A gravação óptica de atividade elétrica na Guiné-porco Networks Enteric usando Tensão sensível Corantes

Resumo

Este protocolo ilustra como sensíveis à voltagem corantes permitir a gravação ótica da atividade elétrica de redes neurais intactos, como os plexos do cobaia sistema nervoso entérico, com uma resolução ajustável que varia de single-células ganglionares para multi-circuitos.

Resumo

O sistema nervoso entérico (ENS) é uma rede independente com funções identificadas, capaz de executar comportamentos complexos em isolamento. Seus neurônios (10 a 25 m de diâmetro) são arranjados em plexos que se limitam a planos distintos da parede do intestino

Protocolo

Parte 1: preparação do tecido

1. Os preparativos submucoso e mioentérico do plexo são isolados por dissecção seqüencial a partir do intestino delgado de 150-200g (2-3 semanas de idade) Hartley porcos guinea que foram anestesiados por inalação de isoflurano e decapitado. Após a eutanásia, o intestino delgado é cortado e seu conteúdo removido por lavagem do lúmen com uma solução quente e oxigenado. Usamos Meio 199 suplementado com HEPES 25 mM, 5 mM NaHCO ₃ e 2 mM de glutamina, e pH ajustado para 7,4 (referido, a partir de agora, como M199-DM), que foi pré-aquecido a 37 ° C. Todas as etapas restantes do protocolo, no entanto, serão realizadas à temperatura ambiente.
2. Um segmento intestinal, 8-10 cm de comprimento, é transferido para um prato contendo Sylgard M199-DM, abriu ao longo da fronteira mesentérica, e montado mucosa lado-up utilizando os pinos de insetos. É extremamente importante manter a tensão, de modo que após a fixação do tecido apresenta uma forma rectangular com as linhas de vilosidades da mucosa regularmente alinhados.
3. Utilizando uma pinça fina Dumont com pontas retas, numa posição quase horizontal, é fácil de descascar a mucosa, agarrando as vilosidades em uma extremidade da preparação e afastando-se ao longo do eixo longitudinal do tecido. Quando a amostra é uniformemente preso, fitas de mucosa podem ser separados em alguns cursos individuais, expondo a submucosa que contém os gânglios submucosos e da vasculatura submucosa.
4. Para a dissecção fina dos plexos, recomendamos o uso de um microscópio de dissecação com iluminação de campo escuro. Na verdade, o efeito tridimensional pseudo criado por este tipo de iluminação ajuda a distinguir as camadas individuais, assim, prevenir ou minimizar danos infligidos instrumento.
5. Para fazer uma preparação submucosa, seguimos o procedimento clássico de Hirst e McKirdy ^4, que requer: a) fazer um corte na camada submucosa seguir a orientação das fibras musculares circular, o que pode ser conseguido usando uma tesoura muito fina (como um Moria MC19 ou seu equivalente); b) elevação da submucosa muito suavemente com a pinça fina, enquanto empurra a camada muscular circular para baixo, usando a tesoura fina; c) o corte longitudinal ao longo das bordas como a separação progride para libertar a submucosa do resto do prep; d) fazer um segundo corte seguindo a orientação das fibras musculares circular a uma distância do primeiro, para definir o tamanho final da preparação da submucosa. O segmento resultante da submucosa, que é apenas 30 a 50 mm de espessura e tem uma aparência gossamer, podem ser transferidos para um outro prato Sylgard contendo fresco M199-DM, gentilmente preso e sem tensão, e mantidos em uma câmara de oxigenada para uso posterior.
6. O original do intestino segmento, agora privados de mucosa e submucosa, e com o músculo circular exposto, ainda pode ser usado para produzir uma preparação plexo mioentérico. Para expor o plexo mientérico, deve-se eliminar o máximo possível da camada muscular circular. Isto pode ser conseguido usando a mesma ponta reta fina fórceps empregados nas etapas anteriores. Feixes de fibras pode ser puxado para fora delicadamente, primeiro de um, e, em seguida, do outro lado da preparação. O exposto plexo mioentérico não pode ser separada da camada longitudinal de músculo ea serosa subjacente. Portanto, o que é chamado a preparação plexo mientérico é o segmento que pode ser cortada ao longo da pinos. Porque contém músculo vivo, é aconselhável fixá-lo de forma muito vaga no prato contendo oxigenados M199-DM até que a experimentação fisiológica começa.
7. Uma vez que a mucosa é o sensor ENS principal, e todos os efetores são também incorporados na parede do intestino, é possível dissecar semi-intactas preparações que preservam todo vias reflexas. Estas preparações personalizados exigem combinações dos passos descritos no ponto 1.3. para 1,6., aplicada a áreas adjacentes do segmento isolado intestinal.
8. Poucos minutos antes do experimento real óptica, a preparação de escolha é montado na câmara experimental, certificando-se que a tensão é distribuída uniformemente eo tecido fica completamente plana contra o fundo Sylgard. Isto é conseguido mantendo a amostra com múltiplos pinos muito fino que pode ser posicionada em todo o perímetro sem infligir danos aos tecidos.

Parte 2: Preparação de amostras de tecido para a gravação óptica

1. (Opcional) Para evitar a fluorescência de fundo de corante ligação ao músculo liso residual e do tecido conjuntivo, tanto plexos isolados podem ser incubadas por 30-60 min em M199-DM contendo colagenase VII (≤ 50 U / ml) e Protease IX (≤ 0,5 mg / ml). Após o tratamento enzimático os preparativos devem ser lavadas com, e mantido durante a noite em, M199-DM, mais 10% de soro de animais (por exemplo, eqüino ou bovino) e antibióticos (penicilina, 100U/ml; estreptomicina, 100 mg / ml), em um câmara saturada wiº 95% O ₂ e 5% CO _2. Este procedimento, que temos usado por muitos anos porque ele melhora visivelmente a relação sinal-ruído das gravações óptica, pode não ser útil para iniciantes e deve ser adotada com cautela. De fato, uma preparação danificados durante a dissecção corre o risco de se desintegrar durante o tratamento enzimático. No entanto, mesmo na ausência do tratamento enzimático, recomendamos que os preparativos ser mantida durante a noite em M199-DM com soro e antibióticos. Esta etapa promove a cura do tecido após a lesão dissecção aguda, e aumenta a transparência da amostra.
2. Gravações ópticas de atividade elétrica não pode ser alcançada em uma preparação em que o músculo está se contraindo. Portanto, para evitar a contração muscular durante a gravação do plexo mioentérico, poucos minutos antes do experimento óptico que adicionar 2 nifedipina mM para o banho M199-DM do tecido.

Parte 3: A coloração com di-4-ANEPPDHQ

1. Di-4-ANEPPDHQ está disponível comercialmente na forma liofilizada. Recomendamos dissolvendo-o em etanol puro, fazendo uma solução estoque concentrada [ml por exemplo, 15-20 mg /]. Este estoque, quando conservados a -20 ° C, é extremamente estável. De fato, em nosso laboratório, nós acabamos a última gota de uma solução estoque deste corante que tínhamos feito há quase 6 anos.
2. A solução de coloração deve ser preparado em M199-DM, e deve conter duas nifedipina mM se o protocolo exige. A concentração final do corante pode ser tão baixos quanto 5 mg / ml e não deve ser superior a 50 mg / ml. No entanto, dependendo da concentração das ações, uma certa quantidade de etanol vai estar presente na solução de coloração e deve ser levado em conta. Por exemplo, uma solução de coloração com 50 mg / ml de corante conterá ~ 0,3% de etanol, se feita de um estoque 15 mg / ml, mas perto de 1% de etanol se o estoque tinha uma concentração de apenas 5 mg / ml.
3. Para a coloração, a preparação está submerso por 10-30 minutos na solução corante. Após esse período, o corante é removido e substituído por fresco, oxigenado M199-DM. Desde di-4-ANEPPDHQ é um corante de membrana impermeant-que fluoresce apenas quando em um ambiente de lipídios, os neurônios saudáveis ​​de uma preparação manchada entérico deve ter a aparência de balões vazios.

Parte 4: A estimulação elétrica

1. Estímulo pode ser conduzido por tensão ou por corrente. Usamos a estimulação atual, entregue por um computador controlado, gerador de estímulo de 4 canais com uma potência máxima de 16 mA por canal.
2. O modelo de eletrodo para ser utilizado em um experimento é determinado pelo objectivo experimental. Pipetas intracelular ou eletrodos patch pode ser usado quando o objetivo é a estimulação de um neurônio particular. Quando o estímulo se destina a ativar mais de um neurônio em um gânglio dado, um eletrodo extracelular tocar um conectivo pode ser usado. Para estudar gânglios interconexão, grande, de baixa resistência eletrodos e / ou multi-elemento de eletrodos podem ser empregadas, no entanto, quando se utiliza a estimulação atual como geralmente fazemos, multi-elemento arrays se tornam a única opção. Muitos modelos de eletrodos extracelular, bem como algumas matrizes de eletrodos linear, estão prontamente disponíveis a partir de fontes comerciais.
3. Eletrodos podem ser posicionados usando diferentes tipos de micromanipuladores. Para evitar a vibração induzida por barris longos e finos, que defendem o uso micromanipuladores pequeno em bases magnético que pode ser posicionada adjacente à câmara experimental, e apoiar os barris flexível dos eletrodos de tungstênio com barras de metal fino, mas muito rígida.

Parte 5: Perfusão

Nós usamos um de 2 canais bomba peristáltica com um canal para a entrada de soluções oxigenado, e outra para saída. Para eliminar distúrbios mecânicos induzida pela perfusão, a bomba é ligada-off durante a aquisição de dados ópticos.

Parte 6: Aparelho para a gravação de vários sites óptica do potencial de membrana

1. Componentes ópticos:
   
   O aparelho para a gravação de vários sites óptica do potencial de membrana inclui uma câmera NeuroCCD-SM (RedShirtImaging) e uma lente demagnifier / relay 01:10 montado no tubo trinocular de um microscópio de pé. O microscópio se move sobre um tradutor XY, independentemente de um estágio que é rigidamente fixados no topo de uma tabela ativa vibração isolamento. Para minimizar a vibração no ar, todo o aparato é cercada por cortinas acústicas pesados ​​e um telhado de mylar. Epi-iluminação é fornecida por uma lâmpada de tungsténio-100W alimentado por uma ultra-low-ripple da fonte de alimentação estabilizada comentários. A luz incidente é feita quase monocromática usando um filtro de calor, um alto-Q filtro de interferência (HQ530/50) e um 565 nm (50% de transmissão) espelho dicróico. Emissão de fluorescência é separado usando o espelho dicróico e um filtro passa-tempo (HQ572LP). A intensidade da luz incidente é ajustado através de filtros de densidade neutra. Trans-iluminação, para a brilhante campo de visão da preparação é fornecido por uma 100 W segunda lâmpada de tungsténio-impulsionada por um V 0-55, 1-10 A fonte de alimentação que não é necessário possuir quaisquer atributos especiais.
   
   
2. Alta velocidade especificações da câmera:
   
   O projeto eletrônico e as características de desempenho da câmera NeuroCCD-SM têm sido descritos em detalhe ^3. Resumidamente, é uma resolução, resfriado baixo, a precisão câmera de alta velocidade que usa o back-diluído, retro-iluminado Marconi chips CCD39-01 (80x80 pixels). Digitalização é de 14 bits, ea taxa de quadros total é de 2 kHz. No entanto, para fins específicos, pode-se aumentar o frame-rate, até um máximo de 10 kHz, usando combinações de várias binning ou reduzir o número de pixels funcional. A câmera tem a importante vantagem de extremamente baixo ruído de leitura (23 elétrons em 2 kHz; 9 elétrons em 1 kHz). Além disso, seus pixels têm uma profundidade relativamente grande assim (215.000 elétrons), permitindo intensidades de luz moderada a altas taxas de quadros.
   
   
3. Aquisição de Dados e Software Análise:
   
   O experimento óptico é controlado por Neuroplex, um pacote de software de RedShirtImaging, que opera como um aplicativo na plataforma IDL (Interactive Data Language) e inclui vários recursos necessários para a exposição, aquisição e análise dos dados ópticos.
   
   
4. Camera adicionais:
   
   Como parte integrante do aparelho, um divisor de feixe na cabeça trinocular dos relés microscópio uma imagem da preparação para um segundo, a câmera CCD de alta resolução ligado a um quadro grabber. A imagem, que é adquirido e armazenado usando global Lab software Image / 2, pode ser sobreposto sobre a tela do milissegundo sub-time-resolved sinais ópticos capturada pela câmera NeuroCCD-SM para gerar um mapa preciso da origem espacial da opticamente registrados sinais de tensão. Em nosso laboratório, o frame grabber para esta câmera reside em um computador diferente do que o responsável pela aquisição de dados funcionais. Portanto, o arquivo de imagem tem que ser transferidas de um computador para outro, e pequenos ajustes no tamanho e posição da imagem de alta resolução são necessários antes do registo perfeito das duas câmeras é alcançado.

Parte 7: experimentos Optical

1. Antes de cada gravação funcional, nós adquirimos a imagem de alta resolução em preto e branco da região da qual pretende gravar a atividade elétrica por meios ópticos (como indicado em 6.4). Esta imagem, quando sobreposta sobre o pixel mapa da câmera de alta velocidade, nos ajuda a identificar as estruturas que são a fonte dos sinais ópticos.
2. Na configuração do sistema adequado, Neuroplex (ver 6.3) também controla o obturador, e desencadeia a estimulação elétrica. Desde a alta velocidade de aquisição de dados exige considerável de alimentação do computador, é aconselhável, se possível, para usar um computador dedicado com uma grande quantidade de memória e um disco rígido de alta capacidade. Que, entretanto, não é trivial. Nosso próprio sistema, por exemplo, já há vários anos, emprega placas de aquisição de dados que são demasiado grandes para caber em state-of-the-art computadores. Como um compromisso, nós adotamos e dedicado ao nosso sistema óptico um Dell Precision 390 equipado com um drive de 500 GB e 4 GB de RAM. Esse computador permitiu-nos manter os nossos mais velhos, mas adequada, A / D e D / A placas, enquanto continua a fornecer energia suficiente para executar nossos experimentos.
3. Assim que a aquisição é longo, Neuroplex pode exibir os resultados em vários formatos complementares, alguns dos quais são detalhadas a seguir:
   1. Uma área da tela chamado de exibição da página mostra a imagem crua da preparação como capturado pela câmera de alta velocidade 80x80 como um quadro individual. Superposição para este pixel mapa da imagem de alta resolução obtidas com a segunda câmera (como explicado em 6.4 e 7.1) refina a capacidade do operador s para identificar áreas de interesse.
   2. Quando pixels desta exibição da página são selecionados sob o controle do mouse, Neuroplex converte automaticamente os seus resultados ópticos em traços que mostram a magnitude da mudança óptico registrado por aqueles pixels em função do tempo. (Por exemplo, ΔF / F versus tempo). O operador pode decidir se esses traços devem refletir a saída de pixels individuais, ou melhor, a saída do espaço-média de locos múltiplos sobre uma dada região da preparação.
   3. Os dados também podem ser exibidos em formato de filme.
      
      Para garantir que todas as informações contidas em corridas experimentais indivíduo é totalmente extraído, no entanto, nós somos a favor off-line análise de dados ópticos. Resultados representativos desta análise estão disponíveis.

Parte 8: Como alcançar a qualidade técnica em um experimento de óptica

Thsucesso técnico e de um experimento ótico é medida, em última instância, pelo sinal-ruído das gravações. Além disso, uma relação sinal-ruído bom não advém de uma epifania, mas a partir de uma viagem. Como em uma ópera, o resultado final é determinado por uma multiplicidade de fatores que interagem sinergicamente. Assim, para alcançar uma experiência de som tecnicamente óptico, é essencial para refinar, independentemente, do aparelho óptico e as competências necessárias para cada passo do protocolo. O que se segue é uma lista de potenciais problemas áreas, e algumas sugestões para evitar problemas nem sempre antecipado ^5:

1. Fontes de ruído
   
   Estabilidade mecânica e ótica são cruciais quando gravar a atividade elétrica com voltagem-sensíveis corantes, porque a mudança fracionária (ΔF / F), refletindo respostas fisiológicas é relativamente pequena (<10% / 100 mV na maioria das gravações do intestino) e um traço sempre ruidosos augura um mau resultado. Portanto, para otimizar a relação sinal-ruído, torna-se imperativo para eliminar ou, pelo menos, minimizar, as contribuições dos dois piores: a vibrações) mecânico, e b) flutuação fonte de luz.
   
   
   1. Vibrações mecânicas são gerados por uma variedade de fontes tão diversas como a instalação, configuração construção da estabilidade, a proximidade de equipamentos motorizados, correntes de ar, o ruído acústico, movimento fluido, ou partículas que flutuam na solução de banho. Um sistema de vibração isolamento bom, e cortinas acústicas para casos extremos (ver, por exemplo, a descrição em 5.1), fazer uma grande diferença e valem bem a pena o seu custo. Além disso, de senso comum abordagens, tais como filtração de soluções utilizadas no experimento, ou o uso de bases magnéticas para peças pequenas e móveis da instalação, são bastante eficazes.
   2. Fontes de luz são mais estáveis ​​em quasi-máxima intensidade. Portanto, deve-se definir um limite de corrente para a fonte de alimentação, e, quando necessário, reduzir a intensidade da luz através da inserção de filtros de densidade neutra no caminho de luz em vez de reduzindo a tensão. Lâmpadas de arco são intrinsecamente ruidoso. Tungstênio-halogênio lâmpadas ou diodos emissores de luz são muito mais estáveis ​​e devem ser a escolha preferida ^6.
      
      
2. Idade do animal
   
   Dissecção deve ser feito usando o intestino de animais jovens, porque, como o tecido conjuntivo dentro do intestino endurece com a idade, torna-se mais difícil separar as camadas de tecidos sem causar grandes danos nos neurônios dos dois plexos, cujo aferentes e eferentes processos podem atravessam as fronteiras da camada e / ou projeto para uma boa distância ao longo do eixo longitudinal do intestino. Este comunicado, que pode ser desconsiderado quando se estuda intra-ganglionares conexões, é de suma importância quando o objetivo experimental é a análise de inter-ganglionares circuitos ou a ativação de vias reflexas.
   
   
3. Internalização Dye
   
   É importante para usar como uma concentração baixa de corante possível, e para minimizar a exposição à luz desnecessária. Apesar de di-4-ANEPPDHQ provou ser muito menos do que outros corantes fototóxica, ele vai ficar internalizada, eventualmente, como a saúde da preparação deteriora. Internalização corante diminui a relação sinal-ruído, aumentando dramaticamente a fluorescência de fundo ^3.
   
   
4. Manutenção eletrodo
   
   
   1. Eletrodos devem ser lavadas cuidadosamente e completamente após cada experimento. Depósitos orgânicos nas pontas dos eléctrodos de tungsténio aumentar a resistência do eletrodo e prevenir a estimulação.
   2. O isolamento do eletrodo de tungstênio disponível comercialmente é muito delicado e propenso a danos. Um vazamento no isolamento irá shunt atual, comprometer a eficácia da estimulação e comprometer o sucesso do experimento.
      
      
5. Perigos de perfusão
   
   Nunca deixe a autônoma set-up enquanto a perfusão está ligado. Se o fluxo de entrada e saída de fluxo da bomba peristáltica não são devidamente equilibrada, dois eventos catastróficos podem ocorrer:
   1. Uma inundação pode causar danos irreversíveis ao microscópio.
   2. A preparação pode secar durante o experimento.
      
      
6. Aborrecimentos Software
   
   É essencial para familiarizar-se com o software que controla aquisição, bem como análise. Rápida aquisição de dados e / ou a criação de arquivos muito grandes tendem a conduzir o sistema à beira do colapso, e Neuroplex, que é bastante implacável, irá falhar a menos que incansavelmente suas condições de contorno são respeitados. Sutilezas dentro dos registros, passa facilmente despercebida quando a análise se limita a regiões limitadas de interesse, muitas vezes se revelam em telas de cinema dos dados.

Discussão

Este protocolo foi escrito com dois objetivos em mente. O primeiro é convencer outros investigadores que, graças aos avanços tecnológicos muitas da década passada, a gravação ótica da atividade elétrica utilizando corantes sensíveis à tensão tornou-se um dos mais poderosos, metodologias confiáveis ​​e acessíveis para o estudo de redes neuronais intacta, na verdade , poderia ser facilmente implementado, mesmo em um laboratório com recursos modestos. O segundo objetivo é promover o sistema nervoso ent?...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Medium 199	Sigma-Aldrich	M3769	With Earle’s salts Without L-Glutamine, Phenol Red and Sodium Bicarbonate
Sylgard	Dow Corning	184 silicone elastomer kit
Insect pins used for dissection	F.S.T.	26001-30
Dumont forceps	F.S.T.	11203-23 or 11200-33
Moria MC19/B Pascheff-Wolff Spring Scissors	F.S.T.	15371-92
Pins to hold the tissue during the experiment	Seirin Corp.	Seirin Spinex
Collagenase VII	Sigma-Aldrich	C0773
Protease IX	Sigma-Aldrich	P6141
Fetal Bovine Serum	Invitrogen	10439-016
PenStrep	GIBCO, by Life Technologies	15140
L-Glutamine 100X	GIBCO, by Life Technologies	25030
Nifedipine	Sigma-Aldrich
Di-4-ANEPPDHQ	Molecular Probes, Life Technologies	D36802
4-Channel Stimulus Generator	Multi Channel System MCS GmbH	2000 Series
Peristaltic pump	Rainin	2-channel Dinamax RP-1
High-speed camera	RedShirtImaging, LLC	NeuroCCD-SM
1:10 demagnifier / relay lens	Optem, Qioptiq Inc.
Upright microscope	Olympus Corporation	BX61TRF
Gibraltar fixed stage with motorized X-Y translator	Gibraltar, Burleigh Instruments, EXFO, Quebec, Canada	PSSG--BX2
Linear matrix electrodes	FHC, Inc.	Custom made
Active vibration-isolation table	Halcyonics,Inc., Menlo Park, CA	Micro 60
Ultra-low-ripple feedback stabilized power supply	Kepco, Flushing, NY	ATE 75-15M
Heat filter	Schott AG	KG-1
High-Q interference filter	Chroma Inc.	HQ530/50
Dichroic mirror	Chroma Inc.	565 nm (50% transmission)
Long-pass filter	Chroma Inc.	HQ572LP
Acoustic curtains	Acoustical Surfaces, Inc.	BSC-25
Neuroplex	RedShirtImaging, LLC
IDL	ITT Visual Information Solutions
High-resolution CCD camera, with its own camera controller	Hamamatsu Corp.
Frame-grabber for high-resolution camera	Data Translation	DT3120K-1
Imaging software for high-resolution camera	Data Translation	Global Lab Image/2