PMS2 deficiente, ERCC1, Ku86, CCOI Defeitos em campo durante a progressão para cancro do cólon

Resumo

Expressão reduzida / ausente de PMS2 e / ou ERCC1 em criptas inteiro é um evento freqüente dentro de 10 centímetros em cada lado do adenocarcinomas do cólon, provavelmente a base de um defeito de campo com alta mutabilidade ea progressão para o câncer. Deficiência em Ku86 ou CCOI é muito menos freqüente nesses defeitos de campo.

Resumo

Na carcinogênese, o "defeito de campo" é reconhecida clinicamente por causa da alta propensão de sobreviventes de certos tipos de câncer de desenvolver outras doenças malignas do tipo de tecido mesmo, muitas vezes em um local nas proximidades. Defeitos de campo tenham sido indicados no câncer de cólon. As anormalidades moleculares que são responsáveis ​​por um defeito de campo no cólon deve ser detectável em alta freqüência no tecido histologicamente normal em torno de um adenocarcinoma do cólon ou em torno de um adenoma com neoplasia avançada (no bom caminho para um câncer de cólon), mas em baixa frequência na mucosa do cólon dos pacientes sem neoplasia do cólon.

Usando imunohistoquímica, criptas todo dentro de 10 cm em cada lado do adenocarcinomas do cólon ou avançado neoplasias do cólon foram encontrados para ser freqüentemente reduzida ou ausente na expressão de duas proteínas de reparo do DNA, PMS2 e / ou ERCC1. PMS2 é uma proteína duplo papel ativo no reparo mismatch DNA, bem como necessários na apoptose de células com danos no DNA em excesso. ERCC1 está activo no reparo de DNA por excisão de nucleotídeos. A expressão reduzida ou ausente de ambos ERCC1 e PMS2 criaria células com maior capacidade tanto para sobreviver (resistência a apoptose) e aumento do nível de mutabilidade. A expressão reduzida ou ausente de ambos ERCC1 e PMS2 é provável um passo inicial na progressão para o câncer de cólon.

DNA de genes de reparo Ku86 (ativo no DNA não-homólogos final juntar) e Citocromo Oxidase c Subunidade I (envolvidos na apoptose) cada um tinha sido relatada a ser diminuída na expressão em áreas da mucosa perto de câncer de cólon. No entanto, a avaliação imuno-histoquímica dos seus níveis de expressão mostrou apenas pouco a freqüências modesto de criptas a ser deficiente na sua expressão em um defeito de campo em torno do câncer de cólon ou ao redor neoplasia do cólon avançado.

Mostramos, aqui, nosso método de avaliação das criptas para a expressão de ERCC1, PMS2, Ku86 e CCOI. Nós mostramos que a freqüência de criptas todo deficiente para PMS2 ERCC1 e muitas vezes é tão grande quanto 70% a 95% em 20 centímetros áreas em torno de um longo neoplasia do cólon, enquanto que a freqüência das criptas deficiente em Ku86 tem um valor médio de 2% e freqüência de criptas deficiente em CCOI tem um valor médio de 16% nessas áreas. Todo o cólon é de 150 cm de comprimento (cerca de 5 pés) e tem cerca de 10 milhões criptas em sua camada mucosa. O defeito no PMS2 e ERCC1 em torno de um câncer de cólon, assim, poderá incluir um milhão criptas. É a partir de uma cripta com defeito que surge o câncer de cólon.

Protocolo

Preparar tecidos para ser visualizado em slides

1. A colonoscópio pode ser passado para o cólon através do reto. A colonoscópio é um tubo longo que tem iluminação e uma câmera de vídeo na cabeça, a capacidade de passar o ar para dentro do cólon para explodi-lo como um balão longo para permitir uma melhor visualização do cólon, e tem uma passagem para a pinça de biópsia que pode vão além da câmera de vídeo para beliscar fora de uma área de 3-5 milímetro da superfície interna "pele" ou camada mucosa do cólon para nos dar uma amostra da biópsia. A pinça de biópsia também pode ser usado para remover potencialmente pré-cancerosas pólipos encontrados no cólon.
2. Obtivemos biópsias de cólon normal de tecidos de mucosa de pacientes, com o consentimento informado. Esses pacientes foram submetidos a uma colonoscopia em uma clínica gastrointestinal. Nosso biópsias foram colocados em frascos de formol. Após 4 horas, o formol foi substituído por álcool 70%.
3. Amostras semelhantes de tecido foram retiradas de áreas de ressecções do cólon, removido durante a cirurgia, que foi de 1 cm e 10 cm de distância do câncer de cólon ou adenomas avançados com neoplasia. Estas amostras de tecido foram colocados em formol, e se as amostras de tecido foram grandes, alguns foram mantidos em formalina, por um longo período antes de serem colocados em álcool 70%.
4. As amostras de tecido são levados para um laboratório de histologia para ser processado e colocado em blocos de parafina.
5. Blocos de parafina são refrigerados no frigorífico para torná-los mais facilmente cortado por um micrótomo.
6. Cortes de tecido de 4 de espessura micron são cortados a partir dos blocos de tecidos, utilizando um micrótomo, e flutuou sobre a água.
7. Para comparar a expressão de duas proteínas, por exemplo ERCC1 e PMS2, cortes de tecido alternativo pode ser pego em dois slides, até há três cortes de tecido em cada uma das duas lâminas. Por exemplo, seções 1, 3 e 5 pode ser colocado em uma lâmina rotulados ERCC1 e seções 2, 4 e 6 pode ser colocado em uma lâmina rotulados PMS2. Com três cortes de tecido histoquímica para uma proteína em um único slide pode permitir que você veja se um padrão de coloração incomum de uma cripta é um artefato ou é real, já que os artefatos não seria repetido em mais de uma secção de tecido em um slide. Criptas do cólon são cerca de 60 mícrons de diâmetro, de modo que cerca de 15 secções de tecido pode ser cortado por meio de uma cripta, ea cripta mesmo poderia ser visto em várias secções de tecido por slide.

Imunocoloração secções de tecido

1. Os slides são então colocados através do procedimento de imunohistoquímica. Este é um procedimento de oito horas, e é bastante normal. As peças do procedimento que usamos, que não são normais, são o uso de recipientes Sequenza para a coloração, eo uso de uma solução para reduzir a coloração de fundo chamado de "Sniper". O "Sniper" solução é vendida como uma fórmula patenteada pela Biocare Medical, Concord CA.
2. Alguns dos passos dos nossos procedimentos são mostrados aqui.
3. Como exemplo, para PMS2 imunohistoquímica, as lâminas são primeiro desparafinizadas colocando em 3 mudanças de xileno (3 minutos cada), seguidos por 2 mudanças em etanol 100% (2 minutos cada), seguidos por 2 mudanças em etanol 95% (2 minutos cada), seguidos de 2 mudanças de água destilada (2 minutos cada). Estes procedimentos são realizados sob um capuz químico com pressão negativa, para que o pesquisador não é exposto aos vapores.
4. Quando formol foi inicialmente utilizada para fixar o tecido, peças das proteínas na amostra de tecido tornou-se cross-linked. Agora, precisamos quebrar as ligações cruzadas de modo que um anticorpo capaz de reconhecer a proteína de interesse. Os slides são colocados em uma solução tampão que é trazido a uma fervura em forno de microondas. Isso é seguido por 10 minutos na configuração média, seguido de resfriamento por 20 minutos no gelo. Esta etapa precisa ser testado e ajustado para micro-ondas diferentes, até que bons resultados são alcançados. Note-se que para a imunocoloração CCOI ou Ku86 usamos um tampão citrato de sódio feito com ácido cítrico 9ml + citrato de sódio 41mL + 450ml H ₂ O (incluindo um buffer de íons de sódio), que tinha um pH de cerca de 6.0, para ERCC1 usamos um tampão citrato feitas com ácido cítrico 2.1g + 1 litro H ₂ O + ~ 5mL de hidróxido de sódio para trazer o pH para 6,1 (um buffer com o mínimo de íons de sódio adicionado), e para PMS2 usamos uma solução feita com uma solução de 5 mL Antígeno Unmasking (por VECTOR) + 533mL H ₂ O. Buffers diferentes são necessários para aumentar a interação de anticorpos com epítopos de proteína particular.
5. Os slides são então colocados em peróxido de hidrogênio 3% (diluída em metanol) por 20 minutos seguido por uma lavagem em água destilada por 3 minutos, e lavadas em tampão fosfato (chamado PBS) por 5 minutos.
6. Slides são então colocados em flat racks coloração estreito chamado Sequenza (Shandon Sistema de imunocoloração Sequenza Thermo Scientific) e lavados com PBS.
7. Os slides sendo histoquímica para ERCC1 ou PMS2 são expostos então a 10 minutes exposição a um tratamento adicional de 3 gotas de uma solução proprietária, obtido a partir Biocare, chamado de "Sniper" que atua para reduzir a coloração não específica de proteínas de fundo.
8. Os slides são lavados com um buffer "TBST", que é de 1 ml + 100 ml Tween 10x Tris + 900 ml de água destilada [onde Tris 10x é 24,2 gramas Trizma + 80 gramas NaCl + 1000 ml de água destilada e deionizada + HCl concentrado (cerca de 15 ml) para trazer a solução para pH 7,6].
9. Slides são então lavadas três vezes com tampão, e 100 microlitros de DAKO anticorpo secundário biotinilado na diluição 1:100 (em 2% albumina bovina composta em tampão TBST) é adicionado aos slides e incubado por 30 minutos em temperatura ambiente.
10. Neste ponto, Vectastain ABC (Avidin Biotina Complexo) (a partir Vector Laboratories) reagente é preparado, usando 2,5 ml de PBS, uma solução de queda A, 1 B solução drop, ea solução é deixada em repouso por 30 minutos.
11. As lâminas são lavadas 3 vezes com tampão TBST.
12. Em seguida, 3 gotas de reagente Vectastain ABC é adicionado e as lâminas são incubadas em temperatura ambiente por 30 minutos, seguido de lavagem 2 vezes com TBST.
13. Slides são, então, imerso em DAB (diamino-benzamida) (2,9 ml DAB + 400 + 250 microlitros PBS o peróxido de hidrogênio microlitros) por cerca de 5 minutos.
14. Slides são então lavados duas vezes com água destilada deionizada.
15. Contracoloração é feito com uma solução diluída de hematoxilina por 10 segundos. Slides são lavados cuidadosamente em água da torneira, seguida de água deionizada.
16. Slides são então desidratado 2 vezes por 2 minutos em etanol 95%, 2 vezes por 2 minutos em etanol 100% e 2 vezes por 2 minutos em xileno.
17. Um par de gotas de Cytoseal XYL (Richard Allan-Científica) são então adicionados aos slides e uma lamela aplicada.
18. Avaliação imunohistoquímica de ERCC1, Ku86 e CCOI são realizadas usando o mesmo protocolo para PMS2, mas substituindo o anticorpo PMS2 com anticorpos para ERCC1, Ku86 e CCOI descritos na tabela abaixo.

Avaliar cortes de tecidos para criptas deficiente na expressão de ERCC1, PMS2, Ku86 e CCOI

1. Vamos primeiro olhar para cortes de tecidos sob um fotomicroscópio (DM-BA300) Motic à manifestação de PMS2 e ERCC1 em criptas da mucosa do cólon.
2. PMS2 e ERCC1 são enzimas de reparo de DNA, e assim eles estão localizados onde o DNA é, no núcleo das células das criptas. Isto é indicado na Figura 1, onde os dois pontos marrons representam coloração para ERCC1, ocorre no núcleo das células em uma cripta. A cripta normal, primeiro show no microscópio estava manchada de ERCC1, ea mancha marrom mostra a localização dos ERCC1. Destacam-se os tipos de células nas criptas, onde "células caliciformes" são forma semelhante a uma taça de vinho, com núcleos em uma pequena região na base das células na borda exterior da cripta, e um balão para fora seção, repletas de grânulos de mucina branco na parte da célula no interior da cripta. Os outros dois tipos de células olhar um pouco parecidos em nossos cortes corados, e eles são os enterócitos e células enteroendócrinas, e seus núcleos também estão na borda exterior da cripta, na base das células. Em biópsias de pacientes que nunca tiveram uma neoplasia do cólon, ou em biópsias longe de qualquer local do câncer de cólon, quase todos os núcleos em todas as criptas mostrar alto nível normal de expressão de ERCC1 como mostrado aqui.
3. Para orientar nossas observações, cortes de tecidos obtidos de biópsias de pacientes com neoplasia do cólon não são observados os níveis de expressão de PMS2, ERCC1, CCOI ou Ku86 na mucosa do cólon normal. Podemos observar todas as criptas em uma secção de tecido normal, com uma lente objetiva de 40x, como nós lentamente passar por uma secção de tecido inteiro e apontar as criptas, as células intersticiais, qualquer nódulos linfóides no slide, e os muscularis (se houver na biópsia).
4. Destacamos ainda, que há apenas várias células na base da cripta, que são as células-tronco. Essas células-tronco geram todos os cerca de 2.000 células da cripta completa. Uma célula-tronco com uma mutação ou um epimutation pode assumir o nicho inteiro com células-tronco. Em seguida, a cripta todo pode ter alterado a coloração de uma enzima de interesse (conversão crypt) como mostramos neste novo slide onde vemos criptas todo deficiente para CCOI ao lado de criptas que têm alta expressão de CCOI.
5. Então, vamos mostrar um slide de uma paciente com câncer de cólon ou um adenoma com neoplasia avançada. Neste slide, algumas criptas têm elevado nível normal de expressão para ERCC1 e alguns têm níveis mais baixos de expressão. Todas as criptas dentro da secção de tecido são fotografados em baixa resolução com uma lente objetiva de 10x, e as imagens são revestidas de modo que a secção de tecido inteiro é visto em uma imagem. As criptas são então numerados.
6. As criptas com alta expressão da enzima, típico de criptas em biópsias longe from qualquer tipo de câncer, são chamados de coloração nível "4". Outros níveis são "0" se não existe uma expressão detectável, "1" se a expressão apenas mal detectável é evidente, "2" se houver um presente de expressão, mas a um nível muito mais baixo do que o nível 4, e "3" se a expressão é presentes em um nível inferior a 4, mas bastante forte. Nós dot cada slide sobre o azul de baixa resolução de imagem para quatro, laranja verde para 3, amarelo para 2, para 1 e vermelho para 0. Aqui nós mostramos passando por uma seção de uma biópsia usando uma lente objetiva de 40x. Nós dot criptas na imagem de baixa resolução.

Figura 1. A cripta do cólon mostrando alta expressão de ERCC1 nos núcleos das células da cripta. Todas as cores nesta imagem foram igualmente reforçada em contraste e saturação, usando o Paint Shop Pro 5.

Resultados representante

1. As secções de tecido alternativo em slides separados permitem-nos olhar para as criptas mesmo do cólon, com expressão de duas proteínas diferentes demonstrado por imunohistoquímica. A imagem de uma cripta para PMS2 manchado e manchado a cripta mesmo para ERCC1 é mostrado em microscópios adjacentes com monitores de computador adjacentes. Isso nos permite determinar se há carência conjunta de duas proteínas, ou se as deficiências em cada uma das proteínas, enquanto cada um é freqüente, ocorre de forma independente. Temos três cortes de tecido por lâmina, de modo que qualquer deficiência aparente na expressão de uma proteína pode ser verificado como sendo deficiente em mais de uma seção, e não devido a um artefato. Em tecidos circundantes cancros do cólon, onde há um defeito de campo que deu origem ao câncer, há uma alta freqüência de criptas deficiente para ERCC1 e PMS2.
2. Temos também utilizado imunohistoquímica para encontrar a frequência das criptas para deficientes Ku86 e CCOI. Neste slide, passamos por uma secção de tecido toda histoquímica para Ku86, usando uma lente objetiva de 40x, e podemos ver que algumas criptas são deficientes para Ku86 nesta seção tecido.
3. Da mesma forma, neste slide, passamos por uma secção de tecido toda histoquímica para CCOI, usando uma lente objetiva de 40x, e podemos ver que apenas um número moderado de criptas são deficientes para CCOI.

Discussão

1. É muito importante ter três cortes de tecido por slide. Bolhas pode ocorrer quando se aplica a mídia carregando o anticorpo, de modo que algumas criptas ou porções de criptas não pode ser manchada adequadamente só porque uma bolha impediu o anticorpo de reagir com a secção de tecido. Criptas são cerca de 60 mícrons de diâmetro, e secções de tecido são 4 mícrons de espessura, de modo que poderia haver até 15 cortes de tecidos através da cripta mesmo. Geralmente é possível encontrar a cripta mesmo, usando a morfologia da cripta como um guia, em cortes de tecidos múltiplos posicionados em um slide.
2. Em nossos estudos recentes, para amostras de tecido de grande porte, coloração em um Sequenza não pode dar cobertura de anticorpos bom para o tecido. Nestes casos, pode-se preferir usar mão coloração do tecido, onde uma gota de mídia contendo o anticorpo é mão colocada sobre cada amostra de tecido.
3. Para ver claramente a coloração marrom mostrando a expressão da proteína imunocoradas, ea coloração azul mostrando DNA nuclear no monitor do computador, o software fotomicroscópio Motic é ajustado como segue: Ganho 0, offset 0, Enhance 0, 255, Gamma 1,00, 0, nitidez 1, Correção de Cor 7, R, G, B Ganho 1,00, e R, G, B Brilho 0. A resolução é de 1024 x 768, e Balanço de Branco está ativado.
4. Nosso método pode ser usado com qualquer proteína que parecem ser importantes na progressão para o câncer de cólon, para avaliar a sua freqüência de deficiência, ou possivelmente superexpressão, nos defeitos de campo em torno cancros do cólon ou adenomas avançados com neoplasia.
   
   
5. Defeitos de campo são uma parte da progressão para o câncer
   A "cancerização de campo" termo foi usado pela primeira vez por Slaughter et al. Em 1953 para descrever ^uma área ou um "campo" do epitélio que tem sido pré-condicionado por processos em grande parte desconhecido (na época), de modo a predispô-lo para o desenvolvimento de câncer. O uso inicial foi no contexto de câncer oral. Desde então, os termos "cancerização de campo" e "defeito no campo" têm sido utilizados mais amplamente para descrever qualquer tecido pré-malignas em que novos cancros são mais susceptíveis de surgir, eo conceito de cancerização de campo na área da oncologia clínica tem recebido atenção crescente ² . Recentemente, revisamos as evidências de defeitos de campo em câncer gastrointestinal ^3. Incluídos nesta revisão foram os resultados de uma dezena de estudos comprovando os defeitos de campo no cólon.
   
   Defeitos de campo na mucosa do cólon, provavelmente, surgir por seleção natural de células mutantes ou células alteradas epigeneticamente entre as células-tronco de uma cripta de tal forma que uma célula-tronco sobrevive ⁴ sucessão de nicho. Instabilidade genética ou um fenótipo mutator, talvez devido à redução de reparo de DNA por excisão de nucleotídeos ou de reparo do DNA mismatch, aceleraria esse processo (e um defeito freqüente em PMS2 foi relatado anteriormente em áreas circunvizinhas cancros do cólon ^5). Se, em uma população normal de células-tronco na mucosa do cólon, uma célula adquire uma vantagem seletiva através de uma mutação ou uma epimutation, ele tenderá a expandir clonalmente à custa de células-tronco vizinhos. Na mucosa do cólon, o nicho de células-tronco é ocupada por ≤ 5 ⁶ células que depois dão origem a todos (aproximadamente 2000), as células da cripta. A tomada de controlo do nicho de células-tronco por uma célula mutante ou resultados epigeneticamente alteradas digite "conversão crypt" ^7.
   
   A disseminação de clones mutantes (criptas convertidos) no epitélio do cólon podem ocorrem mais freqüentemente por fissão cripta ^8. Um exemplo de fissão cripta é mostrado na Figura 2. Desta forma, um pedaço de tecido anormal surge. Dentro como um remendo, uma segunda mutação tal pode ocorrer de forma que uma cripta dado adquire uma vantagem em comparação com outras criptas dentro do patch, e esta irá expandir cripta clonal formando uma mancha secundária dentro do patch original. Dentro desse novo patch, o processo pode ser repetido mais tempo de várias, talvez durante décadas, até que uma célula-tronco malignas que surge clonalmente expande para um câncer. Se este é o processo geral pelo qual adenocarcinomas do cólon esporádicos surgem, então adenocarcinomas do cólon geralmente deve ser associada, e ser precedido por, os campos de anormalidade. Assim, um pedaço de criptas convertido seria de esperar para ter defeitos perceptíveis na área em torno de um adenoma com neoplasia avançada, ou em torno de um câncer de cólon.
   
   A partir desse modelo de pré-tumor progressão, seria de esperar para encontrar alterações genéticas ou epigenéticas relacionadas à pré-tumor progressão entre amostras de tecido retiradas da mucosa não-neoplásica do cólon em áreas circunvizinhas lesões neoplásicas do cólon que são susceptíveis de evoluir para o câncer . Em particular, defeitos em enzimas de reparo de DNA, ou em proteínas necessárias para a apoptose, contribuiria para a progressão, aumentando a instabilidade genômica, e pode vir a ser encontrados em um campo com defeito.
6. Seleção para a deficiência na PMS2 quando as células são deficient para ERCC1 e submetido a um agente de danificar o DNA
   Nara et al. ⁹ cresceu 25 culturas de células de ovário de hamster chinês 43-3B, todos com uma mutação inativadora do gene de reparo do DNA ERCC1, e as culturas tratadas com um agente de danificar o DNA, MNNG. Entre as células sobreviventes ao tratamento de danos ao DNA, uma única célula foi isolado de cada cultura e permissão para formar um clone. Todos os clones foram isolados cerca de 10 vezes mais resistentes à morte por MNNG do que a cepa parental. Dos clones isolados, 22 foram provado ser defeituoso em reparo de DNA mismatch (MMR). Cinco destes 22 clones foram testados por seqüenciamento, e três dos cinco eram deficientes para PMS2. Esta seleção de defeito em PMS2 foi presumivelmente porque PMS2 deficiência causada resistência a apoptose e, portanto, capacidade de sobreviver a danos no DNA em células restantes adicionado quando ERCC1 estava ausente. (Normalmente, PMS2 sentidos níveis de dano de DNA, e faz com que as células em apoptose, quando o dano ao DNA é excessivo.) Assim, uma deficiência em PMS2 é selecionado para quando ERCC1 deficiente células estão sujeitas a danos no DNA. Clones defeituosos em ambos os ERCC1 e PMS2 foram mostrados para ter cerca de uma taxa de mutação 500-1000 vezes maior quando irradiada com UV do que as células dos pais.
   
   
7. Ácidos biliares causam estresse oxidativo, são agentes de danificar o DNA e são importantes para a progressão para o câncer de cólon
   Ácido deoxicólico, um ácido biliar, aumenta o estresse oxidativo através da geração de espécies reativas de oxigênio (ROS) por vários processos, incluindo danos de ¹⁰ mitocôndria. Há evidências recentes de que ROS causar alterações epigenéticas ^11, e pelo menos 15 estudos têm mostrado que os ácidos biliares, aumento nas concentrações que acompanha uma dieta rica em gordura, causam danos ao DNA ^12. Na revisão feita por Bernstein et al. ^12, há uma associação positiva entre consumo de gordura na dieta ea incidência de câncer de cólon. Ácidos biliares são secretados no trato intestinal, em resposta a gordura na dieta e ácidos biliares atuam como detergentes para ajudar na digestão de gorduras. Assim, uma dieta rica em gordura está associada com aumento da secreção de ácidos biliares. Concentrações de ácido biliar fecal são elevados em populações com alta incidência de câncer de cólon e exposição excessiva aos ácidos biliares é considerado como um fator de risco para a carcinogênese de cólon ^13. Ácidos biliares pode ser uma causa de defeitos de campo no cólon.

Figura 2. A fissão cripta do cólon em 3 criptas.

Conclusão

Encontramos uma alta freqüência de criptas deficientes em genes de reparo do DNA e ERCC1 PMS2 (PMS2 também é necessário para apoptose) em defeitos de campo grande em torno cancros do cólon. Deficiências no ERCC1 e PMS2 (devido a mudanças epigenéticas ou mutações) podem ser os primeiros passos na instabilidade genética fundamental para a progressão para o câncer de cólon.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
PMS2 antibody	BD Biosciences	556415
ERCC1 antibody	Thermo Fisher Scientific, Inc.	MS-671-P1
Ku86 antibody	Santa Cruz Biotechnology, Inc.	SC-9034
CcO1 antibody	Invitrogen	459600
Biotinylated secondary	Dako	E0413
22% BSA	Informagen, Inc.	2327
Sniper	Biocare Medical	BS966
Vectastain ABC	Vector Laboratories	PK-6100
DAB	Thermo Fisher Scientific, Inc.	34001
Tween 20	USB Corp., Affymetrix	20605
Cytoseal XYL	VWR international	48212-196
Trizma	Sigma-Aldrich	T1503