Chcieliśmy zaprojektować prosty, niedrogi sposób hodowli bakterii utleniających metan w laboratorium, który bardziej przypomina środowisko naturalne. Chcieliśmy to zrobić, aby odkryć fenotypy bakteryjne, których brakuje w standardowych warunkach hodowli laboratoryjnej, i ostatecznie powiązać te fenotypy z ich determinantami genetycznymi. Strzykawka gradientowa jest uproszczoną wersją wcześniej opisanych metod hodowli melanotrofu w przeciwgradiencie metanowo-tlenowym.
Ta metoda nie wymaga ciągłych przepływów substratów gazowych, co pozwala na równoległe uruchamianie wielu powtórzeń. Możemy również wykonywać testy biochemiczne bezpośrednio na bakteriach hodowanych w agarozie. Naukowcy mają praktycznie nieograniczony dostęp do sekwencji genomu bakteryjnego, ale nadal trudno jest umieścić wszystkie te informacje w kontekście.
Nasze odkrycia pokazują, że kluczowe znaczenie ma uwzględnienie środowiska, w którym wyewoluowała bakteria, aby lepiej zrozumieć rolę poszczególnych genów. Planujemy wykorzystać techniki takie jak metabolomika porównawcza i proteomika, aby dowiedzieć się więcej o tym, jak melanotrofy reagują na swoje położenie w gradiencie licznika metan-tlen. Planujemy również wyhodować wiele szczepów w tej samej strzykawce gradientowej, aby zobaczyć, jak oddziałują na siebie w kontekście rozdzielczości przestrzennej.
Na początek zdobądź płytkę hodowlaną z koloniami gatunku methylomonas LW13. Zaszczepić kolonie w sześciu mililitrach pożywki z solami mineralnymi azotanów w szklanej probówce, uszczelnić probówkę korkiem do surowicy i aluminiową uszczelką zaciskaną. Dodaj metan za pomocą strzykawki, aby uzyskać końcową atmosferę o zawartości 50% objętości metanu w powietrzu.
Potrząśnij tą płynną kulturą planktonu z prędkością 200 obrotów na minutę w temperaturze pokojowej, aż stanie się mętna, co zajmuje około jednego dnia. Płynne kultury należy przepuścić w stosunku od 1 do 10 do świeżych pożywek. Kontynuuj hodowlę płynnych kultur melanotrofu do logarytmicznego wzrostu fazowego, osiągając gęstość optyczną przy 600 nanometrach około 0,5.
Aby przygotować strzykawkę, należy usunąć dołączone tłoki i umieścić ją w sterylnym pojemniku. Do każdej strzykawki przymocuj sterylną końcówkę filtra z politetrafluoroetylenu lub PTFE i umieść strzykawkę w standardowym stojaku na probówki końcówką skierowaną w dół. Następnie wymieszaj jeden mililitr komórek z pięcioma mililitrami pożywki z soli mineralnych azotanu i czterema mililitrami stopionej agarozy w sterylnej stożkowej probówce.
Powoli wlej mieszaninę agarozy do strzykawki do oznaczenia ośmiu mililitrów i pozwól jej zastygnąć. Po około 15 minutach zakryć strzykawkę sterylnym korkiem z gumy butylowej o grubości 20 milimetrów. Zabezpieczyć korek taśmą laboratoryjną i oznaczyć strzykawkę.
Następnie napełnij dużą 60-mililitrową strzykawkę 100% metanem i przymocuj końcówkę filtra PTFE podłączoną do sterylnej igły o rozmiarze 23. Przekłuć dużą strzykawką gumowy korek strzykawki z mieszaniną agarozy i wprowadzić drugą sterylną igłę jako wylot gazu. Wcisnąć tłok dużej strzykawki, aby 20 mililitrów 100% metanu przepłukało się przez przestrzeń nad głową.
Wyjąć igłę wylotową, gdy w strzykawce pozostał od jednego do dwóch mililitrów metanu, aby zapobiec cofaniu się tlenu. Inkubować strzykawkę z mieszaniną agarozy i metanu w temperaturze 18 stopni Celsjusza. Aby wytłoczyć agarozę, zastąp końcówkę filtra PTFE sterylną igłą o rozmiarze 23, a gumowy korek dostarczonym tłokiem strzykawki.
Powoli wciśnij tłok, aby dozować porcje o mililitr do oddzielnych sterylnych mikroprobówek wirówkowych o pojemności 1.5 mililitra. Dziki szczep LW13 tworzył wyraźny poziomy pas na określonej głębokości w strzykawce gradientowej, gdzie zarówno stężenie metanu, jak i tlenu było niskie. LW13 zaszczepiony w strzykawkach gradientowych wykazywał gradient przeciwbieżny metanowo-tlenowy z ubytkiem metanu i zużyciem tlenu odpowiadającym głębokości pasma poziomego.
Mutant delecji OAT LW13 nie miał wyraźnego poziomego tworzenia pasm obserwowanego w szczepie typu dzikiego, co wskazuje na rolę genu w tym fenotypie. Na początek należy uzyskać ekstrudowane segmenty agarozy ze strzykawek gradientowych zaszczepionych typem dzikim lub zmutowanym gatunkiem methylomonas LW13. Dodaj 0,75 mililitra 0,85% chlorku sodu w wodzie do wytłaczanej próbki agarozy i homogenizuj przez wirowanie.
Następnie rozcieńczyć próbkę od 1 do 10 w nowej mikroprobówce wirówkowej z 900 mikrolitrami roztworu soli. Inkubować próbki z trzema mikrolitrami mieszaniny jeden do jednego barwienia SYTO 9 i jodku propidyny w ciemności w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Aby określić liczbę komórek na mililitr agarozy, należy poddać sonikę zawiesiny kulek zliczających mikrosfery w łaźni wodnej przez pięć minut.
Następnie dodać 10 mikrolitrów zawiesiny do próbki przed analizą cytometrii przepływowej. Analizuj próbki za pomocą cystometru przepływowego. Porównaj wykresy punktowe rozproszenia bocznego i rozproszenia do przodu między bezkomórkowymi próbkami kontrolnymi a zaszczepionymi próbkami agarozy, aby narysować bramki napięcia zdarzeń bakteryjnych, które wykluczają cząstki agarozy tła.
Aby policzyć jednostki tworzące kolonie w strzykawce gradientowej, dodaj 800 mikrolitrów pożywki z solami mineralnymi azotanu do wytłaczanego segmentu agarozy i wiruj przez 10 sekund, aby pomóc w pieszczotach pi. Przygotuj sterylną 96-dołkową płytkę ze 180 mikrolitrami azotanowych soli mineralnych w każdym dołku. Dodać 20 mikrolitrów rozcieńczonej próbki agarozy do każdego dołka w pierwszej kolumnie i wymieszać.
Za pomocą pipety wielokanałowej rozcieńczyć seryjnie 20 mikrolitrów próbek dziesięciokrotnie, zaczynając od pierwszego rzędu studzienek. Oznacz kwadratową płytę siatkową zawierającą azotany, sole mineralne, ślimak lub wybrane media. Za pomocą pipety wielokanałowej natrzyj pięć mikrolitrów z kolumny płytki 96-dołkowej na płytkę ślimakową.
Cytometria przepływowa, wykorzystująca ekstrudowane próbki agarozy, potwierdziła, że mutant delecji OAT LW13 wykazywał zmniejszony wzrost komórek w porównaniu ze szczepem typu dzikiego. Uzupełnienie mutanta genem OAT przywróciło liczbę komórek i tworzenie prążków do poziomów podobnych do typu dzikiego, co wskazuje na specyficzną rolę genu w tworzeniu prążków.
