Panoramica

Solo i geni trascritti in RNA messaggero (mRNA) sono attivi o espressi. Gli scienziati possono, quindi, estrarre l'mRNA dalle cellule per studiare l'espressione genica in diverse cellule e tessuti. Lo scienziato converte l'mRNA in DNA complementare (cDNA) attraverso la trascrizione inversa. Poiché l'mRNA non contiene introni (regioni non codificanti) e altre sequenze regolatorie, il cDNA, a differenza del DNA genomico, consente anche ai ricercatori di determinare direttamente la sequenza di amminoacidi del peptide codificato dal gene.

sintesi cDNA

il cDNA può essere generato con diversi metodi, ma un modo comune è quello di estrarre prima l'RNA totale dalle cellule, e quindi isolare l'mRNA dai tipi più predominanti: RNA di trasferimento (tRNA) e ribosomale (rRNA). L'mRNA eucariotico maturo ha una coda poli(A), una stringa di nucleotidi di adenina, aggiunta alla sua estremità 3', mentre altri tipi di RNA no. Pertanto, una stringa di nucleotidi di timina (oligo-dT) può essere attaccata a un substrato come una colonna o perline magnetiche, in modo specifico coppia di base con le code poli(A) di mRNA. Mentre l'mRNA con una coda poli(A) viene catturata, gli altri tipi di RNA vengono lavati via.

Successivamente, la trascrizione inversa, un enzima di polimerasi del DNA proveniente da retrovirus, viene utilizzata per generare cDNA dall'mRNA. Poiché, come la maggior parte delle polimerasi del DNA, la trascrizione inversa può aggiungere nucleotidi solo all'estremità 3' di una catena, viene aggiunto un primer poli(T) da associare alla coda poli(A) per fornire un punto di partenza per la sintesi cDNA. Il filocila cDNA termina in un ciclo di tornante. L'RNA viene quindi degradato, comunemente con il trattamento con alcali o enzimi RNAsi, lasciando intatto il cDNA a singolo filamento.

Un secondo filamento di DNA complementare al cDNA viene quindi sintetizzato dalla polimerasi del DNA, spesso usando il ciclo del primo filamento cDNA o un pezzo nicked dell'mRNA come primer.

Il cDNA a doppio filamento risultante può essere inserito in vettori batterici o virali e clonati utilizzando tecniche di biologia molecolare standard. Una libreria cDNA, che rappresenta tutti gli mRNA nelle cellule o nel tessuto di interesse, può anche essere costruita per ulteriori ricerche.