Przegląd

Tylko geny, które są transkrybowane na informacyjny RNA (mRNA), są aktywne lub ulegają ekspresji. Naukowcy mogą zatem ekstrahować mRNA z komórek, aby badać ekspresję genów w różnych komórkach i tkankach. Naukowiec przekształca mRNA w komplementarne DNA (cDNA) poprzez odwrotną transkrypcję. Ponieważ mRNA nie zawiera intronów (regionów niekodujących) i innych sekwencji regulatorowych, cDNA - w przeciwieństwie do DNA genomowego - pozwala również naukowcom bezpośrednio określić sekwencję aminokwasową peptydu kodowanego przez gen.

Synteza cDNA

cDNA można generować na kilka sposobów, ale powszechnym sposobem jest najpierw ekstrakcja całkowitego RNA z komórek, a następnie wyizolowanie mRNA z bardziej dominujących typów - transferowego RNA (tRNA) i rybosomalnego (rRNA). Dojrzałe eukariotyczne mRNA ma ogon poli(A) - ciąg nukleotydów adeninowych - dodany do końca 3', podczas gdy inne typy RNA nie. Dlatego ciąg nukleotydów tyminy (oligo-dT) może być przyłączony do podłoża, takiego jak kolumna lub kulki magnetyczne, aby specyficznie sparować zasady z ogonami poli(A) mRNA. Podczas gdy mRNA z ogonem poli(A) jest wychwytywane, inne typy RNA są wypłukiwane.

Następnie odwrotna transkryptaza - enzym polimerazy DNA z retrowirusów - jest używana do generowania cDNA z mRNA. Ponieważ, podobnie jak większość polimeraz DNA, odwrotna transkryptaza może dodawać nukleotydy tylko do końca 3' łańcucha, dodaje się starter poli(T), aby związać się z ogonem poli(A), aby zapewnić punkt wyjścia do syntezy cDNA. Nić cDNA kończy się pętlą spinki do włosów. RNA jest następnie degradowane - zwykle za pomocą leczenia alkaliami lub enzymów RNazy - pozostawiając jednoniciowe cDNA nienaruszone.

Druga nić DNA komplementarna do cDNA jest następnie syntetyzowana przez polimerazę DNA - często przy użyciu pętli spinki do włosów pierwszej nici cDNA lub naciętego fragmentu mRNA jako startera.

Powstałe w ten sposób dwuniciowe cDNA można wprowadzić do wektorów bakteryjnych lub wirusowych i sklonować przy użyciu standardowych technik biologii molekularnej. Biblioteka cDNA - reprezentująca wszystkie mRNA w komórkach lub tkance będącej przedmiotem zainteresowania - może być również skonstruowana do dodatkowych badań.