization+of+isolated+pancreatic+exocrine+cells.">Structural and functional characterization of isolated pancreatic exocrine cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 69, 3028-3032 (1972).</li><li>Amsterdam, A., Jamieson, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+dispersed+pancreatic+exocrine+cells.+I.+Dissociation+technique+and+morphologic+characteristics+of+separated+cells.">Studies on dispersed pancreatic exocrine cells. I. Dissociation technique and morphologic characteristics of separated cells.</a> J. Cell. Biol. 63, 1037-1056 (1974).</li><li>Amsterdam, A., Jamieson, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+dispersed+pancreatic+exocrine+cells.+II.+Functional+characteristics+of+separated+cells.">Studies on dispersed pancreatic exocrine cells. II. Functional characteristics of separated cells.</a> J. Cell. Biol. 63, 1057-1073 (1974).</li><li>Schultz, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guinea+pig+pancreatic+acini+prepared+with+purified+collagenase.">Guinea pig pancreatic acini prepared with purified collagenase.</a> Exp. Cell Res. 130, 49-62 (1980).</li><li>Williams, J. A., Korc, M., Dormer, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Action+of+secretagogues+on+a+new+preparation+of+functionally+intact,+isolated+pancreatic+acini.">Action of secretagogues on a new preparation of functionally intact, isolated pancreatic acini.</a> Am. J. Physiol. 235, 517-524 (1978).</li><li>Logsdon, C. D., Williams, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+growth+factor+binding+and+biologic+effects+on+mouse+pancreatic+acini.">Epidermal growth factor binding and biologic effects on mouse pancreatic acini.</a> Gastroenterology. 85, 339-345 (1983).</li><li>Han, B., Logsdon, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholecystokinin+induction+of+mob-1+chemokine+expression+in+pancreatic+acinar+cells+requires+NF-kappaB+activation.">Cholecystokinin induction of mob-1 chemokine expression in pancreatic acinar cells requires NF-kappaB activation.</a> Am. J. Physiol. 277, 74-82 (1999).</li><li>Ji, B., Kopin, A. S., Logsdon, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Species+differences+between+rat+and+mouse+CCKA+receptors+determine+the+divergent+acinar+cell+response+to+the+cholecystokinin+analog+JMV-180.">Species differences between rat and mouse CCKA receptors determine the divergent acinar cell response to the cholecystokinin analog JMV-180.</a> J. Biol. Chem. 275, 19115-19120 (2000).</li><li>Ji, K. A., Yang, M. S., Jou, I., Shong, M. H., Joe, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thrombin+induces+expression+of+cytokine-induced+SH2+protein+(CIS)+in+rat+brain+astrocytes:+involvement+of+phospholipase+A2,+cyclooxygenase,+and+lipoxygenase.">Thrombin induces expression of cytokine-induced SH2 protein (CIS) in rat brain astrocytes: involvement of phospholipase A2, cyclooxygenase, and lipoxygenase.</a> Glia. 48, 102-111 (2004).</li><li>Gaiser, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+activation+of+trypsinogen+in+transgenic+mice+induces+acute+but+not+chronic+pancreatitis.">Intracellular activation of trypsinogen in transgenic mice induces acute but not chronic pancreatitis.</a> Gut. 60, 1379-1388 (2011).</li><li>Logsdon, C. D., Williams, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+acinar+cells+in+monolayer+culture:+direct+trophic+effects+of+caerulein+in+vitro.">Pancreatic acinar cells in monolayer culture: direct trophic effects of caerulein in vitro.</a> Am. J. Physiol. 250, 440-447 (1986).</li><li>Stanger, B. Z., Dor, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+cellular+origins+of+pancreatic+cancer.">Dissecting the cellular origins of pancreatic cancer.</a> Cell Cycle. 5, 43-46 (2006).</li><li>Vincent, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tif1gamma+suppresses+murine+pancreatic+tumoral+transformation+by+a+smad4-independent+pathway.">Tif1gamma suppresses murine pancreatic tumoral transformation by a smad4-independent pathway.</a> Am. J. Pathol. 180, 2214-2221 (2012).</li><li>Vincent, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inactivation+of+TIF1gamma+cooperates+with+Kras+to+induce+cystic+tumors+of+the+pancreas.">Inactivation of TIF1gamma cooperates with Kras to induce cystic tumors of the pancreas.</a> PLoS Genet. 5, e1000575 (2009).</li><li>Dorrell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mouse+pancreatic+alpha,+beta,+duct+and+acinar+populations+with+cell+surface+markers.">Isolation of mouse pancreatic alpha, beta, duct and acinar populations with cell surface markers.</a> Mol. Cell Endocrinol. 339, 144-150 (2011).</li><li>Case, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis,+intracellular+transport+and+discharge+of+exportable+proteins+in+the+pancreatic+acinar+cell+and+other+cells.">Synthesis, intracellular transport and discharge of exportable proteins in the pancreatic acinar cell and other cells.</a> Biol. Rev. Camb. Philos. Soc. 53, 211-354 (1978).</li><li>Blauer, M., Nordback, I., Sand, J., Laukkarinen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+explant+outgrowth+culture+model+for+mouse+pancreatic+acinar+cells+with+long-term+maintenance+of+secretory+phenotype.">A novel explant outgrowth culture model for mouse pancreatic acinar cells with long-term maintenance of secretory phenotype.</a> Eur. J. Cell. Biol. 90, 1052-1060 (2011).</li></ol>

저자는 그들이 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

이 프로토콜에서는, 우리는 췌장 포상 세포를 분리하기위한 절차를 설명합니다. 이 방법은보다 1 시간에 동물 당 20 × 10 6 포상 세포를 분리 할 수 있습니다. 의 신속하고 간단한 구현 (많은 10 췌장은 독립적으로 병렬 실험 당 처리 할 수 있습니다) 덕분에,이 프로토콜은 기존의 분리 방법 3-5,9-12,17 사이 좋은 타협으로 나타납니다. 중요한 단계 / 트러블 슈팅...

외분비 췌장 조직 작업 연구 실험실 자주 발생하는 문제는 충분히 장기적인 실험을 할 수 있도록 일정 기간 동안 체외에서 포상 세포를 배양의 어려움이다. 이러한 문화 시스템의 개발을 방해 한 요인들은 췌장 세포의 분리 중에 출시 할 때 그대로 췌장 조직을 소화, 당분 단백질 분해하고 지방 분해 효소의 높은 콘텐츠로 인해 실험 조작에 췌장 조직의 고유 감도이다. 두 번째 인자가 분비 특성을 잃게하고 췌관 세포 나 간세포와 같은 세포 1. 등의 성숙한 세포로 transdifferentiate하는 경향이 포상 세포의 체외 소성의 놀라운 체외에서이 세포의 가소성은 실험 조건에 따라 달라집니다 (예 : 배지 조성 등 2) </&gt;를 한모금 및 외분비 췌장 세포 1에 적합한 배양 조건의 디자인에 복잡성의 정도를 소개합니다. 여러 가지 방법이 처음 기니 돼지 췌장 3-5에서 포상 세포의 분리 및 배양을 위해 개발되었습니다. 처음에는 이러한 프로토콜은 활발한 기계적 분리에 의해 궁극적 격리와 콜라, 키모 트립신, 그리고 단백질 분해 효소 칵테일과 췌장 조직의 소화를하고있었습니다. 이런 식으로 고립 된 췌장 세포는 특히 비정상적인 구조 및 기능적 특성, 정점 구조와 자신의 막 수용체에 중요한 손상의 손실을 표시됩니다. 고립 된 세포는 1 개 또는 2 일 동안 가능한 남아 있었다. 의 준비 acini이 분비 6-8에 대한 응답으로 표면의 수용체에 손상을 제한하기 때문에 외분비 분비를 개선, 세포의 세포막을 유지, 자신의 내부 및 간 아키텍처를 유지하고 분산. 열매로그건,이 방법은 체외에서 7-10까지 일 포상 세포 생존 능력을 확장하는 중요한 이점을 제공합니다. 갭 접합에 의한 세포 커플 링 등 간 연락처, 유지 보수는 외분비 췌장 포상 세포의 표현형 13의 중요한 결정이기 때문에 또한,이 방법은 현재 9-12 포상 세포 분리하는 것이 바람직하다. 포상 세포와 유관 세포들이 분화의 탈분화 공격적인 외분비 췌장 암 (14)의 기원에 대해 제안 된 메커니즘 중 하나이기 때문에, 분산 acini 모델은 또한 췌장의 가소성과 그 이후의 분자 메커니즘을 연구하는 적절한 시스템입니다. 또한, 유전자 변형 동물 15,16의 사용과 유전자 전달 기술의 개발 (아데노 바이러스 2 렌티 바이러스 전달, 나노 입자 등의 사용)와 함께이 체외 기본 포상 세포 모델 수다양한 유전 적 장애는 포상 세포 분화 또는 탈분화의 규정에 영향을 미칠 췌장염의 발병, 전암 병변 세포 가소성의 변화에​​ 대한 책임 분자 사건의 더 나은 이해를 제공하는 방법을 결정하는 데 매우 유용합니다. 분산 acini의 분리는 우리가 문화 췌장 포상 세포 연구실에서 사용하는 방법입니다. 우리는 여기에서 설명하고 사용 방법을 설명합니다. 그것은 포상 세포의 분리없이 기계적 중단에 결합 된 췌장 조직 (박테리아 콜라 포함)의 효소 해리을 포함한다. 대부분의 프로토콜이 정지 또는 특수 처리 플라스틱 기판에 하나 배양 acini를 포함하는 동안, 우리는 장기 세포 배양이 필요한 경우 매트릭스 비계에 나중에 그들을 뿌리기 만 간단히 (24 시간)을 정학을 성장. 이 프로토콜은 분산 췌장 교류의 신속한 분리 (이하 HR)에서 할 수 있습니다INI, 문화에 1 주일 이상 지속. 그것은 마우스의 췌장 당 20 × 10 6 포상 세포의 분리 할 수 있습니다. 단순는 가능한 독립적으로 병렬로 많은 10 췌장을 처리 할 수​​ 있습니다. 현재 사용할 수있는 모든 다른 외분비 췌장 모델은 많은 유전 적 표시 췌장 종양에서 파생 된대로 acini의 내부 및 간 아키텍처와 이렇게 고립 된 일차 전지의 포상 표현형을 유지하여,이 모델은, 분화 메커니즘 연구를위한 선택의 시스템을 구성 변화는 세포의 변화를 선도.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>0.2 &mu;m filter</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>146560</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>10 ml serological pipettes</td>
			<td>Beckton Dickinson</td>
			<td>357551</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>100 &mu;m filter</td>
			<td>Beckton Dickinson</td>
			<td>352360</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>100 mm Petri dish</td>
			<td>Beckton Dickinson</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>1000 &mu;l filter tips</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1122-1830</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>20 &mu;l filter tips</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1120-1810</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>200 &mu;l filter tips</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1120-8810</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>25 ml serological pipettes</td>
			<td>Beckton Dickinson</td>
			<td>357535</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>5 ml serological pipettes</td>
			<td>Beckton Dickinson</td>
			<td>357543</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>50 ml polypropylene tube</td>
			<td>Beckton Dickinson</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>Beckton Dickinson</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Acetic acid 100%</td>
			<td>VWR BDH Prolabo</td>
			<td>20104.298</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Collagenase IA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2676</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Curved forceps, Dumont #7</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14188</td>
			<td>To sterilize before use</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Dissecting scissors, straight</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14393</td>
			<td>To sterilize before use</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Epidermal Growth Factor, human</td>
			<td>Promokine</td>
			<td>C-60180</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Ethanol absolute (AnalaR Normapur)</td>
			<td>VWR BDH Prolabo</td>
			<td>20821.310</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>14-801F</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Forceps, Dumont #5</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14098</td>
			<td>To sterilize before use</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Hank's Balanced Salt Solution 1x </td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14025050</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>HEPES 1 M (pH 6.98-7.30)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-737F</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Incubator O2/CO2</td>
			<td>Sanyo</td>
			<td>MCO-19M</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse TS100</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Beckton Dickinson</td>
			<td>356234</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Microbiological Safety Cabinet, level II</td>
			<td>Faster</td>
			<td>SafeFast Elite 212 S</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Noyes scissors, sharp/sharp tips, German</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>500228-G</td>
			<td>To sterilize before use</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin mixture</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline 10x </td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14200067</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Pipet-Aid</td>
			<td>Drummond Scientific Company</td>
			<td>Pipet-Aid XP</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Pipetman P1000</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F123602</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Pipetman P20</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F123600</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Pipetman P200</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F123601</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Refrigerated centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810R</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Paramount Surgimed Ltd.</td>
			<td>Disposable Scalpel Size 23</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>T25 flask, 25 cm2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z707481</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Trypsin inhibitor, from Glycine Max</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6522</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Type I collagen</td>
			<td>Beckton Dickinson</td>
			<td>354236</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Waymouth's medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31220-023</td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

isolation and culture of mouse primary pancreatic acinar cells

이 프로토콜은 가능한 일주일 이상 그들의 문화를 유지하고, 생쥐 췌장 acini의 신속한 분리 (이하 HR)에서 허용합니다. 20 개 이상 X 10 6 포상 세포는 하나의 쥐 췌장에서 얻을 수 있습니다. 이 프로토콜은 독립적으로 병렬로 많은 10 췌장을 처리 할 수​​있는 가능성을 제공합니다. 이 포상 구조를 유지하고 있기 때문에,이 모델은 잘 그들의 포상 분화의 일부 또는 전체 손실의 결과 많은 유전 변경을 표시 췌장 종양에서 설립 세포 라인과는 달리 체외에서 외분비 췌장의 생리를 공부에 적합합니다.

그림 1은 기본 포상 세포 분리에 대해 &quot;분산&quot;acini 방법을 schematizes. 엄격 프로토콜 중에 존중해야 할 중요한 단계는, 토론 부분에 설명되어 있습니다. 의 제거를 용이하게하기 위해 췌장은 첨부 된 비장 (그림 2)와 함께 복부에서 수집 할 수 있습니다. 두 기관은 떨어져 절단해야하고, 여전히 췌장에 부착 할 수있는 잔여 지방 조직은 (단계 1.6)를 ...

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Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

이 문서에서는, 우리는 분리와 생쥐 췌장에서 배양 기본 췌장 포상 세포에 대한 신속하고 편리하게 절차를 설명합니다. 이 방법은 신선한 차 변환되지 않은 정상 / 외분비 췌장 세포의 생리학을 연구하는 귀중한 방법을 구성합니다.

마우스 기본 췌장 포상 세포의 분리 및 문화

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

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Research

JoVE Journal

Biology

35.3K 조회수.  Centre de Recherche en Cancérologie de Lyon.  이 문서에서는, 우리는 분리와 생쥐 췌장에서 배양 기본 췌장 포상 세포에 대한 신속하고 편리하게 절차를 설명합니다. 이 방법은 신선한 차 변환되지 않은 정상 / 외분비 췌장 세포의 생리학을 연구하는 귀중한 방법을 구성합니다. 

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Isolation of Primary Mouse Trophoblast Cells and Trophoblast Invasion Assay

The placenta is responsible for the transport of nutrients, gasses and growth factors to the fetus, as well as the elimination of wastes. 
Thus, defects in placental development have important consequences for the fetus and mother, and are a major cause of embryonic lethality. The major cell type of the 
fetal portion of the placenta is the trophoblast. Primary mouse placental trophoblast cells are a useful tool for studying normal and abnormal placental development, 
and unlike cell lines, may be isolated and used to study trophoblast at specific stages of pregnancy. In addition, primary cultures of trophoblast from transgenic
mice may be used to study the role of particular genes in placental cells. The protocol presented here is based on the description by Thordarson et al.1, in which a 
percoll gradient is used to obtain a relatively pure trophoblast cell population from isolated mouse placentas. It is similar to the more widely used methods for 
human trophoblast cell isolation2-3. Purity may be assessed by immunocytochemical staining of the isolated cells for cytokeratin 74. Here, the isolated cells are 
then analyzed using a matrigel invasion assay to assess trophoblast invasiveness in vitro5-6. The invaded cells are analyzed by immunocytochemistry and stained 
for counting.

In this protocol, we describe the dissection of placentae from the mouse on pregnancy d10.5, followed by isolation of trophoblast cells using a Percoll gradient. We then demonstrate use of the isolated cells in a matrigel invasion assay.

기본 마우스 Trophoblast 셀 및 Trophoblast의 침략 분석의 절연

The placenta is responsible for the transport of nutrients, gasses and growth factors to the fetus, as well as the elimination of wastes.  
Thus, defects ...

연구

생물학

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology and other related subjects. The method based on two-step collagenase perfusion for isolation of intact hepatocytes was first introduced by Berry and Friend in 1969 1 and, since then, has undergone many modifications. The most commonly used technique was described by Seglenin 1976 2. Essentially, hepatocytes are dissociated from anesthetized adult rats by a non-recirculating collagenase perfusion through the portal vein. The isolated cells are then filtered through a 100 &mu;m pore size mesh nylon filter, and cultured onto plates. After 4-hour culture, the medium is replaced with serum-containing or serum-free medium, e.g. HepatoZYME-SFM, for additional time to culture. These procedures require surgical and sterile culture steps that can be better demonstrated by video than by text. Here, we document the detailed steps for these procedures by both video and written protocol, which allow consistently in the generation of viable hepatocytes in large numbers.

Primary hepatocytes provide a valuable tool to evaluate biochemical, molecular, and metabolic functions in a physiologically relevant experimental system. We describe a reliable protocol for rat in situ liver perfusion, which consistently generates viable hepatocytes up to 1.0 &times; 108 cells per preparation with cell viability between 88 ~ 96%.

쥐 간장 세포의 분리 및 차 문화

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Preparation of Pancreatic Acinar Cells for the Purpose of Calcium Imaging, Cell Injury Measurements, and Adenoviral Infection

The pancreatic acinar cell is the main parenchymal cell of the exocrine pancreas and plays a primary role in the secretion of pancreatic enzymes into the pancreatic duct. It is also the site for the initiation of pancreatitis. Here we describe how acinar cells are isolated from whole pancreas tissue and intracellular calcium signals are measured. In addition, we describe the techniques of transfecting these cells with adenoviral constructs, and subsequently measuring the leakage of lactate dehydrogenase, a marker of cell injury, during conditions that induce acinar cell injury in vitro. These techniques provide a powerful tool to characterize acinar cell physiology and pathology.

We describe a reproducible method of preparing mouse pancreatic acinar cells from a mouse for the purpose of examining acinar cell calcium signals and cellular injury with physiologically and pathologically relevant stimuli. A method for adenoviral infection of these cells is also provided.

칼슘 이미징의 목적, 세포 상해 측정 및 아데노 바이러스 감염 췌장 포상 세포의 준비

The pancreatic acinar  cell is the main parenchymal cell of the exocrine pancreas and plays a primary  role in the secretion of pancreatic enzymes into ...

Assessing the Secretory Capacity of Pancreatic Acinar Cells

Pancreatic acinar cells produce and secrete digestive enzymes. These cells are organized as a cluster which forms and shares a joint lumen. This work demonstrates how the secretory capacity of these cells can be assessed by culture of isolated acini. The setup is advantageous since isolated acini, which retain many characteristics of the intact exocrine pancreas can be manipulated and monitored more readily than in the whole animal. Proper isolation of pancreatic acini is a key requirement so that the ex&#160;vivo culture will represent the in&#160;vivo nature of the acini. The protocol demonstrates how to isolate intact acini from the mouse pancreas. Subsequently, two complementary methods for evaluating pancreatic secretion are presented. The amylase secretion assay serves as a global measure, while direct imaging of pancreatic secretion allows the characterization of secretion at a sub-cellular resolution. Collectively, the techniques presented here enable a broad spectrum of experiments to study exocrine secretion.

Isolated pancreatic acini retain their in&#160;vivo morphology and activity and offer powerful ways for monitoring and manipulating secretion. This work demonstrates how acini can be isolated from the mouse pancreas, and how their secretory capacities can be assessed.

췌장 선포 세포의 분비 능력 평가

Pancreatic acinar cells produce and secrete digestive enzymes. These cells are organized as a cluster which forms and shares a joint lumen. This work ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an important model for cardiovascular disease research. This study demonstrates a simple method to isolate and culture endothelial cells from the mouse aorta without any special equipment. To isolate endothelial cells, the thoracic aorta is quickly removed from the mouse body, and the attached adipose tissue and connective tissue are removed from the aorta. The aorta is cut into 1 mm rings. Each aortic ring is opened and seeded onto a growth factor reduced matrix with the endothelium facing down. The segments are cultured in endothelial cell growth medium for about 4 days. The endothelial sprouting starts as early as day 2. The segments are then removed and the cells are cultured continually until they reach confluence. The endothelial cells are harvested using neutral proteinase and cultured in endothelial cell growth medium for another two passages before being used for experiments. Immunofluorescence staining indicated that after the second passage the majority of cells were double positive for Dil-ac-LDL uptake, Lectin binding, and CD31 staining, the typical characteristics of endothelial cells. It is suggested that cells at the second to third passages are suitable for in vitro and in vivo experiments to study the endothelial biology. Our protocol provides an effective means of identifying specific cellular and molecular mechanisms in endothelial cell physiopathology.

The vascular endothelial cells play a significant role in many important cardiovascular disorders. This article describes a simple method to isolate and expand endothelial cells from the mouse aorta without using any special equipment. Our protocol provides an effective means of identifying mechanisms in endothelial cell physiopathology.

분리 및 마우스 대동맥 내피 세포의 차 문화

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Isolation and Culture of Primary Mouse Keratinocytes from Neonatal and Adult Mouse Skin

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin defense by forming an intact skin barrier against environmental insults, such as UVB irradiation or pathogens, and also by initiating an inflammatory response upon those insults. Here we describe methods to isolate KCs from neonatal mouse skin and from adult mouse tail skin. We also describe culturing conditions using defined growth supplements (dGS) in comparison to chelexed fetal bovine serum (cFBS). Functionally, we show that both neonatal and adult KCs are highly responsive to high calcium-induced terminal differentiation, tight junction formation and stratification. Additionally, cultured adult KCs are susceptible to UVB-triggered cell death and can release large amounts of TNF upon UVB irradiation. Together, the methods described here will be useful to researchers for the setup of in vitro models to study epidermal biology in the neonatal mouse and/or the adult mouse.

Epidermal keratinocytes form a functional skin barrier and are positioned at the front line of host defense against external environmental insults. Here we describe methods for isolation and primary culture of epidermal keratinocytes from neonatal and adult mouse skin, and induction of terminal differentiation and UVB-triggered inflammatory response from keratinocytes.

신생아 및 성인 마우스 피부의 1 차 마우스 각질 세포의 분리 및 배양

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin ...

Isolation and Culture of Primary Aortic Endothelial Cells from Miniature Pigs

Xenotransplantation is a promising way to resolve the shortage of human organs for patients with end-stage organ failure, and the pig is considered as a suitable organ source. Immune rejection and coagulation are two major hurdles for the success of xenotransplantation. Vascular endothelial cell (EC) injury and dysfunction are important for the development of the inflammation and coagulation responses in xenotransplantation. Thus, isolation of porcine aortic endothelial cells (pAECs) is necessary for investigating the immune rejection and coagulation responses. Here, we have developed a simple enzymatic approach for the isolation, characterization, and expansion of highly purified pAECs from miniature pigs. First, the miniature pig was anaesthetized with ketamine, and a length of aorta was excised. Second, the endothelial surface of aorta was exposed to 0.005% collagenase IV digestive solution for 15 min. Third, the endothelial surface of the aorta was scraped in only one direction with a cell scraper (&#60;10 times), and was not compressed during the process of scraping. Finally, the isolated pAECs of Day 3, and after passage 1 and passage 2, were identified by flow cytometry with an anti-CD31 antibody. The percentages of CD31-positive cells were 97.4% &#177; 1.2%, 94.4% &#177; 1.1%, and 92.4% &#177; 1.7% (mean &#177; SD), respectively. The concentration of Collagenase IV, the digestive time, the direction, and frequency and intensity of scraping are critical for decreasing fibroblast contamination and obtaining high-purity and a large number of ECs. In conclusion, our enzymatic method is a highly-effctive method for isolating ECs from the miniature pig aorta, and the cells can be expanded in vitro to investigate the immune and coagulation responses in xenotransplantation.

An effective enzymatic method for isolation of primary porcine aortic endothelial cells (pAECs) from miniature pigs is described. The isolated primary pAECs can be used to investigate the immune and coagulation response in xenotransplantation.

소형 돼지에서 1 차 대동맥 내피 세포의 격리 및 배양

Xenotransplantation is a promising way to resolve the shortage of human organs for patients with end-stage organ failure, and the pig is considered as a ...

Efficient Dissection and Culture of Primary Mouse Retinal Pigment Epithelial Cells

Eye disorders affect millions of people worldwide, but the limited availability of human tissues hinders their study. Mouse models are powerful tools to understand the pathophysiology of ocular diseases because of their similarities with human anatomy and physiology. Alterations in the retinal pigment epithelium (RPE), including changes in morphology and function, are common features shared by many ocular disorders. However, successful isolation and culture of primary mouse RPE cells is very challenging. This paper is an updated audiovisual version of the protocol previously published by Fernandez-Godino et al. in 2016 to efficiently isolate and culture primary mouse RPE cells. This method is highly reproducible and results in robust cultures of highly polarized and pigmented RPE monolayers that can be maintained for several weeks on Transwells. This model opens new avenues for the study of the molecular and cellular mechanisms underlying eye diseases. Moreover, it provides a platform to test therapeutic approaches that can be used to treat important eye diseases with unmet medical needs, including inherited retinal disorders and macular degenerations.

This protocol, which was originally reported by Fernandez-Godino et al. in 20161, describes a method to efficiently isolate and culture mouse RPE cells, which form a functional and polarized RPE monolayer within one week on Transwell plates. The procedure takes approximately 3 hours.

1차 마우스 망막 색소 상피 세포의 효율적인 해부 및 배양

Eye disorders affect millions of people worldwide, but the limited availability of human tissues hinders their study. Mouse models are powerful tools to ...

Isolation and Culture of Primary Oral Keratinocytes from the Adult Mouse Palate

For years, most studies involving keratinocytes have been conducted using human and mouse skin epidermal keratinocytes. Recently, oral keratinocytes have attracted attention because of their unique function and characteristics. They maintain the homeostasis of the oral epithelium and serve as resources for applications in regenerative therapies. However, in vitro studies that use oral primary keratinocytes from adult mice have been limited due to the lack of an efficient and well-established culture protocol. Here, oral primary keratinocytes were isolated from the palate tissues of adult mice and cultured in a commercial low-calcium medium supplemented with a chelexed-serum. Under these conditions, keratinocytes were maintained in a proliferative or stem cell-like state, and their differentiation was inhibited even after increased passages. Marker expression analysis showed that the cultured oral keratinocytes expressed the basal cell markers p63, K14, and &#945;6-integrin and were negative for the differentiation marker K13 and the fibroblast marker PDGFR&#945;. This method produced viable and culturable cells suitable for downstream applications in the study of oral epithelial stem cell functions in vitro.

The present protocol describes the isolation and culture of oral keratinocytes derived from the adult mouse palate. An evaluation method using immunostaining is also reported.

성인 마우스 입천장에서 1 차 구강 각막 세포의 격리 및 문화

For years, most studies involving keratinocytes have been conducted using human and mouse skin epidermal keratinocytes. Recently, oral keratinocytes have ...

Isolation and Characterization of Mouse Primary Liver Sinusoidal Endothelial Cells

Liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) are specialized endothelial cells located at the interface between the circulation and the liver parenchyma. LSECs have a distinct morphology characterized by the presence of fenestrae and the absence of basement membrane. LSECs play essential roles in many pathological disorders in the liver, including metabolic dysregulation, inflammation, fibrosis, angiogenesis, and carcinogenesis. However, little has been published about the isolation and characterization of the LSECs. Here, this protocol discusses the isolation of LSEC from both healthy and nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD) mice. The protocol is based on collagenase perfusion of the mouse liver and magnetic beads positive selection of nonparenchymal cells to purify LSECs. This study characterizes LSECs using specific markers by flow cytometry and identifies the characteristic phenotypic features by scanning electron microscopy. LSECs isolated following this protocol can be used for functional studies, including adhesion and permeability assays, as well as downstream studies for a particular pathway of interest. In addition, these LSECs can be pooled or used individually, allowing multi-omics data generation including RNA-seq bulk or single cell, proteomic or phospho-proteomics, and Assay for Transposase-Accessible Chromatin using sequencing (ATAC-seq), among others. This protocol will be useful for investigators studying LSECs&#39; communication with other liver cells in health and disease and allow an in-depth understanding of the role of LSECs in the pathogenic mechanisms of acute and chronic liver injury.

Here we outline and demonstrate a protocol for primary mouse liver sinusoidal endothelial cell (LSEC) isolation. The protocol is based on liver collagenase perfusion, nonparenchymal cell purification by low-speed centrifugation, and CD146 magnetic bead selection. We also phenotype and characterize these isolated LSECs using flow cytometry and scanning electron microscopy.

마우스 일차 간 정현파 내피 세포의 분리 및 특성화

Liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) are specialized endothelial cells located at the interface between the circulation and the liver parenchyma. ...