생체 내 Monitoring of transcriptional activity during metabolic transition using a bioluminescent reporter in yeast(효모의 생물발광 리포터를 사용한 대사 전이 중 전사 활동 모니터링)

우리의 연구 또는 주요 연구는 미생물 다양성, 계통 유전체학 및 발효 응용에 중점을 두고 있으며, 효모 다양성, 적응, 특히 효모 생물학의 산업적 응용을 강조합니다. 특히 해당 응용 분야로 이동하여 효모의 발효 효율, 풍미 생산 및 스트레스 내성을 연구합니다. 따라서 우리의 가장 최근의 발전은 특히 파타고니아의 효모 계통유전체학과 관련이 있습니다.

그런 다음 이를 사용하여 맥주 발효를 위한 새로운 라거 효모를 생성하지만 저알코올 맥주를 위한 새로운 효의도 사용하고 있습니다. 전체적으로 우리는 다양한 오믹 기술과 실험적 진화를 사용하여 생물 유전학 응용 분야를 위한 이 새로운 효모를 개발합니다. 우리는 현재 게놈 염기서열 분석, 장기 판독 게놈 염기서열 분석, 전사체학(transcriptomics)과 같은 다양한 기술을 사용하고 있습니다.

그런 다음 이 정보를 사용하여 우리가 가지고 있는 다양한 균주를 실험적으로 진화시킨 다음, CRISPR 기술 또는 다양한 효모 변형 기술을 사용하여 일부 게놈 변화를 검증하려고 시도하며, 이러한 방식으로 발효 환경에 대한 효모 적응의 분자 세부 사항을 파악합니다. 따라서 두 가지 큰 과제가 있습니다. 하나는 효율적인 맥주 발효로 새로운 라거 효모를 생성하는 것이고, 다른 하나는 그 반대입니다.

우리는 특히 파타고니아에서 저알코올 맥주를 생산할 수 있는 새로운 균주를 얻고자 합니다. 우리 실험실에서 얻은 두 가지 주요 결과를 강조하고 싶습니다. 그 중 하나는 라거 효모인 Saccharomyces eubayanus의 모체인 파타고니아 출신을 확인하는 것입니다.

그리고 이제 우리는 맥주 발효를 위한 수십 개의 새로운 라거 하이브리드도 생성했습니다. 저는 이것이 우리 연구의 두 가지 주요 결과라고 생각합니다. 먼저 형질전환된 효모 균주 패치에서 샘플을 선택하고 5% 포도당과 200마이크로몰 하이그로마이신을 함유한 효모 펩톤 배지에 접종합니다.

24시간 동안 흔들지 않고 섭씨 25도에서 배양합니다. 24시간 더 배양하기 전에 1-10 희석으로 신선한 배지에서 배양물을 새로 고칩니다. 무설탕 효모 펩톤 배지로 세포를 세척한 다음 1-10 희석으로 테스트 배지에 접종합니다.

테스트 매체에 루시페린을 최종 농도 3밀리몰까지 보충하고 200마이크로몰의 하이그로마이신을 추가하여 플라스미드 안정성을 유지합니다. 혼합 설탕 성장 테스트의 경우, 효모 펩톤 배지에서 포도당 및 맥아당 농도가 증가하는 포도당-맥아당 매트릭스를 사용하십시오. 200마이크로리터의 배양액을 96웰 플레이트의 각 웰에 분배합니다.

이제 광도계 플레이트 리더를 사용하여 72시간 동안 30분마다 620나노미터의 발광과 광학 밀도를 측정합니다. 통합 시간을 1초로 설정하고 감쇠를 비활성화하여 지속적인 리포터 활동과 세포 밀도 모니터링을 보장합니다. 발효 샘플링 및 발광 모니터링을 위해 먼저 맥아 추출물을 물에 용해시켜 맥아 추출물 배지를 준비합니다.

섭씨 20도에서 5밀리리터의 YPD 배지에서 24시간 동안 200RPM에서 교반하면서 사전 배양 변형된 효모 균주. 사전 배양을 50 밀리리터의 맥아 추출물 배지로 옮긴 다음 섭씨 20도에서 배양하고 다시 24 시간 동안 분당 200 회전으로 교반합니다. 배양액을 21, 380G에서 실온에서 1분간 원심분리하여 세포를 채취한다.

그런 다음 50 밀리리터 미량 발효를 위해 12도 플레이트의 맥아 추출물 배지에 세포를 3 배로 재현 탁시킵니다. 발효 성능을 향상시키기 위해 리터당 0.3mg의 염화아연을 배지에 보충합니다. 접종물 부피를 계산하여 반복 전반에 걸쳐 일관된 세포 밀도를 보장합니다.

제조된 배지에 계산된 접종량을 접종합니다. 그런 다음 배양물을 섭씨 20도에서 14일 동안 흔들지 않고 놓습니다. 매일 손실되는 이산화탄소를 기록하여 발효 진행 상황을 모니터링합니다.

매일 용기의 무게를 측정하여 이산화탄소 생산의 지표로 누적 중량 감소를 측정합니다. 발광 모니터링을 위해 각 미량 발효에서 200마이크로리터를 주기적으로 샘플링하십시오. 루시페린을 첨가하여 최종 농도 3밀리몰을 달성합니다.

620 나노미터에서 발광계 플레이트 리더를 사용하여 감쇠와 1초의 통합 시간 없이 발광과 광학 밀도를 측정합니다. 에피솜 리포터 플라스미드 pRS426-PMAL32-LUC-HphMX는 PMAL32 프로모터 루시페라제 ORF 및 hphMX 카세트로 성공적으로 구성되었습니다. 차등 루시페라제 활성은 다양한 포도당 및 맥아당 농도에서 3개의 형질전환된 균주에서 관찰되었습니다.

CBS12357T와 CL467.1은 포도당 없이 활성화되는 것으로 나타났으며, QC18은 활성화를 위해 포도당 농도가 1% 이상이어야 했습니다. 미세발효 조건하에서, 변형된 세 가지 균주 모두 서로 다른 시간에 정점을 이루는 강한 발광을 보여주었습니다. 발광은 야생형 균주에는 없었습니다.