만성 관절 질환에서 연골 복구는 손상된 조직을 효율적으로 재생하기 위해 고급 세포 기반 요법을 필요로 합니다. 이 프로토콜은 유도 만능 줄기 세포를 연골 세포 기반 스페로이드로 분화하기 위한 단계별 방법을 제공하여 조직 공학 및 세포 치료 응용 분야를 지원합니다. 만성 관절 질환에서 연골 복구는 손상된 조직을 충분히 재생하기 위해 고급 세포 기반 요법을 필요로 합니다.
이 프로토콜은 유도 만능 줄기 세포를 연골 세포 기반 스페로이드로 분화하기 위한 단계별 방법을 제공하여 조직 공학 및 세포 치료 응용 분야를 지원합니다. 주요 과제는 섬유 연골을 방지하기 위해 iPSC 유래 세포에서 1형 콜라겐 발현을 최소화하고, 성숙한 하이라인 연골 형성을 위한 조건을 만들고, 스페로이드 안정성을 위한 3D 배양 방법을 개선하고, 임상적으로 많은 세포 물질을 생산하기 위한 확장 가능한 접근 방식을 개발하는 것입니다. 이 프로토콜은 iPSC를 연골세포의 대체 공급원으로 사용함으로써 이점을 제공하여 침습적 절차 없이 확장 가능한 생산을 가능하게 합니다.
3D 배양을 통해 연골세포 표현형을 더 잘 유지하고 자연 연골 발달을 모방하여 연골 특이적 마커의 발현이 높은 천연 연골세포와 매우 유사한 세포를 만듭니다. iPSC 유래 연골 세포의 성숙도 및 기능을 향상시키고, 생체 내에서 장기적인 안정성을 보장하고, 섬유화된 3차원 배양 물질을 생성하고, 임상 적용을 위한 세포 물질의 확장 가능한 생산을 개발하는 효과적인 방법을 개발합니다. 시작하려면 121 분 동안 제곱 인치당 15 파운드로 섭씨 15 도로 설정된 오토 클레이브에서 가위를 살균하십시오.
가위가 마르면 원심분리기 튜브를 7-8mm 높이의 고리로 자릅니다. 이제 접착력이 낮거나 처리되지 않았거나 미생물 학적 페트리 접시를 적절한 분쇄 도구를 사용하여 작은 조각으로 부수십시오. 약 1g의 플라스틱 입자를 10ml의 클로로포름에 녹여 흄 후드 내부에서 밤새 녹입니다.
액체 플라스틱 용액의 점도를 확인하여 피펫팅에 적합한지 확인하십시오. 용액이 너무 묽으면 1-3g의 플라스틱 입자를 추가로 추가하십시오. 너무 걸쭉해지면 클로로포름 5ml 정도로 희석하십시오.
60mm 페트리 접시 중앙에 오토클레이브 플라스틱 링을 놓습니다. 그런 다음 링 내부에 액체 플라스틱을 바르고 플라스틱 손잡이를 만듭니다. 접시를 층류 후드에 덮지 않고 2-3시간 동안 건조시킵니다.
건조 후 접시를 20-30분 동안 자외선에 노출시킵니다. 시작하려면 플라스틱 손잡이가 들어 있는 수정된 페트리 접시를 구하십시오. 연골 채취 이틀 후, 60mm 페트리 접시를 사용하여 행크 용액에서 연골 조각을 씻습니다.
그런 다음 오토클레이브 가위를 사용하여 연골을 직경 약 1-2mm 조각으로 자릅니다. 연골 조각을 15ml 튜브에 옮기고 안와 쉐이커 인큐베이터에서 8-12시간 동안 DMEM의 0.01% 콜라겐분해효소 유형 2 용액으로 분해합니다. 분해 후 연골 조각을 DMEM으로 넣고 300G에서 튜브를 10분 동안 원심분리합니다.
세척 용액을 버린 후 연골 세포 배양 배지에 단편을 재현탁하고 0.1% 젤라틴 용액으로 사전 코팅된 접착 T25 플라스크에 파종하고 배양합니다. 다음으로, 세포외 단백질을 포함하는 매트릭스로 사전 코팅된 6웰 플레이트에서 유도 만능 줄기 세포를 배양합니다. 연골세포 계통에 대한 분화를 시작하려면 처음 2일 동안 배지 A에서 iPSC를 배양합니다.
3일차에는 배지 A를 CHIR-99021 및 rho-kinase 억제제를 제외한 용액으로 교체하고 다른 모든 성분은 변경하지 않습니다. 10일째에 연골세포와 같은 세포를 연골형성을 촉진하도록 제형화된 배지 B로 옮긴 다음 1.5%아르가로즈를 700와트에서 약 60-90초 동안 전자레인지에 녹입니다. 액화되면 75마이크로리터의 아가로스를 96웰 세포 현탁 배양 플레이트의 각 웰에 첨가하고 실온에서 경화시킵니다.
다음으로, 각 웰에 150마이크로리터의 DMEM을 추가하고 최소 12시간 동안 이산화탄소 인큐베이터에서 플레이트를 배양합니다. 12일째에는 남성형성과 관련된 표현형 변화를 관찰하여 스페로이드 개시를 진행합니다. 0.05%트립신 용액을 사용하여 플레이트에서 80% confluency로 세포를 분리합니다.
10%FBS와 동일한 부피의 DMEM을 첨가한 후 세포를 15ml 튜브로 옮기고 200G에서 5분 동안 원심분리합니다. 1ml의 배지 B에 세포를 재현탁시키고 0.1% 젤라틴 용액으로 사전 코팅된 75제곱센티미터 세포 배양 플라스크로 옮깁니다. 일단 세포가 단층으로 80%confluency를 도달하면, 트립신으로 그(것)들을 다시 분리하고 매체 B.Now에서 그(것)들을 resususpend하십시오 스페로이드가 형성될 때까지 100의 조밀도, 우물 당 000의 세포, 150 마이크로리터와 함께 1개의 일 및 3개의 일 동안 세포를 배양하십시오.
그런 다음 끝이 잘린 1ml 피펫 팁을 사용하여 15ml 튜브로 웰에서 스페로이드를 옮깁니다. 스페로이드를 2-3분 동안 가라앉히고 상층액을 제거합니다. 이제 스페로이드를 섭씨 4도에서 템퍼링된 갓 해동하고 희석되지 않은 기저막 매트릭스 용액에 담그십시오.
30분 후 100G에서 튜브를 1분 동안 원심분리하여 스페로이드를 수집합니다. 마지막으로 스페로이드를 준비된 미니 생물 반응기로 옮기고 6 밀리리터의 배지 B를 추가합니다. 미니 생물 반응기를 이산화탄소 인큐베이터 내부에 넣습니다. 분화 19일 후, 세포의 99%가 연골형성 마커 아그레칸(aggrecan), 콜라겐 유형 1, 콜라겐 유형 2 및 SOX9를 발현했습니다.
고품질 연골구체는 연골세포 유전자 마커가 90-95% 이상 발현된 것으로 확인되었으며, 분화 30일째에 유전자 발현 분석을 통해 평가되었습니다. 성숙한 스페로이드는 일관된 형태 형성을 보였으며 2개월 후에 1-2mm의 일반적인 직경으로 성장했으며, 더 큰 스페로이드는 충치 또는 괴사가 있는 중앙 영역을 보여주었습니다.
