이 프로토콜은 우리가 질병에 연결되는 인간 적인 유전자에 있는 잘못된 감각 이체가 단백질 기능에 영향을 미치는지 결정하는 것을 허용합니다. 이는 최첨단 알고리즘에서도 계산적으로 수행하기가 어렵습니다. 이 기술은 척추 동물 모델 유기체보다 빠르고 비용 효율적인 생체 내 시스템 Drosophila 멜라노가스터를 사용하여 인간의 단백질에 있는 잘못된 감각 이체의 신속한 분석을 허용합니다.
특정 이체가 단백질 기능에 직접적인 영향을 미친다는 것을 입증하는 것은 희소한 질병의 진단에 직접적으로 기여하고 질병 기계장치 분석 및 잠재적인 치료를 위한 출발점역할을 합니다. 이 프로토콜은 희귀 질환에 연결된 이체를 연구 할 때 특히 유용하지만 자폐증과 암과 같은 일반적인 질병에 적용 될 수 있습니다. 단백질 기능을 반영하는 파리에서 재현 가능한 표현형을 식별하는 것은 어려울 수 있습니다.
표현형은 유전자에서 유전자에 다를 수 있고 미묘할 수 있습니다. Drosophila를 사용하여 인간 적인 단백질에 있는 변이체의 기능적인 연구 결과는 구조 실험 또는 과발현 연구 결과에 근거를 두어 수행될 수 있습니다. 절차를 시작하기 전에, 관심의 인간의 유전자와 모델 유기체 정형 외과에 대한 정보를 수집합니다.
플라이 비주얼 시스템에서 참조 및 변이체 인간 단백질을 과발현하여 변형 기능을 테스트하려면, Gal4 업스트림 활성화 서열 또는 UAS 시스템의 제어하에 관심있는 참조 또는 변형 인간 cDNA를 표현하는 형질 전환 파리를 생성합니다. 특정 플라이 조직에서 인간 단백질을 발현하기 위해 특정 Gal4 라인을 선택하려면, 단일 바이알 또는 중복에 있는 UAS 인간 cDNA 형질대사각각에서 3~5명의 수컷과 함께 Gal4 라인에서 3~5명의 처녀 암컷을 교차한다. 가능한 한 하나의 십자가에서 동봉된 많은 동물을 얻기 위해 2~3일마다 십자가를 옮기고 해부 현미경하에서 동봉된 동물을 검사하여 기준과 변이체 균주 사이의 차이점을 식별합니다.
눈에 보이는 결함이 있는 경우 플라이를 이미지하여 표현형을 문서화합니다. 시각 시스템에서 기능적 결함에 대한 테스트를 위해 파리를 생성하기 위해, rhodopsin 1 Gal4 라인에서 참조 또는 변이체 UAS 인간 cDNA 트랜스게컨을 가진 남성에게 처녀 암컷을 교차하여 플라이 망막에서 광수용체 R1내지 R6에 대한 관심있는 인간의 단백질을 표현한다. 파리가 닫히기 시작하면 자손을 신선한 바이알로 모으고 바이알을 적절한 실험 온도로 설정된 인큐베이터로 돌려 보내 시각적 시스템이 성숙할 수 있도록 3일 더 허용합니다.
인큐베이션의 끝에서, 적절한 마취 방법으로 파리를 고정하고 유리 현미경 슬라이드에 각 비행의 한쪽을 부드럽게 접착제. 전세전 도전자를 설치한 후 1.2mm 유리 모세관을 바늘 풀러에 넣고 모세관 튜브를 부러뜨려 직경 0.5mm 미만의 날카로운 중공 테이퍼 전극 2개를 얻습니다. 기포를 피하고 유리 모세혈관을 실버 와이어 전극 위로 밀어 내도록 주의하는 100 밀리머 식염수 용액으로 모세혈관을 채웁니다.
모세혈관을 제자리에 고정시키고 파리를 실내 온도에서 최소 10분 동안 어둠을 완성하도록 적응시다. 습관의 끝에, 파리를 포함하는 슬라이드를 기록 장치에 놓고 참조를 운반하는 마이크로 조작기를 이동시키고 전극을 관심있는 비행에 가깝게 기록한다. 전극의 끝을 보면서, 조심스럽게 표피를 관통하는 플라이의 흉부에 기준 전극을 배치하고 눈표면에 기록 전극을 배치합니다.
성공적인 전세전도 기록의 경우, 눈의 관통 없이 작은 보조개를 유발하도록 기록 전극에 적절한 양의 압력을 가하여 주의하십시오. 전극이 배치되면 1차 라이트를 3분간 끄면 파리를 어두운 환경으로 다시 적응시합니다. 재적응 기간이 끝나면 동일한 전극을 사용하여 조건당 미끄럼항당 최소 15파리의 전세전사진을 20초 동안 1초 동안 1초 동안 셔터를 열고 닫습니다.
참조 및 변형 파리의 레코딩이 완료되면 참조, 변형 및 컨트롤의 전하 기록과 비교하여 차이점을 평가합니다. 그런 다음 과도, 탈극화, 과도 및 다시 양극화에 대한 변화에 대한 전기 전세음원 데이터를 평가합니다. 이 대표적인 실험에서는, 인간 참조 TBX2가 구조 기지를 둔 전략을 불가능하게 만드는 직교 플라이 유전자를 기능적으로 대체할 수 없었기 때문에 TBX2를 위한 과발현 기지를 둔 연구가 수행되었다.
인간 TBX2를 참조하면 눈없는 Gal4를 사용하여 발달 하는 눈과 뇌의 부분에서 과발현, 과발현은 약 85%의 치사율과 눈 크기의 현저한 감소를 초래합니다. 대조적으로, 변이체 변형은 치사성을 일으키는 데 덜 강력하며 동일한 실험 조건하에서 동일한 드라이버를 사용하여 작은 눈 표현형을 유도하여 변이체가 단백질 기능에 영향을 미친다는 것을 시사합니다. 또한, 기준 인간 TBX2가 rhodopsin Gal4를 사용하여 광수용체에서 과발현되면, 과발현은 전하계선 흔적에 상당한 변경을 일으킨다.
이러한 표현형은 변이체 단백질이 발현될 때 더 온화하며, 관심의 변이체가 생체내 단백질 기능에 영향을 미친다는 추가 증거를 제공한다. 모든 유전자가 고유하므로 모든 질병 관련 이체의 영향을 평가할 수 있는 단일 실험이 없다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 인간 cDNA와 함께 작업하는 것 외에도, 이체가 정형소 비행 유전자의 진화적으로 보존된 잔류물로 유사 변이체를 도입하여 기능적 결과를 가지고 있는지 도를 결정할 수 있다.
이 방법을 사용하여, 우리는 진단되지 않은 질병 네트워크 및 그밖 단과 공동으로 인간적인 질병 유전자 발견 연구 결과의 숫자에 기여했습니다.
