Nasze badania mają na celu ocenę ultrakrótkich, samoorganizujących się peptydów jako matryc dla kultur organoidów raka jelita grubego. Zajmujemy się pytaniami dotyczącymi morfologii organoidów pod kątem żywotności, proliferacji oraz adhezji i wpływu biofunkcjonalizacji. Celem jest optymalizacja kompozycji matryc peptydowych w celu efektywnego wzrostu organoidów i przyczynienie się do rozwoju medycyny regeneracyjnej.
Najnowocześniejsze technologie w naszej dziedzinie obejmują biodruk 3D do precyzyjnego wytwarzania organicznego, platformy mikroprzepływowe do dynamicznych środowisk hodowlanych oraz zaawansowane narzędzia do obrazowania, takie jak mikroskopia sił atomowych i mikroskopia wielofotonowa. Edycja genów CRISPR-Cas9 udoskonala modyfikację genetyczną, podczas gdy sekwencjonowanie RNA pojedynczej komórki zapewnia dogłębny wgląd molekularny. Obecne wyzwania eksperymentalne obejmują zwiększenie odtwarzalności organoidów, udoskonalenie unaczynienia dla większych konstruktów oraz naśladowanie złożonej architektury tkankowej.
Przezwyciężenie tych ograniczeń w długotrwałej hodowli i włączenie składników immunologicznych do modeli to obszary aktywne. Osiągnięcie ustandaryzowanych protokołów i rozwiązywanie problemów etycznych stanowi ciągłe wyzwania w tej dziedzinie. Do istotnych odkryć w naszej dziedzinie należy wykazanie przydatności ultrakrótkich, samoorganizujących się peptydów do hodowli organoidów.
Wykazaliśmy wszechstronność, powtarzalność i stabilność tych peptydów, zapewniając platformę do precyzyjnego dostrajania mikrośrodowisk. Przyczynia się to do postępu badań opartych na organoidach, medycynie regeneracyjnej i badaniach nad biofunkcjonalizowanymi hydrożelami. Nasz protokół wypełnia lukę badawczą, zapewniając systematyczne podejście do oceny organoidów w ultrakrótkich, samoorganizujących się matrycach peptydowych.
Odpowiada na potrzebę ustandaryzowanych metod oceny zachowania komórek w tych matrycach, pomagając w racjonalnym projektowaniu hydrożeli na bazie peptydów w celu optymalnego wzrostu organoidów i posuwając naprzód badania nad medycyną regeneracyjną. Na początek pipetuj 10-mikrolitrowe kropelki 2x roztworu peptydu do środków studzienek na 24-dołkowej płytce. Po inkubacji odpipetować 10 mikrolitrów 2x PBS do każdej studzienki.
Użyj końcówki pipety, aby delikatnie wymieszać roztwór. Pozwól, aby kropelki żelu ustabilizowały się przez co najmniej 20 minut, upewniając się, że kropelki są nienaruszone. Następnie odpipetuj 2,5 mililitra 0,0125% trypsyny-EDTA do kolby zawierającej dwa miliony komórek ludzkiego gruczolakoraka jelita grubego SW1222.
Inkubować komórki z trypsyną w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć do 10 minut, aż oderwą się od kolby. Dodaj pięć mililitrów kompletnej pożywki, aby dezaktywować trypsynę. Następnie przefiltruj zawiesinę komórek za pomocą sitka o długości 30 mikrometrów.
Za pomocą mikropipety o pojemności 10 mikrolitrów wstrzyknij dwa mikrolitry zawiesiny komórek w każdej kropli peptydu. Wysiewaj 800 komórek z linii komórkowej SW1222 do każdej studzienki przez cztery dni. Inkubuj kropelki przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza pod 5% dwutlenkiem węgla.
Następnie dodaj 0,5 mililitra uzupełnionej pożywki do każdej studzienki. Aby przygotować kontrolę, należy rozcieńczyć zapas kontroli macierzy błony podstawnej z uzupełnioną pożywką. Załaduj zawiesinę komórkową do rozcieńczonego roztworu podstawowego membrany.
Odpipetować 20 mikrolitrów rozcieńczonej matrycy błony podstawnej do każdej studzienki z komórkami. Inkubuj komórki przez 20 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po zestaleniu się kropelek dodaj 0,5 mililitra kompletnego podłoża.
Zobrazuj komórki za pomocą mikroskopu jasnego pola w pierwszym, czwartym i siódmym dniu, aby ocenić wzrost organoidów. Tygodniowe obrazowanie komórek w jasnym polu wykazało, że małe skupiska komórek łączyły się w organoidy. Organoidy pochodzące z SW1222 hodowane w hydrożelach peptydowych miały okrągłą morfologię o jasnym wyglądzie.
Ciemniejszy wygląd wskazywał na niepożądaną wyższą gęstość, jak obserwowano w koloniach peptydu P w siódmym dniu. Na początek odpipetuj 20-mikrolitrowe kropelki hydrożelu peptydowego do 24-dołkowej płytki. Wysiewaj 800 komórek z linii komórkowej SW1222 do każdej studzienki przez cztery dni.
Czwartego dnia odpipetować pożywkę. Umyj każdą studzienkę dwa razy za pomocą PBS. Następnie dodaj 400 mikrolitrów 4% roztworu formaldehydu do studzienek.
Po zakończeniu inkubacji użyj końcówki pipety P-1000, aby zassać roztwór formaldehydu. Następnie ponownie umyj studzienki PBS. Inkubować komórki w jednym mililitrze buforu przepuszczalności przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
Po odpipetowaniu buforu i umyciu studzienek PBS, dodać 0,5 mililitra buforu blokującego. Teraz umyj studzienki PBS po usunięciu buforu blokującego. Następnie pipetować 200 mikrolitrów rozcieńczonego przeciwciała pierwszorzędowego do studzienek.
Inkubuj płytkę przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Za pomocą końcówki do pipety P-200 usuń roztwór. Następnie umyj studzienki roztworem PBS.
Następnie dodać koniugat falloidyny do fiolki z rozcieńczonym przeciwciałem drugorzędowym w stosunku jeden do 40. Odpipetuj tę mieszaninę do dołków płytki. Następnie inkubuj płytkę w temperaturze pokojowej przez trzy godziny w ciemności.
Po zassaniu roztworu i umyciu studzienek PBS, należy odpipetować 300 mikrolitrów roztworu DAPI do każdej studzienki. Po inkubacji ponownie przemyć studzienki PBS po odpipetowaniu roztworu. Przechowuj płytkę w temperaturze czterech stopni Celsjusza do siedmiu dni.
Barwienie immunologiczne wykazało, że organoidy znajdujące się w niebiofunkcjonalnym peptydzie P, biofunkcjonalizowanym peptydzie P1 i Matrigelu były zlokalizowane w błonach wierzchołkowych i podstawno-bocznych. Niebiofunkcjonalny peptyd P indukował ekspresję połączenia komórka-komórka w błonie podstawno-bocznej. Aby rozpocząć, zobrazuj barwione próbki organoidów pochodzących z SW1222 za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego pod kątem 10x.
Używaj tylko kanałów RHOD i DAPI. Uruchom oprogramowanie ImageJ i kliknij Wtyczka, a następnie Makra, a następnie Uruchom, aby uruchomić imagej_roi_converter. py z witryny CellPose GitHub.
Gdy pojawi się okno, wybierz pierwszy plik z folderu organoidów dwukropka i kliknij Otwórz. Następnie wybierz sekcję. npy odpowiadający pierwszemu plikowi i kliknij przycisk Otwórz.
Następnie naciśnij Zaznacz wszystko w oknie menedżera ROI i naciśnij Zmierz. Teraz kliknij Plik, a następnie Zapisz jako w oknie wyników, aby zapisać wyniki. Powtórz konwersję obrazu dla tego samego obrazu w folderze dla światła organoidu okrężnicy.
Następnie załaduj oprogramowanie OriginPro. Kliknij Dane, a następnie Importuj plik, aby zlokalizować Kreatora importu. Zaznacz oba pliki CSV odpowiadające właściwościom organoidu i kształtu światła dla tego samego obrazu.
Skopiuj właściwości kształtu światła do kolumny wyników kolonii, aby sparować każdy pomiar strumienia świetlnego z odpowiadającą mu kolonią. W nowej kolumnie podziel obszary światła i kolonii, aby uzyskać względny obszar światła odpowiadającej mu kolonii. Wybierz kolumnę odpowiadającą okrągłości każdej kolonii i obszarowi światła.
Następnie kolejno kliknij Wykres, Podstawowe 2D i Punktowe. Kliknij prawym przyciskiem myszy okno wykresu i wybierz Szczegóły działki. Kliknij kartę Centroid Pro i wybierz opcje czytające Pokaż punkt środka ciężkości dla podzbioru, Połącz z punktami danych i Pokaż elipsę.
Komórki hodowane w 2D miały bardzo dużą zmienność w okrągłości kolonii. Komórki hodowane w Matrigel miały bardziej rozległy rozkład w stosunku do względnej wielkości światła.
