As enzimas requerem componentes adicionais para uma função adequada. Existem duas dessas classes de moléculas: cofatores e coenzimas. Cofatores são iões metálicos e coenzimas são moléculas orgânicas não-proteicas. Ambos os tipos de moléculas auxiliares podem estar firmemente ligados à enzima ou ligados apenas quando o substrato se liga.

Os cofatores estão presentes em ~30% das proteínas maduras. Eles são frequentemente incorporados em uma enzima à medida que ela é dobrada e estão envolvidos na atividade catalítica da enzima. O magnésio é um cofator essencial para mais de 300 enzimas no corpo humano, incluindo a DNA polimerase. Neste caso, o ião magnésio auxilia na formação da ligação fosfodiéster no esqueleto do DNA. Ferro, cobre, cobalto e manganês são outros cofatores comuns.

Muitas vitaminas são coenzimas, uma vez que são moléculas auxiliares orgânicas, não proteicas para enzimas. Por exemplo, a biotina—um tipo de vitamina B—é importante em uma variedade de enzimas que transferem dióxido de carbono de uma molécula para outra.  Biotina, vitamina A e outras vitaminas devem ser ingeridas na nossa dieta, pois não podem ser produzidas por células humanas.