这项工作得到了阿卜杜拉国王科技大学的财政支持。作者感谢 KAUST 的种子基金赠款和 KAUST 的创新基金由 KAUST 的创新和经济发展授予。作者要感谢 KAUST 的生物科学和成像核心实验室为生物表征和显微镜分析提供支持。

1. 缓冲液和溶液的制备
注：所有所述浓度均为最终浓度。
<ol><li>添加终浓度分别为 10% 和 1% 的胎牛血清 （FBS） 和青霉素-链霉素，以制备完整的 Iscove 改良 Dulbecco 培养基 （IMDM）。在 4 °C 下避光储存长达 1 个月。</li>
	<li>将 MgCl2 （3 mM）、蔗糖 （300 mM） 和 Triton X-100 （0.5%） 与磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 混合以制备透化缓冲液。将此溶液在 4 °C 下储存长达 2 个月。</li>
	<li>将牛血清白蛋白 （BSA， 1%）、甘氨酸 （0.3 M） 和 Tween-20 （0.1%） 混合在 PBS 中，制备封闭缓冲液。将此溶液在 4 °C 下储存长达 2 个月。</li>
	<li>在无菌条件下用超纯水稀释 10 倍至 2 倍 PBS。将此溶液在室温下储存 6 个月以上。</li>
	<li>在紫外线下消毒 3 mg 肽粉 30 分钟。加入 500 μL 超纯水，使用涡旋混合器溶解。 注：最终浓度必须为目标浓度的两倍，即 6 mg/mL，因为 1x 浓度为 3 mg/mL。</li>
</ol>2. 用肽中的 SW1222 制造结直肠癌类器官
<ol><li>将等分试样在 4 °C 下解冻过夜，并将其保存在冰中，直到需要准备基底基质对照。</li>
	<li>在 24 孔板的每个孔的中心放置 10 μL 的 2x 肽溶液液滴。让板在室温下孵育 10 分钟。或者，在 6 孔板中每孔沉积 8-10 个液滴。 注意：如果接种在无菌盖玻片上，则用于共聚焦和电子显微镜的样品更容易操作。</li>
	<li>加入 10 μL 的 2x PBS。使用吸头轻轻混合 PBS 溶液。让凝胶稳定至少 20 分钟，确保液滴几乎保持完整。 注：添加 PBS 和温和混合的目的是保持液滴的完整性并避免将水凝胶扩散成一层。</li>
	<li>使用 0.125% 胰蛋白酶-EDTA 溶液 （5 mL） 分离 SW1222 细胞。将细胞与胰蛋白酶在 37 °C 下孵育 5-10 分钟，直到它们从培养瓶中分离。避免敲击培养瓶以避免细胞结块。</li>
	<li>加入 5 mL 完全培养基以灭活胰蛋白酶。使用 30 μm 细胞过滤器过滤细胞悬液。或者，使用带有 25 G 针头的注射器来破坏聚集体。</li>
	<li>制备 0.4 × 106 个细胞/mL 的细胞悬液，并使用 10 μL 微量移液器在每个肽滴中注入 2 μL 细胞悬液。</li>
	<li>将液滴在 37 °C、5% CO 2 下孵育 30 分钟。 孵育后，向每个孔中加入 0.5 mL 补充培养基。</li>
	<li>等待期间，通过使用补充培养基将主要储备液（8-12 mg/mL，取决于批次）稀释至终浓度为 3 mg/mL 来制备基底膜基质对照。向该溶液中加入细胞（每 25 μL 800 个细胞）。 注意：基底膜操作必须始终在冰上进行。在接触水凝胶之前，必须在冰冷的 PBS 中冲洗吸头。否则，吸头内部会发生聚合。</li>
	<li>在每个孔中接种 20 μL 基底膜溶液液滴。通过在 37 °C 下孵育 20 分钟，让液滴凝胶化。 材料凝胶化后，加入 0.5 mL 完全培养基。</li>
	<li>每 3-4 天更换一次培养基。最早在第 4 天观察细胞的组织和显示管腔形成的信号。</li>
	<li>在第 1 天、第 4 天和第 7 天对明场中的细胞进行成像，以评估类器官的生长。</li>
</ol>3. 活力和增殖
<ol><li>准备三个用于活力测定的黑孔板和三个用于增殖测定的黑孔板。每孔加入 25 μL 2x 肽溶液，并使用相同体积的 2x PBS 凝胶化。如上所述接种细胞。</li>
	<li>为每种肽水凝胶制剂准备三个孔，用作增殖板中的空白。不要在这些上面播种细胞。</li>
	<li>从活性孔板中取出培养基，用 1x PBS 洗涤 3 x 5 分钟。</li>
	<li>将哺乳动物细胞活力/细胞毒性试剂盒中的钙黄绿素-AM 和乙锭同源二聚体稀释至 8 μM（参见 材料表）到同一个避光锥形管中。要在避光锥形管中将 2 mL 该溶液制备到 2 mL PBS 中，请添加 4 μL 钙黄绿素-AM 储备液和 8 μL 乙锭同型二聚体-1 储备液。</li>
	<li>将步骤 3.4 中制备的钙黄绿素/乙锭同型二聚体溶液添加到 96 孔板中。每孔添加 100 μL。避光并在室温下孵育 30 分钟。</li>
	<li>用 1x PBS 洗涤 3 x 5 分钟。在荧光显微镜下使用 4 倍物镜时，至少要对三个视场（中心、上、下）进行成像，或者在荧光显微镜下使用 10 倍和 20 倍物镜时，至少对五个视场（中、左上、右上、左下、右下）进行成像。</li>
	<li>从增殖孔板中取出培养基，以确保最终体积为 90 μL。</li>
	<li>加入 10 μL Alamar Blue 溶液（参见 材料表）以达到 10% 的最终浓度。</li>
	<li>避光并在 37 °C、5% CO2 下孵育 2-4 小时</li>
	<li>使用孔板读数仪测量荧光 （Ex/Em = 530-560/590 nm/nm） 或吸光度 （570 nm）。平均为空白值获得的值，并从包含单元格的每个井的值中减去它们。</li>
	<li>通过对每个条件的信号求平均值并减去它们各自空白的平均值来计算增殖值。通过生成相对吸光度/荧光信号随时间的索引箱形图来创建图形。</li>
</ol>4. 细胞对基质的粘附性测定
<ol><li>在两个独立的 96 孔板中制备 100 μL 肽水凝胶。</li>
	<li>在每个孔中接种 20,000 个细胞，并加入 100 μL 培养基。将板在 37 °C、5% CO2 下孵育 90 分钟。</li>
	<li>孵育后，仅取一个板，并使用 P200 微量移液器小心重悬培养基 20-30 秒。小心不要让尖端远离凝胶，以免破坏水凝胶。或者，如果水凝胶机械性能允许（G' > 8,000 Pa），使用移动涡旋敲击孔板的四个侧面。 注：重悬培养基（或用涡旋敲击孔板）将去除未附着的细胞和粘附在基质表面的脆弱细胞。细胞附着将在 90 分钟内发生，尽管这种附着的强度会根据特定的肽水凝胶及其粘合和结合特性而变化。众所周知，结直肠类器官的生长在刚度值低于 2,000 Pa 的基质中受到青睐。因此，由于该协议中呈现的水凝胶柔软易碎，因此我们特别注意使用温和的机械应力。</li>
	<li>从两个孔板中取出 100 μL 培养基，并用 1x PBS 加入洗涤一次。</li>
	<li>制备 1 μg/mL DAPI 溶液。向所有孔中加入 100 μL DAPI 溶液，并在室温下孵育 5 分钟。</li>
	<li>在荧光显微镜下对具有代表性的视野数进行成像。确保使用相同的物镜获取所有图像，以保持像素/距离比恒定。 注意：10 倍物镜的 9 个视场或 20 倍物镜的 15 个视场。</li>
	<li>将荧光图像加载到图像分析软件（例如，ImageJ）上并分析所有图像上的颗粒。<ol><li>从 “图像 ”菜单中，选择 “类型 ”，然后单击“ 8 位”。</li>
		<li>从 图像 菜单中，选择 调整 并单击 亮度/对比度。点击 Auto 按钮 | 应用。</li>
		<li>从 图像 菜单，选择 调整 并单击 阈值.点击 Auto 按钮并关闭窗口。</li>
		<li>从 Analyze 菜单中，单击 Analyze Particles。勾选选项 总结 并单击 OK。</li>
		<li>在 Summary （摘要 ） 窗口中，将鼠标悬停在 File （文件 ） 菜单上，然后单击 Save （ 保存） 以保存摘要值。</li>
	</ol></li>
	<li>将所有图像的结果导出到标准统计软件。</li>
	<li>计算应力前后细胞覆盖的面积百分比。针对每个条件的面积百分比制作一个索引箱形图。</li>
</ol>5. 肽水凝胶中类器官的免疫染色
<ol><li>按照步骤 2.1-2.10 所述，将 800 个细胞接种在 20 μL 肽水凝胶液滴中 4 天。</li>
	<li>第 4 天，取出培养基并使用 1x PBS 洗涤每个孔 2 次。</li>
	<li>加入 400 μL 的 4% 甲醛溶液。在室温下将孔板孵育 30 分钟。</li>
	<li>用 P1000 去除甲醛溶液，并用 1x PBS 洗涤一次。</li>
	<li>加入 1 mL 透化缓冲液，并在室温下孵育 5 分钟。</li>
	<li>用 P1000 去除透化缓冲液，并用 1x PBS 洗涤一次。</li>
	<li>加入 0.5 mL 封闭缓冲液，并在室温下孵育 30 分钟。</li>
	<li>用 P1000 去除封闭缓冲液并用 1x PBS 洗涤。</li>
	<li>根据制造商的说明，在封闭缓冲液中稀释一抗（参见 材料表）。向两个孔中加入 200 μL。</li>
	<li>在 4 °C 下孵育过夜。</li>
	<li>用 P200 去除染色溶液，并用 1x PBS 洗涤一次。</li>
	<li>根据制造商的说明，在封闭缓冲液中稀释二抗（参见 材料表）。在二抗溶液中以 1：40 的比例添加鬼笔环肽偶联物。</li>
	<li>避光并在室温下孵育不超过 3 小时。用 P200 去除染色溶液，并用 1x PBS 洗涤一次。</li>
	<li>在封闭缓冲液中制备 1 μg/mL 的 DAPI 溶液。向每个孔中加入 300 μL DAPI 溶液。</li>
	<li>避光并在室温下孵育 5 分钟。</li>
	<li>用 P200 去除染色溶液，并用 1x PBS 洗涤一次。</li>
	<li>避光并在 4 °C 下储存长达 7 天。</li>
</ol>6. 基质中类器官的成像和图像分析
<ol><li>使用 10 倍落射荧光显微镜对染色样品进行成像。仅使用鬼笔环肽和 DAPI 通道。</li>
	<li>打开 Cellopose 软件并按 ctrl + L 加载图像。由于软件可以访问所选图像位置中的所有文件，因此请确保将所有荧光图像保存在确切位置，而没有任何子文件夹。</li>
	<li>在 Segmentation （分割） 面板中键入菌落的平均直径，然后单击 ENTER。</li>
	<li>为结肠类器官选择自定义模型，然后单击 Run Model 按钮。 注意：在这里，我们建议在 Cellpose2.029,30 中使用两个从头开始的模型</li>
	<li>按 ctrl + s 将蒙版另存为 .npy 文件。</li>
	<li>使用键盘箭头在文件夹的图像之间移动，并在文件夹中的所有图像上运行冒号类器官模型。</li>
	<li>复制文件夹并使用结肠类器官腔的模型重复步骤 6.2-6.6。</li>
	<li>打开 ImageJ 并单击 插件 |宏 |跑。。。 运行 Cellpose Github 站点提供的 imagej_roi_converter.py 文件并等待窗口出现。</li>
	<li>从冒号类器官文件夹中选择 第一个文件 ，然后单击 Open（ 打开）。</li>
	<li>选择与第一个文件对应的 seg.npy 文件，然后单击 Open。 注意：ImageJ 会将掩码转换为感兴趣的区域，并将它们与相应的荧光图像重叠。</li>
	<li>单击 ROI Manager 窗口中的 Select All，然后单击 Measure。</li>
	<li>单击 File （文件） |另存为... 并保存结果。 注意：这将生成一个 .csv 文件，其中包含字段中每个菌落的所有形状属性。</li>
	<li>对结肠类器官腔文件夹中的相同图像重复步骤 6.8-6.12。</li>
	<li>加载 OriginPro 并按 ctrl + 3 打开 导入向导。单击三个 点按钮 ，然后选择与同一图像的类器官和管腔形状属性对应的.csv文件。</li>
	<li>将管腔形状属性的结果复制并粘贴到菌落结果旁边的一列中，以确保每个管腔测量值都与其各自的菌落配对。</li>
	<li>在新列中，划分管腔和菌落的区域，以得出其包含菌落的相对管腔面积。</li>
	<li>选择与每个菌落的圆度和管腔面积相对应的列。点击 Plot |基本 2D |分散。</li>
	<li>右键单击绘图窗口，然后选择 Plot details。单击 Centroid（PRO） 选项卡 并勾选显示 子集的质心点、连接到数据点和 显示椭圆的选项。</li>
</ol>

评估生物功能自组装肽的细胞粘附和形态学

作者没有需要声明的利益冲突。

SAP 在生物医学研究中的巨大潜力体现在它们通过生物功能化的延展性和适应性上。面对如此广泛的排列阵列，有效测试和确定特定应用（尤其是在类器官研究中）最有前途的配置的挑战出现了。快速、经济高效的解决方案至关重要。源自人结直肠腺癌的 SW1222 细胞系成为此类强化评估的关键候选细胞。在这里，我们提出了一种评估和表征在基于肽的基质中生长的类器官的方法。该协议承诺一种综?...

近年来，自组装肽 （SAP） 已成为组织工程应用中前景广阔的生物材料。SAP 具有独特的特性，包括纳米纤维的自发形成、生物相容性、生物降解性和非免疫原性，使其成为支架开发的有吸引力的候选者1。SAP 以前曾与各种类型的细胞一起使用，值得注意的是，据报道，超短 SAP 促进了干细胞的包埋，同时在包括 30 多次传代在内的长时间内保持其多能性，并且染色体畸变的发生率最低 2,3,4。因此，调整 SAP 以用于类器官培养构成了合理的后续步骤。
类器官是由单个多能细胞产生的复杂三维结构。这些结构产生各种细胞类型，然后这些细胞类型自组织以复制体外胚胎和组织生长的发育过程 5。这种创新框架已发展成为体外研究的强大工具，有效地保留了体内器官的遗传、表型和行为属性特征 6。然而，基于类器官的结果从实验室到床边过渡的主要障碍是需要可重复性7。结果的这种差异主要归因于难以将人类多能干细胞完全分化为专门的细胞谱系，而缺乏真实的组织结构和类器官模型中遇到的固有复杂性则使情况变得更加复杂。鉴于基于干细胞和类器官的研究越来越受欢迎8，对具有动态机械性能和整合素样粘附位点的生物材料或具有可控降解性的支架的需求不断增加 7,9。这些属性可以通过战略性利用生物功能化 SAP 来有效调整。
SAP 是氨基酸的短序列，具有自发组织成明确结构的固有能力10。这些肽通常包含交替的疏水和亲水残基，这些残基通过非共价相互作用（包括氢键、静电相互作用和疏水效应）驱动其自组装11,12。这些肽的自组装过程主要是由于需要最小化系统的自由能。在水性环境中，疏水残基往往会聚集在一起，以尽量减少它们与水的接触，而亲水残基则与周围的水分子相互作用。这种现象导致各种纳米结构的形成。在这种情况下，超短自组装肽形成纳米纤维，其特性取决于肽序列和环境条件 2,12,13,14,15,16。这些肽采用 β 转构象，其中单个肽链彼此平行或反平行排列，由氢键稳定（图 1）。正离子的存在加速了导致纳米纤维形成的自组装过程。
肽纳米纤维已被确定为具有捕获大量水的先天能力。这一特性促进了水凝胶的产生，水凝胶随后表现为有利于细胞增殖和生长的生物相容性和可生物降解的三维空间。这些自组装肽纳米纤维错综复杂地模拟了天然细胞外基质 （ECM） 环境固有的地形特征1。这种相似性赋予细胞一个模仿其生理栖息地的环境，进一步促进最佳细胞活动17。此外，这些肽固有的多功能性允许相当程度的可调性4。这种适应性可以改变基质的特性，例如刚度、凝胶动力学和孔隙率。这些适应是通过对肽序列的修饰来实现的。因此，自组装肽 （SAP） 已成为当代生物材料科学中的关键成分，广泛用作组织再生和细胞培养的支架13,17。
自组装肽的关键优势之一是它们能够在分子水平上轻松合成和修饰。这一优势允许将特定官能团或生物活性基序掺入肽序列中，从而能够设计出具有定制特性和功能的肽 18,19,20（图 1B）。例如，生物功能化的 SAP 可以设计为模拟 ECM 并使用 RGD 肽促进分化19,21。据报道，由于其配体特异性基序，肽 Ben-IKVAV 还显著增加了神经元特异性标志物的表达22。这些肽还可以经过工程改造，以显示生物活性分子，例如整合素结合肽，以提高细胞存活率 23。最后，已经开发了其他生物功能化的 SAP，通过在它们的结构中包含 IKVAV 和 YIGSR 基序来促进血管生成24。
早期出版物中报道的生物功能化 SAP 表明，可以通过包含来源生物功能化 SAP 的朴素肽来进一步修饰自组装25。这些 SAP 混合物还可以提供各种 SAP 配方，这些配方的生化活性和物理化学性质各不相同。例如，两亲性肽 IIFK 是一种超短 SAP，可以承受具有各种基序的生物功能化，例如掺入 IKVAV 基序（图 1B）。两种肽都可以单独和组合形成纳米纤维。每种配方都会产生具有不同物理性质的水凝胶（图 2）
然而，由于 SAP 的生物功能化获得了广泛的潜在排列和替代方案，因此需要为类器官测试提供一种快速且具有成本效益的选择。这种密集且具有成本效益的类器官评估的一个候选者是来源于人结直肠腺癌的 SW1222 细胞系26,27。SW1222 细胞具有能够聚集成类似于类器官的 3D 结构的特性，使其成为研究组织发育和再生医学应用的理想模型。SW1222 细胞已被确定能够产生类器官，因为它们固有地过表达 LGR5 基因27。以前已经令人信服地展示了从单个 LGR5 + 干细胞产生类器官，以及 SW1222 细胞实现结直肠癌类器官形态特征的倾向28。
在该方法论文中，我们提出了使用 SW1222 细胞评估和表征各种生物功能肽对细胞粘附和管腔形成影响的详细方案（图 3）。通过提供分步程序和成像分析方法，我们希望为类器官的生物制造和用于类器官培养的简单 SAP 基质的评估提供有价值的见解。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1x PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plate, tissue culture treated</td>
			<td>Corning</td>
			<td>07-200-83</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x PBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>70011044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>28906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plate, tissue culture treated</td>
			<td>Corning</td>
			<td>09-761-146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well black plate, tissue culture treated</td>
			<td>Corning</td>
			<td>07-200-565</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alamarBlue Cell Viability Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>DAL1025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Ezrin antibody, rabbit monoclonal</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab40839</td>
			<td>Secondary used: anti-rabbit Dylight 633</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-pan Cadherin antibody, rabbit polyclonal</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab16505</td>
			<td>Secondary used: anti-rabbit Alexa 488</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-ZO1 tight junction antibody, goat polyclonal</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab190085</td>
			<td>Secondary used: anti-goat Alexa 488</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellpose 2.0</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Obtained from https://github.com/MouseLand/cellpose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Laser Scanning Microscope with Airyscan</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>LSM 880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Goat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>GE17-1323-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, DyLight 633</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>35562</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat Inactivated Fetal Bovine Serum (HI FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16140071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ 1.54f</td>
			<td>NIH</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMDM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12440079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit, for mammalian cells</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L3224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride, hexahydrate (MgCl2 6 H2O)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel for Organoid Culture, phenol-red free</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356255</td>
			<td>Refered in the manuscript as Matrigel or basement membrane matrix.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope, brightfield</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope, EVOS</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>EVOS M7000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OriginPro 2023 (64-bit) 10.0.0.154</td>
			<td>OriginLab Corp</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptide P (Ac,Ile,Ile,Phe,Lys,NH2)</td>
			<td>Lab-made</td>
			<td>NA</td>
			<td>Can be custom-made by peptide manufacturers such as Bachem.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptide P1 (Ac, Ile, Ile, Phe, Lys, Gly, Gly, Gly, Arg, Gly, Asp, Ser, NH2)</td>
			<td>Lab-made</td>
			<td>NA</td>
			<td>Can be custom-made by peptide manufacturers such as Bachem.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptide P2 (Ac, Ile,Ile,Phe,Lys,Gly,Gly,Gly,Ile,Lys,Val,Ala,Val,NH2)</td>
			<td>Lab-made</td>
			<td>NA</td>
			<td>Can be custom-made by peptide manufacturers such as Bachem.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine Phalloidin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round Cover Slip, 10 mm diameter</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-0170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scanning Electron Microscope</td>
			<td>Thermo Fisher - FEI</td>
			<td>TENEO VS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 30 &#956;m strainer</td>
			<td>Sysmex</td>
			<td>04-004-2326</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S1888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW1222 cell line</td>
			<td>ECACC</td>
			<td>12022910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton x-100</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>85111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA 0.25%</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure water</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10977015</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fabrication and characterization of colorectal cancer organoids from sw1222 cell line in ultrashort self&#45;assembling peptide matrix

超短自组装肽 （SAP） 可以自发形成类似于细胞外基质的纳米纤维。这些纤维允许形成具有生物相容性、可生物降解和非免疫原性的水凝胶。我们之前已经证明，当 SAP 与蛋白质衍生基序进行生物功能化时，可以模拟支持结直肠类器官形成的细胞外基质特征。这些生物功能肽水凝胶保留了原始母肽的机械特性、可调性和可打印性，同时结合了允许细胞-基质相互作用以增加细胞粘附的线索。本文介绍了使用能够经济高效地形成结直肠癌类器官的腺癌细胞系评估和表征各种生物功能肽水凝胶对细胞粘附和管腔形成的影响所需的方案。这些方案将有助于使用免疫染色和荧光图像分析评估生物功能肽水凝胶对细胞粘附和管腔形成的影响。本研究中使用的细胞系以前已用于在动物源性基质中生成类器官。

In recent years, self-assembling peptides (SAPs) have emerged as promising biomaterials for tissue engineering applications. SAPs possess unique properties, including spontaneous formation of nanofibers, biocompatibility, biodegradability, and non-immunogenicity, making them attractive candidates for scaffold development1. SAPs have been previously used together with various types of cells, and notably, reported ultrashort SAPs have facilitated the encapsulation of stem cells while upholding their pluripotency over prolonged periods encompassing more than 30 passages and with minimal incidence of chromosomal aberrations2,3,4. Hence, adapting SAPs for their use in organoid culture constituted a rational subsequent step.
Organoids are complex three-dimensional structures that arise from single pluripotent cells. These structures give rise to various cell types, which then self-organize to replicate the developmental processes of embryonic and tissue growth in vitro5. This innovative framework has evolved into a formidable tool for in vitro investigations, efficiently conserving the genetic, phenotypic, and behavioral attributes characteristic of in vivo organs6. Nevertheless, a principal impediment in the bench-to-bedside transition of organoid-based findings is the need for reproducibility7. This variation in results is primarily ascribed to the difficulty in fully differentiating human pluripotent stem cells into specialized cell lineages, compounded by the absence of authentic tissue architecture and the inherent complexity encountered in organoid models. Given the rise in popularity of stem-cell- and organoid-based studies8, there has been an escalated demand for biomaterials with dynamic mechanical properties and integrin-like adhesion sites or scaffolds with controlled degradability7,9. These attributes can be effectively tuned through the strategic utilization of biofunctionalized SAPs.
SAPs are short sequences of amino acids with the inherent ability to spontaneously organize into well-defined structures10. These peptides often contain alternating hydrophobic and hydrophilic residues, which drive their self-assembly through non-covalent interactions, including hydrogen bonding, electrostatic interactions, and hydrophobic effects11,12. The self-assembly process of these peptides is primarily driven by the need to minimize the system&#39;s free energy. When in an aqueous environment, the hydrophobic residues tend to cluster together to minimize their exposure to water, while the hydrophilic residues interact with the surrounding water molecules. This phenomenon leads to the formation of various nanostructures. In this case, ultrashort self-assembling peptides form nanofibers with characteristics that depend on the peptide sequence and environmental conditions2,12,13,14,15,16. These peptides adopt a &#946;-turn conformation, where individual peptide strands align parallel or antiparallel to each other, stabilized by hydrogen bonds (Figure 1). The presence of positive ions accelerates the self-assembling processes that lead to nanofiber formation.
Peptide nanofibers have been identified as possessing an innate ability to entrap significant volumes of water. This characteristic facilitates the generation of a hydrogel, which subsequently manifests as a biocompatible and biodegradable three-dimensional space conducive to cellular proliferation and growth. These self-assembling peptide nanofibers intricately emulate the topographical features inherent to the natural extracellular matrix (ECM) environment1. This resemblance endows cells with an environment that imitates their physiological habitat, further promoting optimal cellular activities17. Furthermore, the versatility inherent to these peptides permits a considerable degree of tunability4. Such adaptability enables changes to the matrix&#39;s properties, such as stiffness, gelation kinetics, and porosity. These adaptations are achieved through modifications to the peptide sequence. Consequently, self-assembling peptides (SAPs) have emerged as pivotal components in contemporary biomaterial science, extensively used as scaffolds for tissue regeneration and cellular culture13,17.
One of the critical advantages of self-assembling peptides is their ability to be easily synthesized and modified at the molecular level. This advantage allows for the incorporation of specific functional groups or bioactive motifs into the peptide sequence, enabling the design of peptides with tailored properties and functionalities18,19,20 (Figure 1B). For example, biofunctionalized SAPs can be designed to mimic the ECM and promote differentiation using the RGD peptide19,21. Peptide Ben-IKVAV has also been reported to significantly increase the expression of neuronal-specific markers due to its ligand-specific motiety22. These peptides can also be engineered to display bioactive molecules, such as integrin-binding peptides, to enhance cell survival23. Finally, other biofunctionalized SAPs have been developed to promote angiogenesis by including the IKVAV and YIGSR motifs in their structures24.
Biofunctionalized SAPs reported in an earlier publication show that self-assembling can be further modified by including the na&#239;ve peptide from which the biofunctionalized SAP was derived25. These SAP mixtures can also provide a wide array of SAP formulations that vary in their biochemical activity and physicochemical properties. For instance, the amphiphilic peptide IIFK is an ultrashort SAP that can withstand biofunctionalization with various motifs, exemplified by the incorporation of the IKVAV motif (Figure 1B). Both peptides can form nanofibers, both alone and combined. Each formulation results in hydrogels with varying physical properties (Figure 2)
However, because of the extensive array of potential permutations and alternatives obtained from the biofunctionalization of SAPs, there is a need to provide a fast and cost-effective option for organoid testing. One candidate for such intensive and cost-effective organoid evaluation is the SW1222 cell line, derived from human colorectal adenocarcinoma26,27. SW1222 cells possess characteristics that enable their aggregation into 3D structures resembling organoids, making them an ideal model for studying tissue development and regenerative medicine applications. SW1222 cells have been identified as capable of generating organoids owing to their intrinsic overexpression of the LGR5 gene27. The creation of organoids from individual LGR5+ stem cells has been convincingly exhibited before, as well as the propensity of SW1222 cells to achieve morphological characteristics of a colorectal cancer organoid28.
In this methods paper, we present detailed protocols for evaluating and characterizing the effects of various biofunctional peptides on cell adhesion and lumen formation using SW1222 cells (Figure 3). By providing step-by-step procedures and imaging analysis methods, we hope to offer valuable insights into the biofabrication of organoids and the evaluation of simplistic SAP matrices for organoid culture.

作者聚焦：结直肠癌类器官的超短肽基质优化

在超短自组装肽基质中制备和表征来自 SW1222 细胞系的结直肠癌类器官

Our research aims to evaluate ultrashort self-assembling peptides as matrices for Colorectal Cancer Organoid Cultures. We address questions about organoid morphology, for viability, proliferation, and the adhesion and the impact of biofunctionalization. The goal is to optimize peptide matrix compositions for effective organoid growth, and to contribute to regenerative medicine.Cutting-edge technologies in our field involve 3D bioprinting for precise organic fabrication, microfluidic platforms for dynamic culture environments, and advanced imaging tools like atomic force microscopy and multiphoton microscopy. CRISPR-Cas9 gene editing refines genetic modification, while single cell RNA sequencing provides in-depth molecular insights. Current experimental challenges include enhancing organoid reproducability, refining vascularization for larger constructs, and mimicking complex tissue architecture.Overcoming these limitations in long-term culture and incorporating immune components into models are active areas. Achieving standardized protocols and addressing ethical concerns opposing ongoing challenges in this field. Significant findings in our field include demonstrating the suitability of ultrashort self-assembling peptides for organoid cultures.We have shown the versatility, reproducability, and stability of these peptides, providing a platform for fine tuning micro-environments. This contributes to advancing organoid-based studies, regenerative medicine, and biofunctionalized hydrogel research. Our protocol bridges and research gap, whereby providing a systematic approach to evaluating organoids in ultrashort self-assembling peptide matrices.It addresses the need for standardized methods in assessing cell behavior within these matrices, aiding in durational design of peptide-based hydrogels for optimal organoid growth and advancing regenerative medicine studies.

首先，我们使用明场成像评估了在 24 孔板中生长 7 天的细胞。我们确定了在一周内组装成类器官的小细胞簇，如图 4 所示。受控扫描方法可以跟踪细胞和类器官在不同日期之间的活动。一般来说，我们观察了整周细胞形态的演变。SW1222 衍生的类器官应具有圆形形态和浅色外观。较暗的外观表明不希望的细胞密度较高，如在 Peptide P 中培养的一些菌落第 7 天所见（<strong class="...

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该方案旨在通过免疫染色评估生物功能自组装肽的细胞粘附、类器官形态和基因表达。我们将使用结直肠癌细胞系提供一种经济高效的方法来获取用于强化测试的类器官。

Ultrashort self-assembling peptides (SAPs) can spontaneously form nanofibers that resemble the extracellular matrix. These fibers allow the formation of ...

我们的研究旨在评估超短自组装肽作为结直肠癌类器官培养物的基质。我们解决了有关类器官形态、活力、增殖、粘附和生物功能化影响的问题。目标是优化肽基质组成以实现有效的类器官生长，并为再生医学做出贡献。我们领域的尖端技术包括用于精确有机制造的 3D 生物打印、用于动态培养环境的微流体平台，以及原子力显微镜和多光子显微镜等先进的成像工具。CRISPR-Cas9 基因编辑可优化基因修饰，而单细胞 RNA 测序可提供深入的分子见解。目前的实验挑战包括增强类器官的可重复性、优化更大结构的血管化以及模拟复杂的组织结构。在长期培养中克服这些限制并将免疫成分纳入模型是活跃的领域。实现标准化协议并解决道德问题，以应对该领域持续的挑战。我们领域的重要发现包括证明超短自组装肽适用于类器官培养。我们已经展示了这些肽的多功能性、可重复性和稳定性，为微调微环境提供了一个平台。这有助于推进基于类器官的研究、再生医学和生物功能化水凝胶研究。我们的方案弥合了研究差距，从而提供了一种系统的方法来评估超短自组装肽基质中的类器官。它满足了评估这些基质中细胞行为的标准化方法的需求，有助于持续设计基于肽的水凝胶以实现最佳类器官生长，并推进再生医学研究。

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Fabrication and Characterization of Colorectal Cancer Organoids from SW1222 Cell Line in Ultrashort Self&#45;Assembling Peptide Matrix

218 次观看.  King Abdullah University of Science and Technology. 我们的研究旨在评估超短自组装肽作为结直肠癌类器官培养物的基质。我们解决了有关类器官形态、活力、增殖、粘附和生物功能化影响的问题。目标是优化肽基质组成以实现有效的类器官生长，并为再生医学做出贡献。我们领域的尖端技术包括用于精确有机制造的 3D 生物打印、用于动态培养环境的微流体平台，以及原子力显微镜和多光子显微镜等先进的成像工具。CRI...