Трансутерная фетальная трахеальная модель окклюзии у мышей

Резюме

Различные животные модели врожденной диафрагмальной грыжи и окклюзии плода трахеи представляют преимущества и недостатки в отношении этических вопросов, стоимости, хирургических трудностей, размера, выживаемости и наличия генетических инструментов. Эта модель представляет 2000 новых инструментов для изучения влияния как трахеи окклюзии, так и повышенного светимого давления на развитие легких.

Аннотация

Фетальная трахеальная окклюзия (ТО), установленный метод лечения, способствует росту легких плода и выживанию при тяжелой врожденной диафрагмальной грыже (CDH). После TO, задержка выделяется эпителиальной жидкости увеличивает светимое давление и вызывает рост легких. Различные модели животных были определены, чтобы понять патофизиологию CDH и TO. Все они имеют свои преимущества и недостатки, такие как сложность техники, размер животного, стоимость, высокие показатели смертности, а также наличие генетических инструментов. В этом и описывается новая трансутерная модель муринального плода TO. Беременные мыши были обезболены, а матка подвергалась воздействию лапаротомии средней линии. Трахея отдельных плодов была перевязана одним трансматозным швом, помещенным за трахеей, одной сонной артерией и одной яремной веной. Плотина была закрыта и разрешена к восстановлению. Плоды были собраны незадолго до партурии. Соотношение веса легких к телу у плодов TO было выше, чем у контрольных плодов. Эта модель предоставляет исследователям новый инструмент для изучения влияния как TO, так и повышенного светимого давления на развитие легких.

Введение

Врожденная диафрагмальная грыжа (CDH) возникает при 1:2500 беременностях и приводит к легочной гипоплазии и неонатальной^{легочной гипертензии 1,2,3,4,5,6.} Фетальная трахеальная окклюзия (TO) является установленной пренатальной терапии у тяжелых пациентов CDH с участием фетоскопии в^{26-30-й гестационной} недели, в которой воздушный шар помещается чуть выше карины, а затем удалены в 32-й^{гестационной} недели. Это временное ТО индуцирует рост легких плода и улучшает выживание. Врожденный синдром обструкции дыхательных путей является смертельным состоянием, связанным с гиперплазией легких, которая вдохновила хирургов на искусственное окклюзию трахеи для содействия удержанию выделяется эпителиальной жидкости. Это окклюзия повышенное светимое давление и индуцированный рост^{легких 7}. Тем не менее, окклюзия должна быть обращена вспять, чтобы эпителиальные клетки созревания.

Для понимания патофизиологии CDH и TO были разработаны различные модели животных CDH и TO - яйцеклетки, кролика, крысы и мыши. Все они имеют свои преимущества и недостатки, такие как сложность техники, размер животного, стоимость, высокие показатели смертности, а также наличие генетических инструментов. Хотя хирургическая техника, используемая для модели яйцеклетки очень похожа на то, что используется в организме человека и может быть обращена вспять, основными недостатками этой модели являются расходы на животное, длительный гестационный период, и ограниченное количество операций возможно. Модель кролика имеет более короткий гестационный период и дешевле, чем модель овец. Тем не менее, модель кролика необратима^8,9. Модель мурина имеет самую низкую стоимость, наибольшее количество плодов на беременность, наиболее характерный геном и широко доступные инструменты для клеточного и молекулярного анализа. Однако ключевым недостатком является отсутствие обратимости ТО, препятствуя полному пониманию воздействия ТО. В этом случае представлен метод, который сочетает в себе все преимущества ранее упомянутых моделей и создает легкую, потенциально обратимую и минимально инвазивную модель грызунов TO.

протокол

Все эксперименты были проведены в соответствии с Национальными институтами здравоохранения руководство по уходу и использованию лабораторных животных (NIH Публикации No 80023, пересмотренный 1978). Процедура была одобрена протоколом МАКУК #2016-0068 Комитетом по институциональному уходу и использованию животных Фонда детей Цинциннати.

1. Подготовка

1. Чтобы спаривать возрастных диких мышей (WT) C57BL/6, поместите их в ту же клетку в 18:00 .m. и раздельйте их в 9:00 .m на следующий день.
2. Чтобы определить эмбриональный день 0 (E0), посмотрите на вагинальный штепсельной вилки, которая имеет однородную внешнюю зону, прикрепленную к стенке влагалища и внутренней зоне, которая волокниста и включает в себя некоторые сперматозоиды, которые образуют запутанные массы, смешанные с волокнами вилки материала.
3. Заметь вес мышей во время спаривания.
4. Повторное взвешивание мышей на E10 для обеспечения текущей беременности.
5. Выполните операцию на E16.5 (ранняя стадия канала).
6. Стерилизовать инструменты, которые будут использоваться во время операции: ножницы, держатель иглы, типсы, зажимы, а также хирургические ножи и ручки.
7. Предварительно разогреть хирургический платформу до 24 градусов по Цельсию и подготовить теплый солевой раствор (24 градусов по Цельсию) до операции.
8. Создайте теплую среду для восстановления и оставьте влажную пищу внутри клетки для раннего кормления.
9. Оставайтесь с эксплуатируемыми животными, пока они не смеют себя.
10. Держите оперировать мышей в одиночку в своих отдельных клетках после операции.

2. Анестезия

1. Нанесите подкожный 0,1 мг/кг бупренорфина на беременные плотины за 1 ч до процедуры.
2. Используйте вдыхаемые 5 мл/ч изофлурана для индукции и 2 мл/ч непрерывно во время процедуры анестезии.
3. Мониторинг движений подбородков беременных мышей.

3. Лапаротомия

1. Очистите брюшную поверхность алкоголем и повидедоном-йодом. Поддерживайте стерильные условия на протяжении всей операции.
2. Выполните вертикальный разрез для лапаротомии беременных плотин. Вырезать все слои отдельно.
3. Определите рога матки с каждой стороны.
4. Определите кандидата плода для операции.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Не оперировать плодов, которые находятся ближе всего к вагине.
5. Оперировать на двух плодах в каждом роге матки, если есть четное количество плодов с каждой стороны (4 большую часть времени), и на 1 плод в каждом роге матки, если есть нечетное количество матки (3 большую часть времени).

4. Трахеальная окклюзия

1. Используйте 2,5x увеличенные очки для визуализации.
2. Распоить рог матки поперечным способом.
3. Возьмите щенков, лицом вверх, между двумя пальцами, используя глаза щенков и хвост в качестве руководства для положения плода.
4. Нанесите нежное давление на голову щенка, чтобы обеспечить расширение головы и, следовательно, визуализацию шеи.
5. Используйте 6,0 полипропиленовый шов с атрауматической иглой для выполнения TO (Рисунок 1). Держите плаценту на стороне и вдали от входных и выходных точек иглы.
6. Вставьте иглу поперечно через сторону матки от плаценты через 1/3^rd передней части шеи.
7. Переместите иглу осторожно до средней линии шеи и навейте ее на переднюю часть, затем вывяйте шею между трахеей и напротив сонной оболочки и матки.
8. Узел шва, заботясь, чтобы сохранить целостность мембран и стенок матки, и сохранить пуповину безопасной во время завязывания.

Рисунок 1: Трахеальная окклюзия. (A)Трансутерный шов, проходящий через шею. (B)Схематическое представление структур после шва проходит через и перед узлом. Аббревиатуры: C и сонная артерия; J и яремная вена; Т Трахея; E и пищевод; V и позвонок. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

5. Закрытие брюшной стенки

1. Замените рог матки в брюшной полости.
2. Введите 2 мл теплого стерильного солевого раствора в брюшную полость перед закрытием.
3. Положите работает 5/0 полиглактина шва, чтобы закрыть брюшную стенку, и закрыть кожу с не работает шелковый шов.
4. Нанесите 0,1 мг/кг бупренорфина intraperitoneally для анальгезии, и позволяют восстановления плотины в теплом инкубаторе.

6. Урожай

1. Нанесите анестезию на беременную плотину и соготмите все плоды на E18.5 кесаревым сечением.
2. Проверьте жизнеспособность плода, наблюдая за движениями плода.
3. Используйте по крайней мере два различных метода для эвтаназии: инция двуокиси углерода и дислокация шейки матки.
4. Удалить органов в соответствии с регулированием ветеринарной лаборатории.
5. Взвесь все плоды.
6. Выполните вертикальный разрез на грудной клетке для торакотомии, чтобы удалить легкие.
7. Вскрыть легкие эмбрионов, и взвесить их, чтобы вычислить общее соотношение веса легких к телу (LBWR - (левый вес легких и правого веса легких)/вес тела x100).

7. Гистология

1. Snap-заморозить ткани в жидком азоте, оптимальное соединение температуры резки, и сухой лед.
2. Разрежьте образцы на 10 мкм секциях с помощью криостата и смонтировать их на полилин-покрытых слайдах.
3. Выпекать слайды при температуре 60 градусов по Цельсию на ночь, и пятно запеченные слайды с гематоксилином и эозином, прежде чем монтаж их для получения изображения на 10-20x увеличение с помощью широкоугольного микроскопа.

8. Обработка тканей для анализа белков и ДНК

1. Snap-заморозить вскрыли легких плода, и гомогенизировать их в 300 йл радиоиммунопрофильизации анализа буфера. Центрифуга при 4 градусов по Цельсию в течение 5 мин при 18000 × г.
2. Экстракт и количественная оценка белка, ДНК и^{РНК 10,12}.

Результаты

В этом исследовании было изучено 37 плодов: 20 (54,1%) как TO против 17 (45.9%) как контроль. Поскольку трахея не может быть закрыта у 4 плодов в группе ТО, они были исключены из исследования. Существенной разницы в смертности в обеих группах не было: 4 плода (25%) в группе TO и 2 плода (12%)...

Обсуждение

Этот метод описывает хирургическую процедуру окклюзии плода трахеи у мышей и ее влияние на развитие легких. Есть некоторые важные шаги в протоколе, которые должны быть тщательно выполнены для успешного TO. Тепло платформы, на которой проводится операция, и солевой раствор, введенный в б?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Buprenorphine	Par Pharmaceutical	NDC 42023-179-05	For regional anesthesia
Isoflurane	Halocarbon Life Sciences	NDC 66794-017-25	For general anesthesia
Magnification glasses	USA Medical-Surgical	SLR-250LBLK	At least 2.5x
Nikon 90i microscope	Nikon	3417	Motorized Fluorescence
Nucleospin Tissue Kit	Macherey-Nagel, Düren, Germany	740952.5	DNA isolation
Pierce BCA Protein Assay Kit	Thermo Fisher, IL, USA	23225	Protein quantification
Polyglactin suture	Ethicon	VCP451H	4-0, 24 mm, cutting
Polylysine slides	VWR	48382-117	Microscope adhesion slides
Polypropylene suture	Ethicon	Y432H	6-0, 13 mm 1/2c Taperpoint
RIPA buffer	Sigma-Aldrich, Missouri, USA	R0278-50ml	Protein isolation
Silk suture	Ethicon	VCP682G	4-0, 24 mm, cutting
Trizol	Invitrogen	15596026	RNA isolation