Nasze badania koncentrują się na złożonej odpowiedzi immunologicznej po niedokrwieniu mózgu spowodowanym udarem niedokrwiennym i zatrzymaniem krążenia. Niedokrwienie mózgu wyzwala aktywację rezydujących komórek odpornościowych w mózgu i infiltrację komórek odpornościowych. Jednak nasza wiedza na temat tych komórek odpornościowych pozostaje ograniczona.
Naszym celem jest zbadanie stanu odpornościowego, pochodzenia i funkcjonalnych ról komórek mózgowych po niedokrwieniu. Ostatnie badania podkreślają zaskakującą rolę czaszki w odpowiedzi immunologicznej mózgu po urazie. Dlatego ważne jest, aby przeanalizować zmiany w komórkach odpornościowych zarówno w tkance mózgowej, jak i szpiku kostnym czaszki po niedokrwieniu mózgu.
W tym celu kluczowym krokiem jest uzyskanie wystarczającej liczby wysokiej jakości komórek odpornościowych do dalszej analizy. Nasze protokoły umożliwiają naukowcom szybkie uzyskanie dużych ilości dostępnych komórek odpornościowych z mózgu i szpiku kostnego czaszki. Protokół komórek odpornościowych mózgu wykorzystuje metodę dysocjacji mechanicznej w niskich temperaturach, zapewniając lepsze zachowanie profilu transkrypcyjnego i proteomicznego.
Protokół szpiku kostnego czaszki jest prosty, ale skuteczny w ekstrakcji komórek szpiku kostnego z czaszki. Będziemy kontynuować nasze kompleksowe badania nad wpływem niedokrwienia mózgu na komórki odpornościowe w tkance mózgowej i czaszce. Biorąc pod uwagę, że zapalenie nerwów odgrywa kluczową rolę w przeszłości fizjologia uszkodzenia mózgu po niedokrwieniu, oczekuje się, że nasze badania odkryją nowe cele terapeutyczne w zakresie ochrony mózgu po udarze niedokrwiennym lub zatrzymaniu krążenia.
Aby uzyskać zawiesinę pojedynczej komórki z izolowanego mysiego mózgu, umieść mózg w wstępnie schłodzonym 15-mililitrowym homogenizatorze szklanym zawierającym odpowiednią ilość lodowatego roztworu soli Hanksa lub buforu HBSS. Użyj luźnego tłuczka do puchu, aby delikatnie i powoli rozdzielić tkankę mózgową za pomocą około 100 do 120 uderzeń na lód. Przefiltruj powstałą zawiesinę tkanki mózgowej przez sitko do komórek o wielkości 70 mikronów w 50-mililitrowej probówce wirówkowej.
Przepłucz rurkę z pięcioma mililitrami HBSS i przystąp do filtracji, aby zmaksymalizować zbieranie komórek Odwirować przefiltrowaną zawiesinę tkankową o stężeniu 550 G przez sześć minut w czterech stopniach Celsjusza. Usunąć supernatant za pomocą aspiratora próżniowego i ponownie zawiesić podniebienie komórkowe w jednym mililitrze 30% roztworu gradientu gęstości izotonicznej. Przenieść zawiesinę komórkową do 15-mililitrowej probówki wirówkowej.
Dodaj odpowiednią ilość roztworu gradientu gęstości 30% i delikatnie odwróć probówkę, aby zapewnić dokładne wymieszanie. Natychmiast odwirować probówkę przy 840 5G z przyspieszeniem i hamulcem ustawionym na poziomie trzecim przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po zakończeniu delikatnie wyjmij probówkę z wirówki bez potrząsania i ostrożnie zassaj górną warstwę mylinu za pomocą jednomililitrowej końcówki podłączonej do próżni, a następnie odessaj supernatant, pozostawiając jeden do dwóch mililitrów i ponownie zawieś paletę komórek z co najmniej 10 mililitrami zimnego HBSS.
Wirować w temperaturze 550 g przez sześć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Przemyć jeszcze raz co najmniej siedmioma mililitrami zimnego HBSS i ponownie odwirować po usunięciu jak największej ilości supernatantu, ponownie zawiesić komórki w 100 do 200 mikrolitrach buforu cytometrii przepływowej do analizy cytometrii przepływowej. Aby przygotować zawiesinę jednokomórkową szpiku kostnego z łydki myszy, pod mikroskopem preparacyjnym ostrożnie oderwij oponę twardą od izolowanej czaszki za pomocą kleszczy.
Umieść cielę w naczyniu zawierającym PBS trzymanym na lodzie i użyj jednomililitrowej pipety, aby je przepłukać, upewniając się, że usunięto resztki krwi z jej powierzchni, przenieś calverię do nowego naczynia zawierającego wystarczającą ilość świeżego zimnego PBS wystarczającą do jej zanurzenia. Użyj sterylnych nożyczek, aby pokroić calverię na fragmenty o wymiarach około trzech milimetrów na trzy milimetry w zimnym PBS. Za pomocą igły o rozmiarze 18 przebij otwór w dnie mikroprobówki wirówkowej o pojemności 500 mikrolitrów.
Włóż tę probówkę do 1,5 mililitrowej mikroprobówki wirówkowej zawierającej 20 mikrolitrów zimnego PBS. Następnie przenieś fragmenty calverii do probówki o pojemności 500 mikrolitrów. Odwirować zestaw przy 10 000 G przez 30 sekund w temperaturze czterech stopni Celsjusza.
Ponownie zawiesić zebrane komórki szpiku kostnego w 500 mikrolitrach buforu do lizy czerwonych krwinek i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 sekund, przenieść zawiesinę do 15-mililitrowej probówki wirówkowej zawierającej cztery mililitry zimnej wirówki PBS o stężeniu 400 G przez sześć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Umyj jeszcze raz pięcioma mililitrami zimnego PBS. Na koniec należy ponownie zawiesić podniebienie komórkowe w odpowiednim buforze.
