AIG 병원에서는 췌관 분비물 감소와 pH 감소가 췌관 세포의 유전자 발현에 어떤 영향을 미치는지 조사하며, 특히 종양 유전자에 중점을 두고 산성 미세환경에 대한 세포 적응 가능성을 모색합니다. 여기서 문제는 췌장 종양의 이질성으로, 이는 치료와 실험적 접근 방식을 복잡하게 만듭니다. 그래서 우리는 감소된 pH 조건에서 췌관 세포에 대한 RNAC 분석을 수행했으며, 췌관 세포에서 산성 환경과 종양 유전자 발현 사이의 잠재적인 연관성을 강조하는 세 가지 종양 유전자의 발현이 증가했음을 발견했습니다.
본 연구는 감소된 pH 조건에서 종양유전자 발현에 대한 실마리를 제공했으며, 이 시스템은 염증 조건에서 췌관 선암종을 연구하는 연구를 진전시킬 수 있습니다. 따라서 이 연구의 향후 범위는 만성 췌장염과 같은 염증성 상태에서 종양 발현이 시작될 때 증가된 종양유전자 발현의 역할을 평가하는 것입니다. 먼저 human normal pancreatic ductal cell line을 조달합니다.
수조에서 섭씨 37도에서 세포를 해동합니다. 이제 주사기 필터를 통해 갓 준비된 완전한 매체를 필터링합니다. 새로운 15ml 원뿔형 튜브에 6ml의 완전한 매체를 추가합니다.
그런 다음 해동된 세포 현탁액을 튜브로 옮기고 철저히 혼합합니다. 1, 800G에서 6분 동안 서스펜션을 원심분리합니다. 상등액을 버리고 부드럽게 혼합하기 전에 펠릿에 1ml의 배양 배지를 첨가하십시오.
다음으로, 60mm 페트리 접시에 4ml의 완전한 매체를 추가합니다. 그런 다음 세포 현탁액을 플라스크에 적가하여 피펫팅합니다. 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소 보충제로 배양합니다.
배양 배지의 pH를 변경하려면 먼저 pH 값이 6.0, 6.5 및 7.0인 0.5몰 인산나트륨 완충액 원료 용액 100ml를 준비합니다. pH 측정기로 pH를 확인하고 1몰 염산 또는 1몰 수산화나트륨을 사용하여 조정합니다. 그런 다음 0.45마이크로미터 주사기 필터를 사용하여 층류 공기 흐름 후드에서 버퍼를 필터링하고 살균합니다.
다음으로, 각 pH의 멸균 0.5몰 인산나트륨 완충액 20ml를 배양 배지 80ml에 추가하여 pH가 다른 배지를 준비합니다. pH가 변경된 배지를 85-90% confluent human pancreatic ductal cells에 추가합니다. 명시야 현미경으로 1시간 간격으로 6시간 동안 형태학적 변화를 관찰합니다.
배양액에서 RNA를 분리하려면 먼저 배양 배지를 흡인하고 PBS 1ml로 세포를 헹굽니다. 얼음 위에 60mm 접시를 놓고 60mm 접시에 PBS 1ml를 놓고 세포 스크레이퍼로 세포를 긁어냅니다. 이제 서스펜션을 새 튜브로 옮깁니다.
8, 000G에서 10분 동안 원심분리하고 상층액을 버립니다. 다음으로, 베타-메르캅토에탄올을 함유한 600마이크로리터의 용해 완충액을 펠릿에 추가합니다. 얼음 위에서 5분에서 10분 동안 서스펜션을 위아래로 피펫팅합니다.
용해물에 동일한 부피의 70%에탄올을 추가하고 현탁액을 피펫으로 넣어 완전히 혼합합니다. 용액을 실리카 멤브레인 컬럼으로 옮깁니다. 그런 다음 8, 000G 이상에서 30초 동안 컬럼을 원심분리하고 흐름을 버립니다.
다음으로, 500마이크로리터의 세척 버퍼를 샘플에 추가하고 다시 원심분리합니다. 8, 000 G.Finally에, 란에 nuclease 자유로운 물의 30에서 50 마이크로리터를 추가하십시오 매우 1 분 동안 빈 관을 원심분리기. 실온에서 5분 동안 배양한 후 8, 000G보다 높은 속도로 5분 동안 컬럼을 다시 원심분리합니다.
산성 배지에서 세포 크기와 연성 세포의 수축이 정상 배지에서 유지되는 세포와 비교하여 현저히 감소하는 것이 관찰되었습니다. 세포 사멸에서 가장 뚜렷한 변화는 배양 6시간 후에 발생했으며, 22시간에는 세포 수가 더 감소하고 세포 스트레스 징후가 나타났습니다. 상향 조절된 유전자의 수는 pH 6.5로 148개 유전자로 가장 많았고, pH 7이 109개 유전자, pH 6이 90개 유전자로 가장 많았다.
하향 조절된 유전자는 pH 6에서 20개, pH 6.5에서 14개, pH 7에서 23개로 더 적었다. 3개의 종양유전자, LCK, FGR 및 ASAP 3개는 테스트된 모든 pH 수준에서 상향 조절되었으며, 이는 산성 조건에서 세포 증식에 대한 역할을 시사합니다.
