Przezmaciczny model niedrożności tchawicy płodu u myszy

Summary

Różne modele zwierzęce wrodzonej przepukliny przeponowej i niedrożności tchawicy płodu prezentują zalety i wady dotyczące kwestii etycznych, kosztów, trudności chirurgicznych, rozmiaru, wskaźników przeżycia i dostępności narzędzi genetycznych. Model ten zapewnia nowe narzędzie do badania wpływu zarówno niedrożności tchawicy, jak i zwiększonego ciśnienia świetlnego na rozwój płuc.

Abstract

Niedrożność tchawicy płodu (TO), uznana metoda leczenia, wspomaga wzrost płuc płodu i przeżycie w ciężkiej wrodzonej przepuklinie przeponowej (CDH). Po TO zatrzymanie wydzielanego płynu nabłonkowego zwiększa ciśnienie świetlne i indukuje wzrost płuc. Zdefiniowano różne modele zwierzęce, aby zrozumieć patofizjologię CDH i TO. Wszystkie mają swoje zalety i wady, takie jak trudność techniki, wielkość zwierzęcia, koszt, wysoka śmiertelność i dostępność narzędzi genetycznych. W tym artykule opisano nowy przezmaciczny model TO mysiego płodu. Ciężarne myszy znieczulono, a macica została odsłonięta za pomocą laparotomii w linii środkowej. Tchawicę wybranych płodów podwiązano pojedynczym szwem przezmacicznym umieszczonym za tchawicą, jedną tętnicą szyjną i jedną żyłą szyjną. Zapora została zamknięta i pozwolono jej się zregenerować. Płody pobrano tuż przed porodem. Stosunek płuc do masy ciała u płodów TO był wyższy niż u płodów kontrolnych. Model ten zapewnia naukowcom nowe narzędzie do badania wpływu zarówno OT, jak i zwiększonego ciśnienia świetlnego na rozwój płuc.

Introduction

Wrodzona przepuklina przeponowa (CDH) występuje w 1:2500 ciążach i skutkuje hipoplazją płuc oraz nadciśnieniem płucnym u noworodków1^,2,3,4,5,6. Niedrożność tchawicy płodu (TO) jest uznaną terapią prenatalną u pacjentek z ciężkim CDH, obejmującą fetoskopię w 26-30^{tygodniu ciąży,} w której balon umieszcza się tuż nad cariną, a następnie usuwa w 32.^{tygodniu ciąży.} Ten tymczasowy TO indukuje wzrost płuc płodu i poprawia przeżywalność. Zespół wrodzonej niedrożności dróg oddechowych jest śmiertelnym stanem związanym z przerostem płuc, który zainspirował chirurgów do wykonania sztucznej okluzji tchawicy w celu ułatwienia zatrzymywania wydzielanego płynu nabłonkowego. Ta okluzja zwiększyła ciśnienie świetlne i indukowała wzrost płuc⁷. Jednak okluzja powinna zostać odwrócona, aby umożliwić dojrzewanie komórek nabłonka.

Różne modele zwierzęce CDH i TO - owiec, królika, szczura i myszy - zostały opracowane w celu zrozumienia patofizjologii CDH i TO. Wszystkie mają swoje zalety i wady, takie jak trudność techniki, wielkość zwierzęcia, koszt, wysoka śmiertelność i dostępność narzędzi genetycznych. Chociaż technika chirurgiczna zastosowana w modelu owczym jest bardzo podobna do tej stosowanej u ludzi i można ją odwrócić, głównymi wadami tego modelu są koszt zwierzęcia, długi okres ciąży i ograniczona liczba możliwych operacji. Model królika ma krótszy okres ciąży i jest tańszy niż model owiec. Jednak model królika jest nieodwracalny^8,9. Model mysi charakteryzuje się najniższymi kosztami, największą liczbą płodów w jednej ciąży, najlepiej scharakteryzowanym genomem i szeroko dostępnymi narzędziami do analiz komórkowych i molekularnych. Jednak kluczową wadą jest brak odwracalności OT, co uniemożliwia pełne zrozumienie wpływu OT. W niniejszym artykule przedstawiono metodę, która łączy w sobie wszystkie zalety wcześniej wymienionych modeli i tworzy łatwy, potencjalnie odwracalny i minimalnie inwazyjny model TO gryzonia.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

Wszystkie eksperymenty są zgodne z Przewodnikiem National Institutes of Health dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych (NIH Publications No. 80023, poprawione w 1978 roku). Procedura została zatwierdzona zgodnie z protokołem IACUC #2016-0068 przez Cincinnati Children's Research Foundation Institutional Animal Care and Use Committee.

1. Przygotowanie

1. Aby połączyć myszy C57BL/6 w tym samym wieku (WT) typu dzikiego (WT), umieść je w tej samej klatce o godzinie 18:00 i oddziel o godzinie 9:00 następnego dnia.
2. Aby określić dzień embrionalny 0 (E0), spójrz na czop pochwowy, który ma jednorodną zewnętrzną strefę przymocowaną do ściany pochwy i wewnętrzną strefę, która jest włóknista i zawiera niektóre plemniki, które tworzą splątane masy zmieszane z włóknami materiału czopa.
3. Zapisz wagę myszy w czasie krycia.
4. Ponownie zważ myszy na E10, aby upewnić się, że ciąża trwa długo.
5. Wykonaj operację na E16.5 (wczesne stadium kanałowe).
6. Wysterylizuj narzędzia, które będą używane podczas operacji: nożyczki, uchwyt na igły, kleszcze, zaciski oraz noże i rękojeści chirurgiczne.
7. Przed zabiegiem podgrzej platformę chirurgiczną do 24 °C i przygotuj ciepłą sól fizjologiczną (24 °C).
8. Stwórz ciepłe środowisko do regeneracji i pozostaw mokrą karmę w klatce do wczesnego karmienia.
9. Pozostań z operowanymi zwierzętami do czasu, aż będą mogły same się pożywić.
10. Po operacji operowane myszy należy trzymać same w ich indywidualnych klatkach.

2. Znieczulenie

1. Ciężarne matki należy podawać podskórnie 0,1 mg/kg buprenorfiny na 1 godzinę przed zabiegiem.
2. Stosować wziewnie 5 ml/h izofluranu w celu indukcji i 2 ml/h w sposób ciągły podczas zabiegu znieczulenia.
3. Monitoruj ruchy podbródków ciężarnych myszy.

3. Laparotomia

1. Oczyść powierzchnię brzucha alkoholem i jodowidonem. Utrzymuj sterylne warunki przez cały czas trwania operacji.
2. Wykonaj pionowe nacięcie do laparotomii ciężarnych matek. Wytnij wszystkie warstwy osobno.
3. Zidentyfikuj rogi macicy po każdej stronie.
4. Określ potencjalne płody do operacji.
   UWAGA: Nie operować płodów, które znajdują się najbliżej pochwy.
5. Operuj na dwóch płodach w każdym rogu macicy, jeśli po każdej stronie jest parzysta liczba płodów (4 w większości przypadków) i na 1 płodzie w każdym rogu macicy, jeśli macica ma nieparzystą liczbę (3 przez większość czasu).

4. Niedrożność tchawicy

1. Do wizualizacji używaj okularów z 2,5-krotnym powiększeniem.
2. Ustaw róg macicy w kierunku poprzecznym.
3. Weź szczenięta, skierowane do góry, między dwa palce, używając oczu szczeniąt i ogona jako przewodnika do ułożenia płodu.
4. Delikatnie dociśnij głowę szczeniaka, aby umożliwić wyprostowanie głowy, a tym samym wizualizację szyi.
5. Użyj nici polipropylenowej 6.0 z atraumatyczną igłą do wykonania TO (Rysunek 1). Łożysko należy trzymać z boku i z dala od punktów wejścia i wyjścia igły.
6. Wbić igłę poprzecznie przez bok macicy z dala od łożyska przez 1/3 przedniej części szyi.
7. Delikatnie przesuwaj igłę do linii środkowej szyi i skieruj ją do części przedniej, a następnie wyjdź z szyjki między tchawicą i naprzeciwko pochewki szyjnej i macicy.
8. Zawiąż szew, zwracając uwagę na zachowanie integralności błon i ściany macicy oraz utrzymuj pępowinę bezpiecznie podczas wiązania.

Rysunek 1: Okluzja tchawicy.(A) Szew przezmaciczny przechodzący przez szyję. (B) Schematyczne przedstawienie struktur po przejściu szwu przez węzeł i przed nim. Skróty: C = tętnica szyjna; J = żyła szyjna; T = tchawica; E = przełyk; V = Kręg. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

5. Zamknięcie ściany brzucha

1. Wymień róg macicy w jamie brzusznej.
2. Wstrzyknąć 2 ml ciepłego sterylnego roztworu soli fizjologicznej do jamy otrzewnej przed zamknięciem.
3. Załóż biegnący szew poliglaktynowy 5/0, aby zamknąć ścianę brzucha i zamknij skórę niebiegnącym jedwabnym szwem.
4. Zastosować dootrzewnowo 0,1 mg/kg buprenorfiny w celu znieczulenia i pozwolić matce na regenerację w ciepłym inkubatorze.

6. Żniwa

1. Zastosuj znieczulenie do ciężarnej matki i zbierz wszystkie płody w E18,5 przez cesarskie cięcie.
2. Sprawdź żywotność płodów, obserwując ruchy płodów.
3. Do eutanazji należy stosować co najmniej dwie różne techniki: wdmuchiwanie dwutlenku węgla i zwichnięcie szyjki macicy.
4. Usuń ciała zgodnie z przepisami laboratorium weterynaryjnego.
5. Zważ wszystkie płody.
6. Wykonaj pionowe nacięcie na klatce piersiowej w celu torakotomii w celu usunięcia płuc.
7. Rozbioruj płuca zarodków i zważ je, aby obliczyć całkowity stosunek płuc do masy ciała (LBWR = (masa lewego płuca + masa prawego płuca)/masa ciała x100).

7. Histologia

1. Zamroź tkanki w ciekłym azocie, związku o optymalnej temperaturze cięcia i suchym lodzie.
2. Pociąć próbki na odcinki 10 μm za pomocą kriostatu i zamontować je na szkiełkach pokrytych polilizyną.
3. Upiecz szkiełka w temperaturze 60 °C przez noc i zabarwij je hematoksyną i eozyną przed zamontowaniem ich w celu uzyskania obrazu w powiększeniu 10-20x za pomocą mikroskopu szerokokątnego.

8. Przetwarzanie tkanek do analiz białek i DNA

1. Zamroź wypreparowane płuca płodu i zhomogenizuj je w 300 μl buforu do testów radioimmunoprecypitacyjnych. Wirować w temperaturze 4 °C przez 5 minut w temperaturze 18 000 × g.
2. Ekstrakcja i kwantyfikacja białka, DNA i RNA^10,12.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

W tym badaniu przebadano 37 płodów: 20 (54,1%) jako TO vs. 17 (45,9%) jako kontrolne. Ponieważ tchawica nie mogła być zamknięta u 4 płodów w grupie TO, zostały one wykluczone z badania. Nie stwierdzono istotnej różnicy w śmiertelności w obu grupach: 4 płody (25%) w grupie TO i 2 płody (12%) w grupie kontrolnej (p = 0,334, iloraz szans (OR) 2,5, 95% przedział ufności (CI) 0,39-16,05). Średnia masa ciała, masa płuc i stosunek płuc do masy ciała (LBWR) były wyższe w g...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

Metoda ta opisuje zabieg chirurgiczny niedrożności tchawicy płodu u myszy i jego wpływ na rozwój płuc. W protokole jest kilka krytycznych kroków, które należy dokładnie wykonać, aby zakończyć się sukcesem. Ciepło platformy, na której odbywa się operacja oraz sól fizjologiczna wprowadzana do jamy otrzewnej ma kluczowe znaczenie dla przebiegu ciąży. Ponadto należy lekko docisnąć głowę szczeniąt, aby zapewnić odsłonięcie szyi.

Szew polipropylenowy 6.0 jest jedynym szw...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Buprenorfina	Par Pharmaceutical	NDC 42023-179-05	Do znieczulenia regionalnego
Izofluran	Halocarbon Life Sciences	NDC 66794-017-25	Do znieczulenia ogólnego
Okulary powiększające	USA Medyczno-chirurgiczna	SLR-250LBLK	Co najmniej 2.5x
mikroskop Nikon 90i	Nikon	3417	Zmotoryzowany zestaw fluorescencyjnych
tkanek nukleospinowych	Macherey-Nagel, Dü ren, Niemcy	740952.5	Zestaw
do oznaczania białek Pierce BCA do izolacji	Thermo Fisher, IL, USA	23225	Kwantyfikacja białek
Szew poliglaktynowy	Ethicon	VCP451H	4-0, 24 mm, cięcie
Szkiełka polilizynowe	Firma VWR	48382-117	Szkiełka adhezyjne mikroskopowe
Szew polipropylenowy	Ethicon	Y432H	6-0, 13 mm 1/2c Bufor Taperpoint
RIPA	Sigma-Aldrich, Missouri, Stany Zjednoczone	R0278-50ml	Izolacja białka
Jedwabny szew	Ethicon	VCP682G	4-0, 24 mm, cięcie
Trizol	Invitrogen	15596026	izolacja RNA