Genel bakış

Sadece Messenger RNA'ya (mRNA) kopyalanan genler aktiftir veya eksprese edilir. Bu nedenle bilim adamları, farklı hücrelerde ve dokularda gen ekspresyonunu incelemek için mRNA'yı hücrelerden çıkarabilirler. Bilim adamı, mRNA'yı ters transkripsiyon yoluyla tamamlayıcı DNA'ya (cDNA) dönüştürür. mRNA intronları (kodlama dışı bölgeler) ve diğer düzenleyici sekanslar içermediğinden, cDNA (genomik DNA'nın aksine), araştırmacıların, genin kodladığı peptitin amino asit dizisini doğrudan belirlemelerini sağlar.

cDNA Sentezi

cDNA birkaç yöntemle üretilebilir, ancak ortak bir yol önce toplam RNA'yı hücrelerden çıkarmak ve daha sonra mRNA'yı daha baskın tipten izole etmektir; transfer RNA (tRNA) ve ribozomal (rRNA). Olgun ökaryotik mRNA, 3' ucuna eklenen bir poli (A) kuyruğuna (bir adenin nükleotid dizesi) sahipken diğer RNA türleri bu kuyruğa sahip değildir. Bu nedenle, bir dizi timin nükleotitleri (oligo-dTs), bir sütun veya manyetik boncuk gibi bir substrata, spesifik olarak mRNA'nın poli(A) kuyrukları baz çiftine bağlanabilir. Bir poli(A) kuyruğu olan mRNA yakalanırken, diğer RNA türleri yıkanır.

Daha sonra, retrovirüslere ait DNA polimeraz enzimi olan ters transkriptaz, mRNA'dan cDNA üretmek için kullanılır. Çoğu DNA polimeraz gibi ters transkriptaz da bir zincirin 3' ucuna nükleotit ekleyebildiği için, cDNA sentezi için bir başlangıç noktası sağlamak adına poli(A) kuyruğuna bağlanmak için bir poli(T) primeri eklenir. cDNA iplikçikleri bir saç tokası halkası şeklinde biter. RNA daha sonra alkali uygulaması veya RNaz enzimleri ile bozulur ve geriye sadece tek iplikçikli cDNA kalır.

Daha sonra genellikle ilk cDNA iplikçiklerinin saç tokası halkası veya primer olarak mRNA'nın çentikli bir parçası kullanılarak, cDNA'yı tamamlayan ikinci bir DNA iplikçiği DNA polimeraz tarafından sentezlenir.

Elde edilen çift iplikli cDNA bakteriyel veya viral vektörlere yerleştirilir ve standart moleküler biyoloji teknikleri kullanılarak klonlanabilir. Ek araştırmalar için hücre veya dokudaki tüm mRNA'ları temsil eden bir cDNA kitaplığı da oluşturulabilir.