프로토콜의 중요성은 인간의 실수와 미생물학 오염을 줄이는 데 달려 있습니다. 또한 3D 바이오 프린팅 접근법을위한 수천 개의 구상체를 생산할 책임이 있습니다. 그러나이 문제의 가장 큰 장점은 노동 시간을 최적화한다는 것입니다.
소프트웨어 매개 변수는 구상체의 최종 품질에 영향을 줄 수 있기 때문에 중요합니다. 그리고 가장 좋은 조언은 세포 배양 배지로만 테스트를 수행하는 것입니다. 이 방법의 시각적 시연은 10 밀리리터 혈청 학적 피펫으로 줄기 세포 현탁액을 수확하고 50 밀리리터 원심 분리 튜브로 옮기는 Start를 기반으로하는 오래된 전통적인 3D 세포 배양 방법이기 때문에 중요합니다.
그 후, 400 RCF에서 5분 동안 원심분리하여 ASC 펠렛을 얻었다. 10%FBS를 함유하는 DMEM-Low를 사용하여 세포 펠릿을 재현탁시킨다. 세포 계수를 수행한 후, ASC를 별도의 15밀리리터 원심분리 튜브에 취하여 비부착성 하이드로젤로 마이크로몰딩된 81 및 256 후퇴를 시드한다.
사용 된 셀 수에 대한 자세한 내용은 텍스트 원고를 참조하십시오. 500 마이크로 리터의 멸균 2 % 초순수 아가로스 용액을 81 또는 256 개의 원형 움푹 들어간 곳을 포함하는 실리콘 몰드의 중앙에 넣으십시오. 40분 후, 실리콘 몰드로부터 초순수 아가로스를 성형을 풀고 12웰 플라스틱 플레이트의 웰에 놓는다.
마이크로 몰딩된 아가로오스와 함께 웰에 DMEM-Low 2밀리리터를 첨가하고, ASC를 시딩하기 전에 적어도 12시간 동안 5% 대기 이산화탄소 공급으로 섭씨 37도에서 인큐베이션한다. 층류가 켜져 있고 캐비닛의 공기 흐름이 제대로 작동하는지 확인하십시오. 장비가 올바른 전압에 연결되어 있고 태블릿이 장비에 연결되어 있는지 확인합니다.
캐비닛 보호 유리의 높이가 장비의 센서 표시와 동일한 수준인지 확인하십시오. 장비 왼쪽에 있는 켜기 또는 끄기 단추를 누릅니다. 그런 다음 태블릿과 장비가 시작될 때까지 기다리십시오.
팁 박스, 원심분리 튜브용 랙 및 마이크로몰딩된 아가로스 하이드로겔이 포함된 플레이트를 장비의 작업 공간에 배치합니다. 태블릿에서 열린 소프트웨어에서 LabWare 편집기를 클릭합니다. 가상 작업 테이블을 설정하고 피펫, 팁 박스, 플라스틱 튜브용 랙 및 플레이트의 위치를 선택합니다.
절차로 전환"버튼을 클릭하여 실험 전반에 걸쳐 장비가 수행 한 모든 매개 변수와 명령을 포함하십시오. 도구 모음과 프로시저 목록이 소프트웨어에서 열릴 때까지 기다립니다. 처음에는 명령을 나타내려면 피펫팅할 샘플 수를 통합하고 프로시저 목록으로 드래그합니다.
그런 다음 소프트웨어의 시약 전송"명령 버튼을 클릭하여 ASC 서스펜션을 마이크로 몰드가 포함 된 12 웰 플레이트의 웰로 전송하고 절차 목록으로 드래그하십시오. "속성을 클릭하여 샘플을 전송할 장비의 시작"및 끝"위치를 설정하십시오. 소프트웨어가 작업 테이블 페이지로 돌아갈 때까지 기다립니다.
텍스트 원고에 설명된 대로 ASC의 자동 시드를 위한 매개변수를 설정합니다. 표준 액체 유형으로 물을 선택하십시오. 옵션"버튼을 클릭하여 텍스트 원고에 설명 된대로 ASC의 균일 한 서스펜션을 만들기 위해 매개 변수를 설정하십시오.
소프트웨어의 상단 막대에있는 check"기호가있는 버튼을 클릭하여 프로그래밍 오류가 없는지 확인하십시오. 프로그램의 상단 막대에있는 재생"버튼을 클릭하여 프로그램을 시작하십시오. 장비가 프로그램된대로 시작되도록하십시오.
그리고 그것이 끝났음을 나타내는 소리가 날 때까지 기다리십시오. 12-웰 플레이트를 수집한 다음, 섭씨 37도에서 5% 대기의 이산화탄소 공급으로 최소 18시간 동안 인큐베이션하여 완전하고 컴팩트한 구상체 형성을 가능하게 한다. 분석을 위해 배양한 후, 삼일, 칠일 후에 구상체를 수동으로 수확한다.
배지를 마이크로피펫으로 플러시하여 마이크로몰딩된 비부착성 아가로스 하이드로젤로부터 구상체를 방출한다. 마이크로 피펫을 사용하여 구상체를 수동으로 수집하고 15 밀리리터 원심 분리 튜브로 옮깁니다. 총 85 및 160개의 구상체가 각각 81 및 256개의 원형 후퇴를 갖는 마이크로몰딩된 비접착성 하이드로젤로부터 측정되었다.
자동 피펫 시스템은 ASC 세포 현탁액을 15분 내에 단일 12-웰 플레이트의 12개 웰에 시딩하였다. 81개의 마이크로몰딩된 비부착성 하이드로젤을 사용하여, 본 연구에서 972개의 구상체를 생성하였다. 256개의 마이크로몰딩된 비부착성 하이드로젤이 있는 동안, 3072개의 구상체를 생성하였다.
ASC 구상체는 그들의 크기 및 형상의 균질성에 대해 분석되었다. 81 경기 침체를 가진 마이크로 주형으로부터의 ASC 스테로이드는 배양 기간 동안 균질한 직경을 보였다. 256 경기 침체가있는 마이크로 몰드의 ASC 스테로이드와는 달리, 가장 작고 가장 큰 직경 비율은 81 및 256 경기 침체가있는 마이크로 몰드의 ASC 구상체 중 하나에 가깝습니다.
생존력, 형태학 및 힘 분석은 ASC 구상체의 성공적이고 대규모 생산에 대한 증거를 제공했습니다. 대부분의 경우는 문제가 오류없이 갑자기 해결되었는지 확인하는 것입니다.
