이 작품을 리 나 A. Shehadeh 다음 교부 금에 의해 지원 되었다:는 건강의 국립 연구소 (R56HL132209 및 1R01HL140468)와 마이애미 심장 연구소.

모든 실험 동물 관련 기관 동물 관리 및 사용 위원회 마이애미 대학에서 NIH 지침 준수에 의해 승인 되었다.
1. 플레이트 코팅 및 시 약의 준비
<ol><li>콜라겐 코팅을 준비:<ol>
<li>콜라겐의 35 μ 추가 나 단일 60 mm 페 트리 접시에 미리 필터링 된 20 m m 초 산 솔루션의 2 mL. 1 시간에 대 한 실 온에서 품 어, 건조 하 고 자외선에 노출.</li>
		<li>워시 코팅 어떤 산 성 잔류물을 제거 하 고 37 ° C CO2저장에 PBS 가진 3 배-무료 셀 문화 인큐베이터 셀 시드를 위한 준비가 될 때까지. 콜라겐 코팅의 최종 농도 5 μ g/c m2입니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>관류 버퍼 준비: 30 ml PBS의 페니실린-스 (P/S)의 300 μ를 추가 하 고는 격리 시작 될 때까지 37 ° C 물 욕조에 혼합 따뜻한.</li>
	<li>소화 버퍼 준비: 3.9 mg PBS의 30 mL에 콜라 타입 2의 분해, 0.2 μ m 병 상위 필터를 통해 솔루션을 필터링 및 격리 시작 될 때까지 37 ° C에서 물 욕조에 따뜻한 그것.</li>
	<li>세포 배양 준비:<ol>
<li>실내 온도에 보충 교재를가지고. 여과 없이 추가 보충 (0.05 mL 태아 송아지 혈 청, 표 피 성장 인자, 인슐린, 피 네 프 린, 날린, 올려진다의 5 μ g/mL 및 triiodo-L-thyronine의 4 pg/mL의 36 ng/mL의 0.5 μ g/mL의 5 μ g/mL의 10 ng/mL)의 신장 500 mL를 상피 세포 성장 기저 미디어 2입니다.</li>
		<li>37 ° C 물 목욕 사용 준비가 될 때까지 미디어를 따뜻한.</li>
	</ol>
</li>
	<li>혼합물 준비: 50mm FCCP 준비, 10 m m로 테 논, 10mm oligomycin, 10 m m antimycin A, 50 m L-carnitine, m 및 50 mM etomoxir, DMSO, aliquot에서 모든 솔루션을 재고 하 고-20 ° c.에 화합물을 저장</li>
	<li>2.5 m m 나트륨 물 150 m m NaCl 솔루션의 220 mL에서 준비 하 고는 물 완전히 해산 때까지 75 ° C 물 욕조에 솔루션을 따뜻하게.</li>
	<li>소 혈 청 알 부 민 (BSA) 준비: 0.34 m m 지방 없는 BSA 150 mM NaCl의 250 mL에서 준비. 제어 BSA 다음 단계 1.8에 의해 준비 될 수 있는 팜 BSA 솔루션에 대 한 부정적인 컨트롤 역할을 합니다.</li>
	<li>켤레 BSA (팜-BSA)에 물:<ol>
<li>추가 물 솔루션 점차적으로 BSA 솔루션에는 여전히는 뜨겁다 동안. 그런 다음 pH 7.4 조정 하 고 완료를 활용 하려면 적어도 1 시간 동안 37 ° C에서 그들을 믹스.</li>
		<li>활용이 완료 되 면 솔루션에 150 mM NaCl의 또 다른 150 mL을 추가, 잘, 그것을 혼합 및-20 ° c.에 aliquots 저장 최종 솔루션 BSA는 물 및 0.17 m m 1 m m 나트륨을 포함 하 고 셀 세포 외 유출 지방산 기반 분석 결과에 대 한 지방산 기판으로 사용 됩니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>세포 외 유출 분석 결과 기저 미디어 준비:<ol>
<li>압력가 dH2O의 1 l DMEM 분말 1 봉지와 200 mm L-글루타민 (마지막 4 m m) 20 mL를 추가 하 고 부드럽게 그들을 믹스.</li>
		<li>생체 실험의 날, 포도 당 또는 지방산 기반된 호흡 분석 결과에서 사용 될 세포 외 유출 분석 결과 미디어의 후속 준비를 위한 준비 기저 미디어를 100 µ M 나트륨 pyruvate를 추가 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>포도 당 기반 미디어 준비:<ol>
<li>분해를 통해 세포 호흡 능력을 측정 하기 위해 기저 미디어 단계 1.9에서에서 위에서 설명한 17.5 m m 포도 당 분말, 100 µ M 제어 BSA (에 설명 된 대로 단계 1.7), 및 (지방산 산화를 억제)를 20 µ M etomoxir을 추가 합니다.</li>
		<li>37 ° C에서 미디어를 warm, pH 7.4 조정 하 고 그것은 세포 외 유출 분석 결과에서 사용 될 때까지 37 ° C 물 욕조에 그것을 유지.</li>
	</ol>
</li>
	<li>지방산에 기초를 둔 미디어 준비:<ol>
<li>지방산 산화를 통해 세포 호흡 능력을 측정, 추가 10 mM 2D 포도 당 분말 (포도 당 분해를 억제 하기 위해 아날로그), 100 µ M L-carnitine 기저 미디어 단계 1.9에서에서 위에서 설명한 팜-BSA (에서 설명한 단계와 1.8), 및 100 µ M.</li>
		<li>37 ° C에서 미디어를 warm, pH 7.4를 조정 하 고 그것은 세포 외 유출 분석 결과에서 사용 될 때까지 37 ° C 물 욕조에 그것을 유지.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 관류, 소화와 쥐에서 신장 수확
<ol><li>Anesthetize isoflurane 흐름 마우스 및 부정사 위치에 수정. 고립만 동물의 righting 반사 손실 후에 마 취 깊이 핀치 평가 전과 절차22중 atraumatic 집게를 사용 하 여 모니터링 시작 다는 것을 확인 하십시오.</li>
	<li>모피, 그것의 복 부 영역에 마우스의 가슴에서 depilatory 크림을 사용 하 여 제거, 요오드, 소독 하 고 요오드 잔여물을 닦아.</li>
	<li>절 개 가슴에, 전체 복 부 영역을 열고 하는 피부를 잘라 만들고 심장 및 신장 노출.</li>
	<li>32 mL/min에서 관류 펌프 고에 튜브는 관류를 시작 하기 전에 모든 거품을 제거 합니다.</li>
	<li>버퍼는 마음을 채우고 자 마자 심장 꼭대기를 통해 좌 심 실에 27 G 바늘을 삽입 하 고 찌를 관류 버퍼 심장 펌프도 순환 하 고 결국 오른쪽 아 트리 움 출구에서 제거 되 면 출구를 만들려고 오른쪽 아 트리 움.</li>
	<li>재 관류 후 30 mL/min 소화 펌프 속도 전환.</li>
	<li>소화의 20 mL 후 버퍼 꼭대기 통해 끼얹는다는, 둘 다 신장 관 세포 격리에 대 한 제거.</li>
</ol>3. 조직 처리 및 기본 관 세포 격리
<ol><li>신장 캡슐과 수 질을 제거 하 고 작은 조각으로 모두 신장 말하다 부드러운 회전 5 분 동안 37 ° C 오븐에서 소화 버퍼의 10 ml에서 그들을 품 어.</li>
	<li>70 μ m 필터를 통해 버퍼를 전달 하 여 어떤 소화 되지 않은 신장 조직을 제거 합니다. 소화를 막으려고 문화 미디어의 10 mL를 추가 합니다.</li>
	<li>관 세포를 수집, 필터링 된 셀 서 스 펜 션 5 분 첫 번째 펠 릿 수집 50 x g에서 원심. 새로운 튜브에는 상쾌한을 전송 하 고 배양 기, 원심 분리기 관의 모든 셀을 보장 하기 위해 5 분 동안 50 x g에서 두 번째 펠 릿으로 수집의 5 mL을 추가. 원심 분리는 주로 작은 무거운 tubules를 낮은 속도로. 나중에, 세포는 고립에서 복구, 후 순수 관 문화는 높은 속도에서 하위 문화 중 centrifuged.</li>
	<li>문화 미디어의 20 ml에서 첫 펠 릿을 resuspend 하 고 수집 3 펠 릿을 5 분 동안 50 x g에서 원심.</li>
	<li>문화 미디어의 1 mL에 두 번째 및 세 번째 펠 릿을 resuspend. Trypan 파랑의 10 µ L로 세포 현 탁 액의 혼합 10 µ L A 세 슬라이드와 기록 자동에서 세포 생존 세포 카운터 ( 재료의 표참조)의 챔버로 혼합물을 로드 합니다.</li>
	<li>씨앗 107 셀 (이종 인구) 한 60 mm 접시에까지 미리 콜라겐으로 코팅 하 고 하룻밤 연결 관 세포.</li>
</ol>4. 주 관 세포 하위 문화 및 특성화
<ol><li>분리 후 1 일 문화 미디어를 수집 하 고 어떤 부동 tubules를 펠 렛을 5 분 동안 50 x g에서 원심. 상쾌한을 제거 하 고 신선한 문화 미디어와 같은 문화 접시에 다시 접시의 4 mL에 셀 펠 릿 resuspend.</li>
	<li>하루에 4 분리 하 여 후, 오래 된 문화 미디어를 제거 하 고 신선한 미디어 추가.</li>
	<li>격리 후 7 일에 0.25 %trypsin-EDTA 반응을 중지 하 고 5 분 동안 250 x g에서 원심 분리 하 여 세포를 수집 문화 미디어의 5 분 추가 3 ml 2 mL에 37 ° C에서 배양 하 여 세포를 분리 합니다.</li>
	<li>하위 문화 및 p1 P0에서 셀 특성, 24-잘 접시에 잘 당 씨 5000 셀 코팅 콜라겐과 내가 위에서 설명한 대로.</li>
	<li>단계 4.4 후 24 h 4% p 1에서 셀을 수정 10 분, PFA 0.2% 그들을 permeabilize Triton X-100 3 분, 실 온에서 1 h에 대 한 10% 당나귀 혈 청 (DS)와 그들을 차단.</li>
	<li>희석, 1: 100에 10%를 각각 다음 단백질의 DS: 인접 관 마커 angiotensinogen (AGT)와 aquaporin 1 (AQP1); 원심 관 마커 E-cadherin; mesangial 마커 CD90/Thy1; 그리고 대 식 세포 마커 EGF 같은 모듈 포함 하 mucin 같이 호르몬 수용 체-1 (f 4/80) 및 차별화 68의 클러스터 (CD68), 그리고 같은 4 ° c.에 하룻밤 세포와 그들을 품 어</li>
	<li>다음날, 검출 어떤 얼룩을 사용 하 여 1: 200-토끼, 반대로 마우스, 또는 반대로 쥐 형광 이차 항 체 45 분. 그림 2A와 같이 마커의 식을 확인 하는 confocal 현미경 검사 법에서 이미지를 걸릴.</li>
	<li>3 일, p 1의 하위 문화 후에 단계 4.5에서에서 설명한 관, mesangial, 및 macrophage 마커 얼룩 하위 문화 및 p 2에서 특성화에 대 한 셀 분리 합니다. 그림 2A와 같이 마커의 식을 확인 하는 confocal 현미경 검사 법에서 얼룩 이미지.</li>
	<li>다음날 3 p 2의 하위 문화에 4.5 단계에서 설명한 관, mesangial, 및 macrophage 마커 얼룩 하위 문화와 특성화 P3에 대 한 셀 분리 합니다. 그림 2A와 같이 마커의 식을 확인 하는 confocal 현미경 검사 법에서 얼룩 이미지.</li>
	<li>조직 얼룩 준비:<ol>
<li>냉동된 야생-타입 및 실 온에서 1 h에 대 한 Col4a3-/- 신장 슬라이드 건조 하 고 그들을 수정 4%와 10 분 대 한 PFA Permeabilize 그들 0.2% 트라이 톤 X-100 10 분 동안 실 온에서 1 h에 대 한 10% 당나귀 혈 청 (DS)와 그들을 차단 하 고. 1: 200에서 4.5 단계에서 설명한 마커 단백질에 대 한 항 체를 추가 하 고 4 ° C에서 밤새 그들을 품 어.</li>
		<li>다음 날, 1: 200-토끼, 반대로 마우스, 또는 반대로 쥐 형광 이차 항 체 45 분으로 어떤 얼룩을 감지 합니다. 그림 2B 와 2c마커의 식을 확인 하는 confocal 현미경 이미지를 가져가 라.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. 미토 콘 드리 아 생체 분석 결과
<ol><li>20000, 30000, 또는 96-잘 microplate에 문화 미디어의 100 μ에 잘 당 40, 000 셀 씨 P1 관 세포 중 코팅 5 μ g/c m2 콜라겐과 난 세포 외 유출 분석 실험 전날.</li>
	<li>센서 카트리지 수 화에 대 한 센서 카트리지 들어올린 각 채우기 교정 솔루션의 200 μ와 접시의 잘. 신중 하 게 카트리지를 로드 다시 교정 솔루션에 센서를 잠수함. 적어도 사용 전에 h 7에 대 한 CO2 없이 37 ° C 오븐에 카트리지를 넣습니다. 최상의 결과 얻으려면 하룻밤 카트리지 수 화 것이 좋습니다.</li>
	<li>화합물을 준비: 8 µ M oligomycin, 9 µ M FCCP, 그리고 포도 당 (1.10 단계에서 설명)과 지방산 (에서 설명한 단계 1.11) 세포 외 유출 분석 결과 미디어에서 20 µ M로 테 논/antimycin A 혼합 준비.</li>
	<li>미디어 변경: 셀 문화 미디어 발음, 포도 당 또는 지방산 분석 결과 미디어의 175 µ L 추가 (은 화합물에 따라, 근무 중인 단계 참조 5.3), 고 37 ° C 공동2에서 1 시간에 대 한 그들을 품 어-무료 보육.</li>
	<li>다음 화합물의 25 µ L 카트리지 포트 로드: 8 μ M oligomycin 포트 A 1 µ M의 최종 농도 달성 하기 위한 (참고: 각 잘 미디어의 175 µ L 포함 됩니다, 화합물 희석된 8 얻을 것 이다 x), 9 μ M 1의 최종 농도 달성 하기 위해 포트 B FCCP µ M (참고: 화합물 희석된 9를 얻을 것 이다으로 각각 잘 포함 미디어의 175 µ L 플러스 포트 A에서 주입 솔루션의 25 µ L, x), 그리고 20 µ M로 테 논/antimycin A 포트 C (참고 각 화합물에 대 한 2 µ M의 최종 농도 달성 하기에 : 화합물 희석된 10를 얻을 것 이다 미디어의 175 µ L 플러스 50 µ L A와 B 포트에서 주입 하는 솔루션의 각 잘 포함 됩니다, x).</li>
	<li>포트 D에 있는 모든 우물과 배경 웰 스 (셀)의 다른 모든 포트에 물을 추가 합니다. 37 ° C 공동2카트리지를 품 어-10 분 동안 무료 보육.</li>
	<li>세포 외 유출 분석기와 컨트롤러를 켭니다.</li>
	<li>분석기 소프트웨어를 열고 다음 프로토콜을 입력:<ol>
<li>표준 분석 결과선택 합니다. 분석 결과 마법사를 누릅니다. 화합물 탭을 사용 하 여 복합 레이아웃을 할당 하 고 실험적인 그룹을 그룹 및 레이블 탭을 사용 하 여. 배경으로 (셀) 없이 빈 우물을 할당 하도록 하십시오.</li>
		<li>프로토콜 탭에서 표 1에 표시 된 대로 사용할 수 있는 명령을 사용 하 여 다음 믹스 및 측정 주기 설정: 보정, 믹스 2 분, 2 분, 대기 3 분을 위한 측정 (이 사이클을 반복이 2-3 배); 포트 A, 2 분 대 혼합을 주사, 2 분, 3 분에 대 한 측정에 대 한 대기 (이 주기 반복 2-3 배); 포트 B를 주입, 2 분 동안 혼합, 2 분, 3 분에 대 한 측정에 대 한 대기 (이 주기 반복 2-3 배); 포트 C를 주입, 2 분 동안 혼합, 2 분, 3 분에 대 한 측정에 대 한 대기 (이 사이클을 반복 2-3 배). 결국 마법사를 누릅니다. 그것은 또한 나중에 사용할 현재 서식 파일을 저장할 수입니다.</li>
		<li>보정을 시작 하려면 시작 을 누릅니다. 분석기 자동으로 배출 플레이트 홀더 그리고 카트리지 플레이트를 삽입에 대 한 요청.</li>
	</ol>
</li>
	<li>교정 단계 이루어집니다 (일반적으로 20-25 분), 셀 접시에 카트리지 플레이트를 변경 하 고 실행을 계속 하려면 프롬프트 명령을 누릅니다.</li>
	<li>실행이 완료 되 면 데이터를 전송 하 고 96 잘 접시를 제거 합니다. 분석 결과 우물의 각 Hoechst (1:1, 000)를 추가 하 고 37 ° c.에 5 분 동안 그들을 품 어 355 nm 여기와 460 nm 방출에서 읽고 Hoechst 형광의 측정에 의해 세포 수를 OCR 데이터를 정상화.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Bielesz, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+notch+signaling+regulates+interstitial+fibrosis+development+in+the+kidneys+of+mice+and+humans.">Epithelial notch signaling regulates interstitial fibrosis development in the kidneys of mice and humans.</a> Journal of Clinical Investigation. 120 (11), 4040-4054 (2010).</li><li>Fabian, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hedgehog-Gli+pathway+activation+during+kidney+fibrosis.">Hedgehog-Gli pathway activation during kidney fibrosis.</a> American Journal of Pathology. 180 (4), 1441-1453 (2012).</li><li>Forbes, J. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluoride-associated+ultrastructural+changes+and+apoptosis+in+human+renal+tubule:+a+pilot+study.">Fluoride-associated ultrastructural changes and apoptosis in human renal tubule: a pilot study.</a> Human &amp; Experimental Toxicology. , (2018).</li><li>Kawai, S., Takagi, Y., Kaneko, S., Kurosawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+three+types+of+mixed+anesthetic+agents+alternate+to+ketamine+in+mice.">Effect of three types of mixed anesthetic agents alternate to ketamine in mice.</a> Experimental Animals. 60 (5), 481-487 (2011).</li><li>Condorelli, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+fluid+shear+stress+on+tubular+kidney+epithelial+cell+structure.">Effect of fluid shear stress on tubular kidney epithelial cell structure.</a> World Congress on Medical Physics and Biomedical Engineering. 25 (10), 50-52 (2009).</li><li>Aschauer, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delineation+of+the+key+aspects+in+the+regulation+of+epithelial+monolayer+formation.">Delineation of the key aspects in the regulation of epithelial monolayer formation.</a> Molecular and Cellular Biology. 33 (13), 2535-2550 (2013).</li><li>George, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+use+of+autologous+renal+cells+from+diseased+kidneys+for+the+treatment+of+renal+failure.">Potential use of autologous renal cells from diseased kidneys for the treatment of renal failure.</a> PLoS One. 11 (10), e0164997 (2016).</li><li>Elberg, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MKL1+mediates+TGF-beta1-induced+alpha-smooth+muscle+actin+expression+in+human+renal+epithelial+cells.">MKL1 mediates TGF-beta1-induced alpha-smooth muscle actin expression in human renal epithelial cells.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 294 (5), F1116-F1128 (2008).</li><li>Elberg, G., Guruswamy, S., Logan, C. J., Chen, L., Turman, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+of+epithelial+cells+derived+from+human+normal+and+ADPKD+kidneys+in+primary+cultures.">Plasticity of epithelial cells derived from human normal and ADPKD kidneys in primary cultures.</a> Cell and Tissue Research. 331 (2), 495-508 (2008).</li><li>Cai, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxicity+of+acetaminophen,+salicylic+acid,+and+caffeine+for+first-passage+rat+renal+inner+medullary+collecting+duct+cells.">Toxicity of acetaminophen, salicylic acid, and caffeine for first-passage rat renal inner medullary collecting duct cells.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 306 (1), 35-42 (2003).</li><li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+epithelial+co-culture+of+mouse+renal+peritubular+endothelial+cells.">Isolation and epithelial co-culture of mouse renal peritubular endothelial cells.</a> BMC Cell Biology. 15, 40 (2014).</li><li>Barros, M. H., Hauck, F., Dreyer, J. H., Kempkes, B., Niedobitek, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+polarisation:+An+immunohistochemical+approach+for+identifying+M1+and+M2+macrophages.">Macrophage polarisation: An immunohistochemical approach for identifying M1 and M2 macrophages.</a> PLoS One. 8 (11), e80908 (2013).</li><li>Kim, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progression+of+Alport+kidney+disease+in+Col4a3+knock+out+mice+is+independent+of+sex+or+macrophage+depletion+by+clodronate+treatment.">Progression of Alport kidney disease in Col4a3 knock out mice is independent of sex or macrophage depletion by clodronate treatment.</a> PLoS One. 10 (11), e0141231 (2015).</li><li>Linnett, P. E., Beechey, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitors+of+the+ATP+synthethase+system.">Inhibitors of the ATP synthethase system.</a> Methods in Enzymology. 55, 472-518 (1979).</li><li>Bockenhauer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Renal+phenotype+in+Lowe+Syndrome:+a+selective+proximal+tubular+dysfunction.">Renal phenotype in Lowe Syndrome: a selective proximal tubular dysfunction.</a> Clinical Journal of the American Society of Nephrology. 3 (5), 1430-1436 (2008).</li><li>Ranawaka, R., Dayasiri, K., Gamage, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+child+with+distal+(type+1)+renal+tubular+acidosis+presenting+with+progressive+gross+motor+developmental+regression+and+acute+paralysis.">A child with distal (type 1) renal tubular acidosis presenting with progressive gross motor developmental regression and acute paralysis.</a> BMC Research Notes. 10 (1), 618 (2017).</li></ol>

저자는 선언할 수 없다.

우리 마우스 신장 관 상피 세포 (TECs)의 효율적인 절연을 허용 하는 프로토콜을 최적화 하 고 그 셀 하위 존재 지방산-미토 콘 드리 아 호흡을 평가 하는 세포 외 유출 분석에 대 한 교양 있을 수 있습니다 보였다 또는 포도 당-기반 기판입니다. 이 프로토콜 인접 및 원심 관 세포에 초점을 맞추고 연구 설계 및 TEC 병리학 관련 신장 질병의 이해에 대 한 더 복잡 한 실험을 구축 하는 프레임 워크 역할. 이전에 게시 프로토콜9,,1019에 비해,이 필요 하지 않습니다 긴 원심 분리 시간 또는 충분 한 항 체 사용 그라데이션 분판을 정렬 방법과, 따라서, 더 많은 제공 합니다. 신장 관 대사 분야에서 일 하는 연구원에 대 한 효율적이 고 최적화 된 가이드. 소화, 다시 컬렉션 및 도금 밀도 세포 외 유출 분석 결과 대 한 복합 최적화를 포함 하 여이 프로토콜에 몇 가지 중요 한 단계가 있다.
콜라와 최적 농도의 올바른 유형을 선택 신장 조직에서 성공적인 소화 관 세포의 분리에 열쇠 이다. Collagenases의 다른 종류에 비해, 2 형 콜라 효소 활동, 소형 신장 구조를 해리의 능력의 상대적으로 높은 수준을 포함 합니다. 장기 관류와 소화 시간 오염 가능성을 최소화 하려면 0.013 %2 형 콜라는 30 mL/min에 끼얹는다. 신장 캡슐 두 신장 동물에서 수확 하 고 멸 균된 셀 문화 후드로 전송 했다 후에 제거 되었다. 신장 작은 조각으로 다진 했다 고 소화 버퍼를 완전 한 소화 관 세포의 최대한 출시에 대 한 또 다른 5 분의 10 mL와 함께 그들의 부 화를 계속 했다.
하지만, 소화, 후 조직 정지는 매우 큰 조직 조각을 제거를 70 µ m 필터를 통해 전달 됩니다, 아직 소화 되지 않은 tubules 필터를 통과 하 고 세포 현 탁 액 내 문화 접시에 도금을 얻이 있을 것입니다. 그것은 이러한 tubules를 관 세포를 문화 접시를 단단히 연결에 대 한 정상 보다 더 긴 시간이 걸립니다. 따라서, 세포 현 탁 액을 수집 하 여 작은 첨부 되지 않은 tubules 및 셀 셀 도금 후 두 번째 날을 원심 오히려 중요 하다. 이 저속 원심 분리 단계는 더 관 세포 보다는 다른 세포 유형 제거 하 고 첨부 되지 않은 tubules 및 관 세포 정착.
적절 한 셀 밀도의 식별 성공적인 세포 외 유출 분석 결과 대 한 첫 번째 주요 단계입니다. 결과 XF96 microplate에 잘 당 40, 000 셀 기본 관 셀 지방산과 포도 당 기반 호흡 분석 결과 (그림 3C)에 대 한 이상적입니다 나타났다. 이 프로토콜에서 격리 된 관 세포 구절 1과 2에서 세포 외 유출 분석 결과 대 한 사용 되었다. 하위 3, 비록 그들이 유지 관 표식 (그림 2)와 (그림 3A), 생체 분석 실험에서 괜찮은 성능을 표현의 통로 2에 비해 감소 기저 호흡 수준을 보여주었다 통로를 경작 하는 세포 ( 그림 3C를 그림 3A 의 오른쪽 패널에서 OCR을 비교 하 여 표시). 이 감소는 (예를 들어 젊은 야생-타입 마우스에서 고립 된 사람) 실질적으로 건강 한 관 세포에 영향을 미치지 않을 수 있습니다. 그러나, 이미 저하 미토 콘 드리 아 호흡 CKD 마우스 모델에서 격리 하는 셀에 대 한 연구, 대 한 세포의 높은 구절 기저 호흡 세포 외 유출 분석 결과의 결과 영향을 미칠 것 이라고 더 감소를 발생할 수 있습니다. 연구에서 통로 1 및 보여준 높은 통로 2 기저 호흡 수준에서 세포, 실시. 따라서,이 프로토콜에 따라 모두 건강 하 고 병에 걸린 동물에서 분리 된 세포와 미토 콘 드리 아 호흡 연구에 대 한 이러한 두 초기 구절을 사용 하 여 것이 좋습니다. 통로 2에서 셀 통로 1 하위 문화 플럭스 분석 결과 대 한 충분 한 세포를 생성 하지 않습니다 경우 고려 사항으로가지고 아직도 한다. 생체 연구 뿐만 아니라 우리의 이전 연구 통로 3에 기본 TECs 단백질 및 RNA 연구 (데이터 표시 되지 않음) 화합물과 치료에 대 한 매우 유용한 수 있습니다 보여줍니다. 그 말했다 하 고, 좋습니다 조사 관 세포를 분리 하는이 프로토콜을 사용 하 여 다른 연구 응용 프로그램에 대 한 최적의 통로 선택 신중 하 게 해야 한다.
세포 외 유출 분석의 작동 원리 삽입 된 화합물과 호흡 사슬 복합물 및는 uncoupler의 효과 사이의 상호 작용을 기반으로 합니다. Oligomycin 복잡 한 V (ATP synthase)의 억제제 이며 ATP 연결 산소 소비와 미토 콘 드리 아 내 막32에 걸쳐 일반 양성자 누출을 극복 하는 데 필요한 산소 소비를 구별 하는 데 사용 합니다. FCCP 미토 콘 드리 아 막 잠재력을 방해 하 여 ATP 생산에서 산소 소비를 uncouples. 따라서, 그것은 그것은 멤브레인을 통해 양성자 전송 함으로써 ATP synthase에 의해 양성자 이온 경과의 제한 된 용량 circumvents로 최대한 호흡 능력의 측정을 제공 한다. Antimycin-A, 복잡 한 III 억제제, 그리고로 테 논, 복잡 한 내가 차단, 허용은 미토 콘 드리 아 대 사이 감 별 법에 비-미토 콘 드 리아 산소 소비 전체 미토 콘 드리 아 호흡을 조합에서 이용 된다 셀입니다. 이 화합물은 최적의 OCR 곡선을 생성 하는 최적의 농도 결정 하는 세포 외 유출 분석 결과 전에 특정 셀 형식에 대 한 항상 적정 한다. 여기, oligomycin, FCCP의 1 개의 µ M 그리고로 테 논/antimycin A 기본 TECs에 세포 외 유출 분석 결과 대 한의 2 µ M의 1 µ M이 좋습니다.
결론적으로,이 프로토콜에는 신장 주 근 및 원심 관 상피 세포 미토 콘 드리 아 생체 비보 전평가에 사용할 수 있는 격리 하는 간단 하 고 비용 효율적인 방법을 제공 합니다. 이 프로토콜은 신장 관 상피 세포의 생물학 기능을 탐구 하는 분자 생물학 연구의 넓은 범위에서 유용할 수 있습니다, 우리 순수 인접 또는 원심 tubules를 필요로 하는 연구에 적용의 한계 인정 합니다. 예를 들어 로우 증후군, 선택적인 근 관 부전33또는 원심 신장 관 산 성 증, 원심 관 부전34에 대 한 연구에 대 한 연구 필요 더 정교한 프로토콜 셀 격리 및 정화입니다. 그러나, tubules 대 glomeruli, 비교 연구의 대다수 및 연구 관 세포에 잠재적인 미토 콘 드리 아 호흡 레 귤 레이 터를 일반적으로 화면에 가능한 높은 처리량 접근을 프로토콜에 제공 합니다. 따라서,이 프로토콜 광범위 한 응용 프로그램에서 미토 콘 드리 아 역 기능 약물 발견 또는 대상 유효성 검사 목적으로 신장 장애와 관련 된 공부를 할 수 있습니다.

신장 관 상피 세포 (TEC) 기능 신장의 전반적인 건강 상태와 강하게 연결 됩니다. 신장에 병 적인 신호 신장 섬유 증 및 만성 신장 병 (CKD)1,2에서 중요 한 역할을, TECs dedifferentiation을 발생 합니다. 높게 정력적 인 기관으로 신장은 주로 미토 콘 드 리아 산화 인 산화3통해 산소 소비량, 심장에만 두 번째. 전자 현미경 연구는 미토 콘 드 리아 형태학 변화 신장 tubules4병 적인 이벤트의 긍정적인 상관 관계를 밝혀 있다. TECs 미토 콘 드 리아 장애 신장 섬유 증에 엽 상피 전환5 와 불완전 지방산 산화6통해 발생합니다. 섬유 증은 CKD 귀착되는 진보적인 신장 병 리 이다. 따라서, 신장 TECs의 에너지 상태를 이해 CKD의 이상 발견 하는 필요 이다.
성인 신장7> 20 종류 있다. TECs의 기능을 공부, 신장 상피 세포의 기본 문화 화학 치료 및 유전자 조작 등 분자 생물학 응용 프로그램을 위한 플랫폼으로 필요 하다. 중요 한 것은, 유전자 조작은 vivo에서 쥐 transgenesis 또는 고립 된 주 세포 유전자 조작 이미 것 있도록 AAV 유전자 전달 기법8 을 사용 하 여 수행할 수 있습니다. 마우스9,10, 쥐11,,1213,14개, 토끼15,16및 인간17에서 기본 신장 관 세포의 고립 ,18 순수 근 관 세포를 정화 단계와 보고 되었습니다. 이 이전에 게시 프로토콜 인접 관 세포의 고립에 초점을, 그라데이션 원심 분리 및 실험 정렬 정화 목적으로19수행 했다. 이러한 프로토콜 인접 tubules 공부에 대 한 귀중 한 동안, 그들은 충분 하지 않습니다 인접 및 원심 tubules 공부 하는 데 필요한 때. 예를 들어 Alport 증후군에 대 한 우리의 연구는 인접 및 원심 신장 tubules20질병 진행 중요 한 역할을 따라서 신장 tubules의 두 종류 문화 조사 한다 밝혔다. 신장 불 화물 독성에 대 한 최근 연구는 또한 병리학 변화 모두는 근 위 및 원심 tubules21에서 개최 했다 다는 것을 보여주었다. 따라서,이 격리 프로토콜 설계 및 시 약 및 간단한 절차의 최소한의 비용으로 마우스 신장에서 인접 하 고 원심 관 세포에 대 한 최적화. 또는 수 사관 수 여전히 프로토콜 단계 3.1까지 따라 하 고 순수한 근 관 세포의 고립에 대 한이 시점에서 정화 단계9 를 추가.
고립 된 세포 높은 에너지 레벨을 제시 하 고 4 구절에 하위 문화 후 신장 상피 특성을 유지. 높은 처리량 세포 외 유출 분석기를 사용 하 여, 우리 셀 밀도 최적화로 더 통찰력에 이르게는 96 잘 접시에서 격리 TECs에서 직접 미토 콘 드리 아 호흡을 평가 합니다. 이러한 관찰이이 프로토콜 신장 TECs의 일관 된, 잘 표준화 된 생산 신장 관 ex vivo 연구에 적용할 수 있는 것이 좋습니다. 이 프로토콜의 추가 의미 신장 근 위 및 원심 관 세포에서 미토 콘 드리 아 생체 ex vivo 특성에 대 한 높은 처리량 도구로 그것의 가능한 사용 이다. 따라서, 그것은 약물 발견 또는 신장 질환의 약물 특성화 목적을 위한 플랫폼으로 사용할 수 있습니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Collagen I Rat Protein, Tail</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A1048301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid</td>
			<td>J.T.Baker</td>
			<td>9508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type II</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS004176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Renal Epithelial Cell Growth Medium 2 Kit</td>
			<td>PromoCell</td>
			<td>C-26130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Deoxy glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Carnitine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C0283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Etomoxir</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E-1905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>75351</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R8875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin-A</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8674</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium palmitate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine 200mM solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM powder</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5030-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>LifeTechnologies</td>
			<td>H3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Staining (0.4%)</td>
			<td>LifeTechnologies</td>
			<td>T10282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counting Slides</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>145-0011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Dissecting Forceps</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC10 automated cell counter</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>506BR2119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MINIPULS 3 Peristaltic Pump</td>
			<td>Gilson Inc.</td>
			<td>GM3P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe96 Analyzer</td>
			<td>Seahorse Bioscience</td>
			<td>S7800A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe96 FluxPack (includes sensor cartridges, microplates, and calibrant)</td>
			<td>Seahorse Bioscience</td>
			<td>10260-100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation, characterization, and high throughput extracellular flux analysis of mouse primary renal tubular epithelial cells

신장 관 상피 세포 (TECs)에서 미토 콘 드 리아 기능 장애는 신장 섬유 증, 만성 신장 병 (CKD)의 주요 원인으로 이어질 수 있습니다. 따라서, 기본 TECs 미토 콘 드 리아 기능 평가 CKD의 이상에 대 한 통찰력을 제공 하는 셀의 bioenergetic 상태에 귀중 한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 분리와 다른 종에 인접 tubules의 정화 하는 데 사용할 수 있는 복잡 한 프로토콜 수 있지만, 필드 정화에 대 한 필요 없이 관 세포 격리에 대 한 최적화 된 비용 효율적인 방법을 결여 된다. 여기, 우리는 두 주에 초점을 맞추고 연구 인접 하 고 원심 신장 TECs 마우스에 대 한 수 있는 격리 프로토콜을 제공 합니다. 비용 효과적인 시 약 및이 프로토콜에 필요한 최소한의 동물 절차, 고립 된 세포 격리 후 높은 에너지 레벨을 유지 하 고 하위 4 구절, 지속적인 연구에 대 한 허용 최대 경작 될 수 있다. 또한, 우리는 우리 세포 밀도 및 화합물 농도의 최적화에 대 한 권장 사항을 제공 96 잘 접시에 격리 TECs에서 직접 미토 콘 드리 아 호흡을 평가 높은 처리량 세포 외 유출 분석기를 사용 하 여. 이러한 관측 신장 TECs의 일관 된, 잘 표준화 된 생산 신장 관 ex vivo 연구이 프로토콜을 사용할 수 있는 것이 좋습니다. 이 프로토콜은 광범위 한 미래의 응용 프로그램에서 약물 발견 또는 마약 특성화 목적에 대 한 신장 장애와 관련 된 미토 콘 드 리아 기능 장애 연구 할 수 있습니다.

신장 관류 및 소화 얻을 매우 가능한 관 상피 세포: 마우스 신장 관 상피 세포 격리 프로토콜 위에서 설명한 섹션 1-3에에서 설명 된 단계를 따라 했다.
소화, 후 신장 세포, 불완전 하 게 소화 tubules 및 70 µ m 보다 작은 다른 조직 파편의 이종 인구 격리 당일 문화 접시에 도금 했다. 변경 0 1 일 후 격리 보통 셀 첨부 파일에만 아니라 세포 성장에 볼 것으로 예상 됩니다. 부동 이기종 인구 통해 찾고 몇 관 셀만 하루 1 (그림 1A)에 붙어 있었다. 하루 1 셀, 원심 분리, 그리고 다시 도금의 다시 컬렉션 가벼운 파편을 제거 하 고 관 셀 릴리스에 대 한 작은 관 조각 정착을 도움. 3 일에 1 일에서 더 나은 셀 첨부 파일 뿐만 아니라 (그림 1A) 1 일에 비해 3 배 세포 밀도와 관찰 되었다 눈에 띄게 향상 된 세포 성장 율에 변화가 예상 했다. 초기 성장 단계에서 셀 여러 식민지를 형성 하 고 식민지 주위 채워집니다. 이 시점에서 앞으로, 격리 된 세포 완 치 했다 고 건강 한 확산을 표시. 일별 5 셀 셀 셀 및 식민지 식민지 사이의 일부 공백을 60 mm 페 트리 접시에 80-90 %confluency (그림 1A) 했다.
하위 문화와 격리 된 관 세포의 특성: 격리 된 신장 관 상피 세포 하위 특성 다음 단계는 위에서 설명한 프로토콜의 섹션 4에에서 명시 된에 대 한 교양 했다.
5 일에서 셀 완전히 고립에서 발견 하 고 적극적으로 확산 하기 시작 했다. 1 주일 후 격리, 셀 60 mm 페 트리 접시에 confluency 되었다. 1 주일 후 통로 0에 문화에서 셀 통로 1 하 고, 그 후, 2 더 많은 구절을 하위 경작 될 준비 했다. 비슷한 성장 패턴 1 통로 및 통로 2에서 관찰 되었다. 일반적으로, 그것은 1과 2 추가 하위 문화 (그림 1B)에 대 한 confluency 성장에 통로에 셀에 대 한 1 주일 미만 걸립니다. Confluent 셀 통로 0에서 통로 2는 광범위 한 돔 형성23,24 (그림 1B), 고립 된 세포를 건강 한 유지 하는 것을 건의 했다 상태로 어디 그들은 비슷한 액체를 배설의 지속적인 문화 하는 비보에 상태. 이 접시에서 리프트 하지만 꽉 연결을 통해 연결 상태를 유지 하는 세포의 단층을 발생 합니다.
문화에 있는 세포의 특성, 우리는 immunofluorescent 얼룩이 지는 제어 셀 라인-인간 근 신장 상피 홍콩-2 셀에 뿐만 아니라 통로 4를 통해 통행 1에서에서 경작된 한 세포에 수행 합니다. 근 관 마커, aquaporin 1 (AQP1)25 및 angiotensinogen (AGT)9, 원심 관 마커 E cadherin25, 상피 마커 부드러운 근육 걸 (SMA)26,27,28, 대 식 세포 마커 F4/8029 와 CD6830, 그리고 mesangial 마커 thymocyte 차별화 항 1 (Thy1/CD90)9 특성 연구를 위해 사용 되었다. 두 근 관 단백질 AQP1 및 AGT 일관 되 게 높은 긍정적인 제어 홍콩 2 근 상피 세포 (그림 2A)에서 통로 4도 1 통로에서 격리 된 관 세포에 표현 되었다. 원심 관 단백질 E cadherin 통로 4 통해 격리 된 관 세포에 표현 하 고 또한 홍콩-2 셀 (그림 2A)에서 관찰 되었다. SMA는 제어 홍콩-2 셀, 게시 된 보고서26,27일치에 격리 된 관 세포에 풍부 하 게 표현 했다. 다른 한편으로, mesangial 단백질 Thy1 및 대 식 세포 단백질 F4/80 결 석 했다 고립 된 관 세포에 제어 홍콩-2 셀 (그림 2A). CD68 홍콩-2 셀에는 최소한의 식 그리고 통로 1 및 통로 2, 그리고 그 표현에서 고립 된 관 세포에서 3 통과 통로 4 (그림 2A)에서 탐지 되었다. 결과이 프로토콜에 따라 고립 된 세포는 인접 하 고 원심 관 세포의 혼합 것이 좋습니다. 이러한 마커 단백질에서 생체 내에의 식을 비교 하려면 우리 냉동된 신장 조직에 얼룩 수행. 관 마커, 높은 표현 야생-타입 건강 한 마우스 (그림 2B)에서 수확 하는 신장에 발견 되었다 AQP1, AGT, 및 E-cadherin mesangial 단백질 Thy1를 포함 하 여. F4/80 및 CD68의 낮은 표현 야생-타입 신장에서 관찰 하지만 신장 신장 실패는 대 식 세포 침투20,31 ( 를 개발 Col4a3-/- 마우스에서 수확에 광범위 하 게 표현 그림 2C).
고립 된 주 관 세포에서 미토 콘 드리 아 생체 분석 결과: 미토 콘 드리 아 호흡 시험 단계는 위에서 설명한 프로토콜의 섹션 5에에서 설명 되어 있습니다.
고립 된 주 관 세포의 미토 콘 드리 아 호흡 산소 소비 속도 (OCR) 다른 도금 밀도에 한 세포 외 유출 분석에 의해 측정 됩니다. 도금 밀도 적정에 20000, 30000, 40000 기본 TECs 잘 당 했다 시드 96 잘 XF96 microplate에 하루 전에 (약 20 전에 h) 세포 외 유출 분석 결과 (그림 3A). 세포 외 유출 분석에 따라 OCR 측정 했다 다음 셀 카운트에 Hoechst 얼룩의 정량화에 의해 정규화 됩니다. 도금 TECs에 20000, 30000, 또는 40, 000 셀/잘 결과 25, 45, 또는 50 pmol/min의 평균 기저 OCR에 각각 (그림 3A). 또한, 도금된 세포의 현미경 이미지 공개 40, 000 셀/잘 적용 (그림 3B) 다른 도금 밀도 보다 더 미 판 우물의 바닥의 전체 표면. 최대한 OCR 30000 세포의 밀도에 비해 40, 000 셀을 사용 하 여 증가 하지 않았다, 비록 셀/잘 셀과 화합물 사이의 최적의 상호 작용을 위해 약 40, 000의 세포 밀도 권장 합니다.
또한, 우리의 실험에서 억제/uncoupler 화합물의 최적 농도 1 µ M oligomycin, 1 µ M FCCP와 2 µ M로 테 논/antimycin-A (세포 외 유출 분석 결과 및 포트 주사의 프로토콜 표 1에에서 나열 된 것으로 표시 했다 ; 최적화 실험 표시 되지 않습니다). 그러나,이 좋습니다 이상적으로 낮은 하 고 게시 된 값 보다 더 높은이 화합물의 다양 한 농도와 예비 테스트를 실행 하는 모든 사용자에 대 한 최상의 결과 보증 하기 위하여.
세포 외 유출 분석 결과 신장 TECs의 생체를 평가 하기 위한 중요 한 매개 변수를 생성 합니다. 예를 들어, 지방산 산화 특히 TECs에 결함이 있는 것 같이 지방산 기판 (물)의 분해 (2 DG) 억제제와 함께 포함 된 미디어의 사용으로 사용할 수 있습니다 직접 TECs에서 지방산 산화를 평가 하는 유용한 도구 구절 들 1, 2 (그림 3C)에서 신장 섬유 증의 경우 셀의 전반적인 호흡 용량 포도 당 기반 미디어 수 있습니다 어떤 차이 공개 하지도 건강 한 신장 보다 낮은 될 것으로 예상 된다.
함께 찍은, 세포 외 유출 분석 결과, 특히 지방산 산화 용량을 평가 하기 위해 이용 될 수 있다 신장 TECs 생체 프로 파일 재생에 영향을 미치는 어떤 병 적인 변화에의 에너지 상태를 평가 하는 유익한 수단으로는 주요 역할 신장 섬유 증과 신부전을 진행.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>단계</td>
			<td>시간 (분)</td>
		</tr>
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<td>보정</td>
			<td></td>
		</tr>
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<td>Equilibrate:</td>
			<td>00시 12분: 00</td>
		</tr>
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<td>측정 1</td>
			<td>3 루프</td>
		</tr>
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<td>믹스</td>
			<td>00시 02분: 00</td>
		</tr>
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<td>대기</td>
			<td>00시 02분: 00</td>
		</tr>
<tr>
<td>측정</td>
			<td>00시 03분: 00</td>
		</tr>
<tr>
<td>믹스</td>
			<td>00시 02분: 00</td>
		</tr>
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<td>대기</td>
			<td>00시 02분: 00</td>
		</tr>
<tr>
<td>측정</td>
			<td>00시 03분: 00</td>
		</tr>
<tr>
<td>믹스</td>
			<td>00시 02분: 00</td>
		</tr>
<tr>
<td>대기</td>
			<td>00시 02분: 00</td>
		</tr>
<tr>
<td>측정</td>
			<td>00시 03분: 00</td>
		</tr>
<tr>
<td>주사 (1 μ M Oligomycin) 포트</td>
			<td>2 루프</td>
		</tr>
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<td>믹스</td>
			<td>00시 02분: 00</td>
		</tr>
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<td>대기</td>
			<td>00시 02분: 00</td>
		</tr>
<tr>
<td>측정</td>
			<td>00시 03분: 00</td>
		</tr>
<tr>
<td>믹스</td>
			<td>00시 02분: 00</td>
		</tr>
<tr>
<td>대기</td>
			<td>00시 02분: 00</td>
		</tr>
<tr>
<td>측정</td>
			<td>00시 03분: 00</td>
		</tr>
<tr>
<td>포트 B (1 μ M FCCP) 주사</td>
			<td>2 루프</td>
		</tr>
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<td>믹스</td>
			<td>00시 02분: 00</td>
		</tr>
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<td>대기</td>
			<td>00시 02분: 00</td>
		</tr>
<tr>
<td>측정</td>
			<td>00시 03분: 00</td>
		</tr>
<tr>
<td>믹스</td>
			<td>00시 02분: 00</td>
		</tr>
<tr>
<td>대기</td>
			<td>00시 02분: 00</td>
		</tr>
<tr>
<td>측정</td>
			<td>00시 03분: 00</td>
		</tr>
<tr>
<td>포트 C (2 μ M Rotenon/Antimycin)을 주사</td>
			<td>2 루프</td>
		</tr>
<tr>
<td>믹스</td>
			<td>00시 02분: 00</td>
		</tr>
<tr>
<td>대기</td>
			<td>00시 02분: 00</td>
		</tr>
<tr>
<td>측정</td>
			<td>00시 03분: 00</td>
		</tr>
<tr>
<td>믹스</td>
			<td>00시 02분: 00</td>
		</tr>
<tr>
<td>대기</td>
			<td>00시 02분: 00</td>
		</tr>
<tr>
<td>측정</td>
			<td>00시 03분: 00</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1입니다. 기본 관 세포에 최적의 OCR 측정에 대 한 프로토콜을 실행 하는 세포 외 유출 분석 표준화.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57718/57718fig1.jpg"> 그림 1입니다. 세포 격리 된 기본 관 세포의 배양. (A) 격리 기본 관 셀 일찍 하루 1에서 연결 및 견고 하 게 3 일에서 5 일 성장. 10 X 20 X 목적과 이미지에서 가져옵니다. (B)이이 패널 통로 3에 통로 0에서 격리 된 기본 관 세포의 하위 문화를 보여줍니다. 10 배, 20 X 목표 셀 돔 및 형태학 상 변화는 구절을 통해의 비전에 대 한 40 X 목표 아래 비전에 대 한 이미지에서 가져옵니다. scalebar = 100 µ m. <a href="/files/ftp_upload/57718/57718fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57718/57718fig2.jpg"> 그림 2입니다. 고립 된 주 관 세포의 특성. (A) Immunostaining (AQP1, AGT) 근 관 단백질, 원심 관 단백질 (E-cadherin), 상피 단백질 (SMA), mesangial 단백질 (Thy1), 및 대 식 세포 단백질 (F4/80, CD68)에 대 한 항 체와 격리 된 주 쇼 관 세포 및 이후의 하위 문화는 순수 인접 하 고 원심 관 세포 이다. (B)이이 패널 긍정적인 제어 및 아니 기본 부정적인 제어로 근 관, 원심 관, 및 건강 한 야생-타입 마우스에서 신장 조직에서 mesangial 단백질의 얼룩을 보여줍니다. (C)이이 패널 긍정적인 컨트롤로 Col4a3-/- 마우스에서 수집 하는 신장 조직에서 대 식 세포 단백질 F4/80 및 CD68의 얼룩을 보여줍니다. Scalebar = 20 µ m. DAPI에서 파란색으로 표시 됩니다. 마커 단백질은 녹색으로 표시 됩니다. <a href="/files/ftp_upload/57718/57718fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57718/57718fig3.jpg"> 그림 3입니다. 다른 도금 밀도에 고립 된 주 관 세포 분석 결과 세포 외 유출. (A) 증가 세포 밀도 도금 향상 기본 관 세포에서 기저 호흡 레벨 통로 3에서 테스트. (B)이이 패널이 보여줍니다 현미경 기본 관 세포의 경작 20000, 30000, 40000 셀/잘 밀도에서 시드 XF96 microplate에. Scalebar = 100 µ m. (C)이이 패널 구절 2와 1에서 기본 관 세포에서 지방산 또는 포도 당-기반 세포 외 유출 분석 결과 보여줍니다. 데이터는 평균 ± SEM. <a href="/files/ftp_upload/57718/57718fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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Isolation, Characterization, And High Throughput Extracellular Flux Analysis of Mouse Primary Renal Tubular Epithelial Cells

마우스 기본 신장 관 상피 세포의 고립, 특성, 및 높은 처리량 세포 외 유출 분석

이 프로토콜에는 분리 하 고 마우스 기본 신장 관 세포 이후에 하위 신장 생물학 기능 비보 전, 미토 콘 드리 아 생체를 포함 하 여 평가 양식 수 있는 특성화 하는 비용 효율적인 접근 방식을 제공 합니다.

Mitochondrial dysfunction in the renal tubular epithelial cells (TECs) can lead to renal fibrosis, a major cause of&#160;chronic kidney disease (CKD). ...

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Research

JoVE Journal

Biology

17.2K 조회수.  University of Miami Leonard M. Miller School of Medicine. 이 프로토콜에는 분리 하 고 마우스 기본 신장 관 세포 이후에 하위 신장 생물학 기능 비보 전, 미토 콘 드리 아 생체를 포함 하 여 평가 양식 수 있는 특성화 하는 비용 효율적인 접근 방식을 제공 합니다.

비디오: Isolation, Characterization, And High Throughput Extracellular Flux Analysis of Mouse Primary Renal Tubular Epithelial Cells

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing measurement of multiple cellular phenotypes within a single assay. In this study, we utilized HCA to develop a novel assay for neurotoxicity. Neurotoxicity assessment represents an important part of drug safety evaluation, as well as being a significant focus of environmental protection efforts. Additionally, neurotoxicity is also a well-accepted in vitro marker of the development of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's and Parkinson's diseases. Recently, the application of HCA to neuronal screening has been reported. By labeling neuronal cells with &beta;III-tubulin, HCA assays can provide high-throughput, non-subjective, quantitative measurements of parameters such as neuronal number, neurite count and neurite length, all of which can indicate neurotoxic effects. However, the role of astrocytes remains unexplored in these models. Astrocytes have an integral role in the maintenance of central nervous system (CNS) homeostasis, and are associated with both neuroprotection and neurodegradation when they are activated in response to toxic substances or disease states. GFAP is an intermediate filament protein expressed predominantly in the astrocytes of the CNS. Astrocytic activation (gliosis) leads to the upregulation of GFAP, commonly accompanied by astrocyte proliferation and hypertrophy. This process of reactive gliosis has been proposed as an early marker of damage to the nervous system. The traditional method for GFAP quantitation is by immunoassay. This approach is limited by an inability to provide information on cellular localization, morphology and cell number. We determined that HCA could be used to overcome these limitations and to simultaneously measure multiple features associated with gliosis - changes in GFAP expression, astrocyte hypertrophy, and astrocyte proliferation - within a single assay. In co-culture studies, astrocytes have been shown to protect neurons against several types of toxic insult and to critically influence neuronal survival. Recent studies have suggested that the use of astrocytes in an in vitro neurotoxicity test system may prove more relevant to human CNS structure and function than neuronal cells alone. Accordingly, we have developed an HCA assay for co-culture of neurons and astrocytes, comprised of protocols and validated, target-specific detection reagents for profiling &beta;III-tubulin and glial fibrillary acidic protein (GFAP). This assay enables simultaneous analysis of neurotoxicity, neurite outgrowth, gliosis, neuronal and astrocytic morphology and neuronal and astrocytic development in a wide variety of cellular models, representing a novel, non-subjective, high-throughput assay for neurotoxicity assessment. The assay holds great potential for enhanced detection of neurotoxicity and improved productivity in neuroscience research and drug discovery.

This article describes a novel protocol and reagent set designed for sensitive measurement of neurotoxic effects of compounds and treatments on co-cultures of neurons and astrocytes using high content analysis. Results demonstrate that high content analysis represents an exciting novel technology for neurotoxicity assessment.

Neurotoxicity 높은 컨텐츠 분석의 연결 및 Astrocyte 공동 문화 분석

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

연구

생물학

Isolation of Primary Mouse Trophoblast Cells and Trophoblast Invasion Assay

The placenta is responsible for the transport of nutrients, gasses and growth factors to the fetus, as well as the elimination of wastes. 
Thus, defects in placental development have important consequences for the fetus and mother, and are a major cause of embryonic lethality. The major cell type of the 
fetal portion of the placenta is the trophoblast. Primary mouse placental trophoblast cells are a useful tool for studying normal and abnormal placental development, 
and unlike cell lines, may be isolated and used to study trophoblast at specific stages of pregnancy. In addition, primary cultures of trophoblast from transgenic
mice may be used to study the role of particular genes in placental cells. The protocol presented here is based on the description by Thordarson et al.1, in which a 
percoll gradient is used to obtain a relatively pure trophoblast cell population from isolated mouse placentas. It is similar to the more widely used methods for 
human trophoblast cell isolation2-3. Purity may be assessed by immunocytochemical staining of the isolated cells for cytokeratin 74. Here, the isolated cells are 
then analyzed using a matrigel invasion assay to assess trophoblast invasiveness in vitro5-6. The invaded cells are analyzed by immunocytochemistry and stained 
for counting.

In this protocol, we describe the dissection of placentae from the mouse on pregnancy d10.5, followed by isolation of trophoblast cells using a Percoll gradient. We then demonstrate use of the isolated cells in a matrigel invasion assay.

기본 마우스 Trophoblast 셀 및 Trophoblast의 침략 분석의 절연

The placenta is responsible for the transport of nutrients, gasses and growth factors to the fetus, as well as the elimination of wastes.  
Thus, defects ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during development. Misregulation of this process has been implicated as a key event in fibrosis and the progression of carcinomas to a metastatic state. Understanding the processes that underlie EMT is imperative for the early diagnosis and clinical control of these disease states. Reliable induction of EMT in vitro is a useful tool for drug discovery as well as to identify common gene expression signatures for diagnostic purposes. Here we demonstrate a straightforward method for the induction of EMT in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells pre- and post-EMT induction by immunocytochemistry are also included. Additionally, we demonstrate the effectiveness of this method through antibody-based array analysis and migration/invasion assays.

A straightforward method is described for the induction of epithelial to mesenchymal transition (EMT) in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells in EMT states by immunocytochemistry are included.

간엽 전환을 유도하고 상피의 분석

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one week. More than 20 x 106 acinar cells can be obtained from a single murine pancreas. This protocol offers the possibility to independently process as many as 10 pancreases in parallel. Because it preserves acinar architecture, this model is well suited for studying the physiology of the exocrine pancreas in vitro in contrast to cell lines established from pancreatic tumors, which display many genetic alterations resulting in partial or total loss of their acinar differentiation.

In this publication, we describe a rapid and convenient procedure for isolating and culturing primary pancreatic acinar cells from the murine pancreas. This method constitutes a valuable approach to study the physiology of fresh primary normal/untransformed exocrine pancreatic cells.

마우스 기본 췌장 포상 세포의 분리 및 문화

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

Application of Retinoic Acid to Obtain Osteocytes Cultures from Primary Mouse Osteoblasts

The need for osteocyte cultures is well known to the community of bone researchers; isolation of primary osteocytes is difficult and produces low cell numbers. Therefore, the most widely used cellular system is the osteocyte-like MLO-Y4 cell line.
The method here described refers to the use of retinoic acid to generate a homogeneous population of ramified cells with morphological and molecular osteocyte features.
After isolation of osteoblasts from mouse calvaria, all-trans retinoic acid (ATRA) is added to cell medium, and cell monitoring is conducted daily under an inverted microscope. First morphological changes are detectable after 2 days of treatment and differentiation is generally complete in 5 days, with progressive development of dendrites, loss of the ability to produce extracellular matrix, down-regulation of osteoblast markers and up-regulation of osteocyte-specific molecules.
Daily cell monitoring is needed because of the inherent variability of primary cells, and the protocol can be adapted with minimal variation to cells obtained from different mouse strains and applied to transgenic models. 
The method is easy to perform and does not require special instrumentation, it is highly reproducible, and rapidly generates a mature osteocyte population in complete absence of extracellular matrix, allowing the use of these cells for unlimited biological applications.

Treatment of primary mouse osteoblasts with retinoic acid produces a homogeneous population of ramified cells bearing morphological and molecular features of osteocytes. The method overcomes the difficulty of obtaining and maintaining primary osteocytes in culture, and can be advantageous to study cells derived from transgenic models.&#160;

기본 마우스 조골 세포에서 골 세포 배양을 구하는 레티노 산의 적용

The need for osteocyte cultures is well known to the community of bone researchers; isolation of primary osteocytes is difficult and produces low cell ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays focus on transcriptional regulation, being essentially aimed at the identification of promoter-targeting molecules. As a result, post-transcriptional mechanisms are largely uncovered by gene expression targeted drug development. Here we describe a cell-based assay aimed at investigating the role of the 3&#39; untranslated region (3&#8217; UTR) in the modulation of the fate of its mRNA, and at identifying compounds able to modify it. The assay is based on the use of a luciferase reporter construct containing the 3&#8217; UTR of a gene of interest stably integrated into a disease-relevant cell line. The protocol is divided into two parts, with the initial focus on the primary screening aimed at the identification of molecules affecting luciferase activity after 24 hr of treatment. The second part of the protocol describes the counter-screening necessary to discriminate compounds modulating luciferase activity specifically through the 3&#8217; UTR. In addition to the detailed protocol and representative results, we provide important considerations about the assay development and the validation of the hit(s) on the endogenous target. The described cell-based reporter gene assay will allow scientists to identify molecules modulating protein levels via post-transcriptional mechanisms dependent on a 3&#8217; UTR.

Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3&#8217; UTR.

후 전사적으로 규제 유전자의 화학 변조기에 대한 높은 처리량 검사

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an important model for cardiovascular disease research. This study demonstrates a simple method to isolate and culture endothelial cells from the mouse aorta without any special equipment. To isolate endothelial cells, the thoracic aorta is quickly removed from the mouse body, and the attached adipose tissue and connective tissue are removed from the aorta. The aorta is cut into 1 mm rings. Each aortic ring is opened and seeded onto a growth factor reduced matrix with the endothelium facing down. The segments are cultured in endothelial cell growth medium for about 4 days. The endothelial sprouting starts as early as day 2. The segments are then removed and the cells are cultured continually until they reach confluence. The endothelial cells are harvested using neutral proteinase and cultured in endothelial cell growth medium for another two passages before being used for experiments. Immunofluorescence staining indicated that after the second passage the majority of cells were double positive for Dil-ac-LDL uptake, Lectin binding, and CD31 staining, the typical characteristics of endothelial cells. It is suggested that cells at the second to third passages are suitable for in vitro and in vivo experiments to study the endothelial biology. Our protocol provides an effective means of identifying specific cellular and molecular mechanisms in endothelial cell physiopathology.

The vascular endothelial cells play a significant role in many important cardiovascular disorders. This article describes a simple method to isolate and expand endothelial cells from the mouse aorta without using any special equipment. Our protocol provides an effective means of identifying mechanisms in endothelial cell physiopathology.

분리 및 마우스 대동맥 내피 세포의 차 문화

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Precise, High-throughput Analysis of Bacterial Growth

Bacterial growth is a central concept in the development of modern microbial physiology, as well as in the investigation of cellular dynamics at the systems level. Recent studies have reported correlations between bacterial growth and genome-wide events, such as genome reduction and transcriptome reorganization. Correctly analyzing bacterial growth is crucial for understanding the growth-dependent coordination of gene functions and cellular components. Accordingly, the precise quantitative evaluation of bacterial growth in a high-throughput manner is required. Emerging technological developments offer new experimental tools that allow updates of the methods used for studying bacterial growth. The protocol introduced here employs a microplate reader with a highly optimized experimental procedure for the reproducible and precise evaluation of bacterial growth. This protocol was used to evaluate the growth of several previously described Escherichia coli strains. The main steps of the protocol are as follows: the preparation of a large number of cell stocks in small vials for repeated tests with reproducible results, the use of 96-well plates for high-throughput growth evaluation, and the manual calculation of two major parameters (i.e., maximal growth rate and population density) representing the growth dynamics. In comparison to the traditional colony-forming unit (CFU) assay, which counts the cells that are cultured in glass tubes over time on agar plates, the present method is more efficient and provides more detailed temporal records of growth changes, but has a stricter detection limit at low population densities. In summary, the described method is advantageous for the precise and reproducible high-throughput analysis of bacterial growth, which can be used to draw conceptual conclusions or to make theoretical observations.

Quantitative evaluation of bacterial growth is essential to understanding microbial physiology as a systems-level phenomenon. A protocol for experimental manipulation and an analytical approach are introduced, allowing for precise, high-throughput analysis of bacterial growth, which is a key subject of interest in systems biology.

세균성 성장의 정확한, 높은 처리량 분석

Bacterial growth is a central concept in the development of modern microbial physiology, as well as in the investigation of cellular dynamics at the ...

Measurement of Energy Metabolism in Explanted Retinal Tissue Using Extracellular Flux Analysis

High acuity vision is a heavily energy-consuming process, and the retina has developed several unique adaptations to precisely meet such demands while maintaining transparency of the visual axis. Perturbations to this delicate balance cause blinding illnesses, such as diabetic retinopathy. Therefore, the understanding of energy metabolism changes in the retina during disease is imperative to the development of rational therapies for various causes of vison loss. The recent advent of commercially-available extracellular flux analyzers has made the study of retinal energy metabolism more accessible. This protocol describes the use of such an analyzer to measure contributions to retinal energy supply through its two principle arms - oxidative phosphorylation and glycolysis - by quantifying changes in oxygen consumption rates (OCR) and extracellular acidification rates (ECAR) as proxies for these pathways. This technique is readily performed in explanted retinal tissue, facilitating assessment of responses to multiple pharmacologic agents in a single experiment. Metabolic signatures in retinas from animals lacking rod photoreceptor signaling are compared to wild-type controls using this method. A major limitation in this technique is the lack of ability to discriminate between light-adapted and dark-adapted energy utilization, an important physiologic consideration in retinal tissue.

This technique describes real time recording of oxygen consumption and extracellular acidification rates in explanted mouse retinal tissues using an extracellular flux analyzer.

Explanted 망막 조직 세포 외 유출 분석을 사용 하 여 신진 대사 에너지의 측정

High acuity vision is a heavily energy-consuming process, and the retina has developed several unique adaptations to precisely meet such demands while ...

Efficient Dissection and Culture of Primary Mouse Retinal Pigment Epithelial Cells

Eye disorders affect millions of people worldwide, but the limited availability of human tissues hinders their study. Mouse models are powerful tools to understand the pathophysiology of ocular diseases because of their similarities with human anatomy and physiology. Alterations in the retinal pigment epithelium (RPE), including changes in morphology and function, are common features shared by many ocular disorders. However, successful isolation and culture of primary mouse RPE cells is very challenging. This paper is an updated audiovisual version of the protocol previously published by Fernandez-Godino et al. in 2016 to efficiently isolate and culture primary mouse RPE cells. This method is highly reproducible and results in robust cultures of highly polarized and pigmented RPE monolayers that can be maintained for several weeks on Transwells. This model opens new avenues for the study of the molecular and cellular mechanisms underlying eye diseases. Moreover, it provides a platform to test therapeutic approaches that can be used to treat important eye diseases with unmet medical needs, including inherited retinal disorders and macular degenerations.

This protocol, which was originally reported by Fernandez-Godino et al. in 20161, describes a method to efficiently isolate and culture mouse RPE cells, which form a functional and polarized RPE monolayer within one week on Transwell plates. The procedure takes approximately 3 hours.

1차 마우스 망막 색소 상피 세포의 효율적인 해부 및 배양

Eye disorders affect millions of people worldwide, but the limited availability of human tissues hinders their study. Mouse models are powerful tools to ...