Embarque de carga para cinesina Produzido Shuttles Molecular

Resumo

Shuttles molecular composta por microtúbulos funcionalizados deslizando na superfície, aderiram proteínas cinesina motor pode servir como um sistema de transporte em nanoescala. Aqui, a montagem de um sistema de transporte típico é descrito.

Resumo

As células se desenvolveram máquinas moleculares sofisticadas, tais como proteínas cinesina motor e filamentos de microtúbulos, para apoiar o transporte intracelular ativa da carga. Enquanto kinesins cauda domínio liga-se a uma variedade de cargas, domínios kinesins cabeça utilizar a energia química armazenada em moléculas de ATP para a etapa ao longo da rede de microtúbulos. A longa e dura microtúbulos servem como pistas para transporte de longa distância intracelular.

Estes motores e filamentos também podem ser empregadas em ambientes sintéticos microfabricated como componentes de ônibus molecular ^1. Em um design freqüentemente usados, motores de cinesina estão ancorados à superfície da pista através de suas caudas, e microtúbulos funcionalizados servir como elementos de carga de transporte, que são impulsionadas por esses motores. Estas naves podem ser carregados com a carga, utilizando a ligação forte e seletiva entre biotina e estreptavidina. Os componentes-chave (tubulina biotinilado, estreptavidina e carga biotinilado) estão disponíveis comercialmente.

Baseando-se no ensaio de motilidade clássico invertido ^2, a construção de naves molecular é detalhado aqui. Proteínas cinesina motor são adsorvidas a uma superfície previamente revestidas com caseína; microtúbulos são polimerizados da tubulina biotinilado, aderiu ao cinesina e posteriormente revestido com rodamina-rotulados estreptavidina. A concentração de ATP é mantida a concentração subsaturating para alcançar uma velocidade de deslizamento dos microtúbulos ideal para o carregamento de carga ^3. Finalmente, biotinilado fluoresceína marcado nanoesferas são adicionadas como carga. Nanoesferas anexar aos microtúbulos, como resultado de colisões entre microtúbulos delta e nanoesferas de aderir à superfície.

O protocolo pode ser facilmente modificado para carregar uma variedade de mercadorias como o DNA biotinilado ^{4, 5} ou pontos quânticos de uma grande variedade de antígenos através de anticorpos biotinilados ^4-6.

Protocolo

1.) Buffers e Reagentes

Estas soluções devem ser preparadas com antecedência e armazenado em alíquotas de tamanho conveniente. Uma alíquota deve conter solução suficiente para uma experiência típica e uma nova porção deve ser utilizado para cada ensaio motilidade. As condições de armazenamento e tamanhos alíquota típicos também são mencionados nos protocolos a seguir.

1. BRB80 buffer, (80 TUBOS mM, 1 mM MgCl _2, 1 mM EGTA em destilada deionizada (dd) de água, pH ajustado para 6,9 por KOH)

• Compõem uma solução estoque 100 mL de 0,5 M EGTA em água dd. Ajustar o pH para 7,0 usando solução de NaOH 2 M.
• Make up de 100 mL de solução estoque 1 M MgCl ₂ em água dd. Autoclave a solução.
• Adicionar 24,2 g de tubos e pellets 3,1 g KOH em cerca de 800 mL de água dd e mexa até dissolver. Ajustar o pH para 6,9 utilizando solução 1 M KOH. Adicione 2 mL da solução estoque 0,5 M EGTA e 1 mL da solução estoque 1 M MgCl _2. Aumentar o volume para 1000 mL com água dd.
• Alíquota em 50 tubos falcon mL e congelar a -20 ° C para uso futuro. O tubo BRB80 sendo usados ​​podem ser armazenados a 4 ° C ou à temperatura ambiente.

2. Cloreto de magnésio, MgCl ₂ (100 mM em água dd)

• Diluir em água dd para alcançar uma concentração final de 100 mM.
• Alíquota (10 mL de volume) em 0,5 mL tubos de microcentrífuga e armazenar a -20 ° C para uso futuro

3. Guanosina-5'-trifosfato, sal dissódico, GTP (25 mM em água dd, pH ajustado para 7 por NaOH)

• Pesar e dissolver em água dd e ajustar o pH a 7 por 2 NaOH M.
• Verificar a concentração através da medição de absorbância UV a 260 nm. (Use um coeficiente de extinção de 11,7 M 103 x ^-1 cm ^-1).
• Alíquota (10 mL de volume) em 0,5 mL tubos de microcentrífuga e armazenar a -20 ° C para uso futuro.

4. Dimetilsulfóxido, DMSO

• Alíquota (10 mL de volume) em 0,5 mL tubos de microcentrífuga e armazenar a -20 ° C para uso futuro.

5. Taxol (1 mM em DMSO)

• Pesar e dissolver em DMSO sob exaustor para alcançar uma concentração final de 1 mM.
• Alíquota (20 mL de volume) em 0,5 mL tubos de microcentrífuga e armazenar a -20 ° C para uso futuro.

6. D-(+)-glicose, (2 M em água dd)

• Pesar e dissolver em água dd para alcançar uma concentração final de 2 M.
• Alíquota (20 mL de volume) em 0,5 mL tubos de microcentrífuga e armazenar a -20 ° C para uso futuro.

7. Glicose oxidase, (2 mg / mL em BRB80)

• Dissolver em BRB80 para alcançar uma concentração final de 2 mg / mL.
• Alíquota (20 mL de volume) em 0,5 mL tubos de microcentrífuga e armazenar a -20 ° C para uso futuro.

8. Ditiotreitol, TDT (1 M em água dd)

• Se dissolvem em água dd sob exaustor para alcançar uma concentração final de 1 M.
• Alíquota (20 mL de volume) em 0,5 mL tubos de microcentrífuga e armazenar a -20 ° C para uso futuro.

9. Catalase, (0,8 mg / mL em BRB80)

• Dissolver em BRB80 em pelo menos duas etapas para alcançar uma concentração final de 0,8 mg / mL. Determinar a concentração em cada etapa de medição de absorbância UV em 276 nm e 406 nm (Use um coeficiente de extinção de 3,1 x 10 ⁵ M ^-1 cm ^-1 a 276 nm e 2,2 x 10 ⁵ M ^-1 cm ^-1 em 406 nm e a equação A = cL).
• Alíquota (20 mL de volume) em 0,5 mL tubos de microcentrífuga e armazenar a -20 ° C para uso futuro.

10. Adenosina-5'-trifosfato, ATP (100 mM MgCl em 100mM ₂₎

• Prepare uma solução estoque de 100 mM MgCl ₂ em água dd. Pesar de pó seco e dissolver nesta solução estoque para alcançar uma concentração final de 100mM.
• Verificar a concentração através da medição de absorbância UV a 260 nm. (Use um coeficiente de extinção de 15,4 x ³ M 10 ^-1 cm ^-1).
• Alíquota (20 mL de volume) em 0,5 mL tubos de microcentrífuga e armazenar a -20 ° C para uso futuro.

11. Caseína solução (20 mg / mL de caseína em BRB80)

• Adicionar cerca de 3 g de caseína a 30 mL de água dd em um tubo falcon 50 mL. Vortex por cerca de uma hora até que a solução se desenvolve consistência espessa.
• Centrifugar a aproximadamente 15.000 g por 30 minutos. Filtrar o sobrenadante com 0,5 m e 0,2 mM filtros seringa.
• Determinar a concentração do sobrenadante através da medição de absorbância UV a 280 nm (Use um coeficiente de extinção de 0,67 mL cm ^-1 mg ^-1). Diluir a 20 mg / mL em BRB80.
• Alíquota (20 mL de volume) empara 0,5 mL tubos de microcentrífuga e armazenar a -20 ° C para uso futuro.

2.) Standard Solutions

Estes são preparados no dia do experimento e deve ser descartado após o experimento acaba. Prepare 1 mL de cada um.

1. BRB80CS0.5

• Diluir caseína solução em BRB80 para uma concentração final de 0,5 mg / mL e armazenar com gelo. Esta solução é introduzida na célula de fluxo antes de cinesina e ajuda a manter a atividade kinesin depois superfície de adsorção.

2. BRB80CA

• Prepare 0,2 mg / mL de caseína e 1 mM de ATP em BRB80 e armazenar com gelo. Cinesina é mais diluída usando esta solução antes da sua introdução na célula de fluxo.

3. BRB80T

• Solução diluída de taxol em BRB80 para uma concentração final de 10 mM e armazenar em temperatura ambiente. Esta solução é utilizada para estabilizar os microtúbulos.

4. BRB80CT

• Prepare taxol 10 mM e 0,2 mg / mL de caseína em BRB80 e armazenar em temperatura ambiente. Isto é usado para preparar melhor a Antifade e soluções de microtúbulos.

5. BRB80AF

• Prepare 20 mM D-glucose, glicose oxidase 20 mcg / ml, 8 mcg / mL catalase, 10 mM DTT e 20 mM ATP em BRB80CT e armazenar em temperatura ambiente. Esta solução é utilizada para diluir estreptavidina e nanoesferas e "lavar" a estreptavidina em excesso na célula de fluxo. A velocidade kinesin pode ser controlado, ajustando a concentração de ATP nesta solução.

3.) Preparação cinesina

• Expressar uma cinesina construir consiste na wild-type full-length Drosophila, melanogaster cadeia kinesin pesado e um C-terminal Sua tag-in Escherichia coli e purificar usando uma coluna Ni-NTA, conforme descrito em ^6.
• Faça alíquotas (10 mL cada) em 0,5 mL tubos de microcentrífuga e armazenar a -80 ° C para uso futuro. A concentração de cinesina activa nestes alíquotas é de aproximadamente 200 nM. ⁷
• Para uma experiência típica, diluir a solução kinesin 20 vezes em BRB80CA. Rotular o KIN20 solução e armazenar mais gelo.

4.) Preparação dos Microtúbulos

• Em um tubo de microcentrífuga de 0,5 mL, preparar 25 mL de solução de crescimento: 4 mM MgCl _2, 1 mM GTP e DMSO 5% (v / v) em BRB80 buffer.
• Adicionar 6,25 mL desta solução para uma alíquota de 20 mg de tubulina biotinilado liofilizado.
• Vortex, coloque em seguida em um banho térmico a 37 ° C durante 30 minutos para polimerização. Diluir 100 vezes em BRB80T e vortex suavemente. Rotular o MT100 solução e armazenar à temperatura ambiente.
• Obter uma diluição de 10 vezes da MT100 em BRB80AF. Rotular o MT1000 solução.

5.) Solução Estreptavidina e Nanosphere

Prepare AlexaFluor568 marcado estreptavidina em uma concentração de 100 nM em BRB80AF. Rotulá-la STV100 e armazenar com gelo. Da mesma forma, diluir nanoesferas 5000 vezes em solução BRB80AF. Rotulá-la NS5000 e armazenar com gelo.

6.) Construção célula de fluxo

Construir uma célula de fluxo usando duas lamínulas de vidro separadas por fita dupla face. Esta célula de fluxo é de aproximadamente 2 cm de comprimento, 1 cm de largura e 100 mm de alta, e tem um volume de aproximadamente 20 mL. Soluções são introduzidos na célula de fluxo de um lado com uma pipeta e fora maus do outro usando papel de filtro.

7.) Assembléia Assay invertido

Superfície de vidro é primeiro revestido com caseína que permite kinesin para manter a sua funcionalidade em cima de adsorção. Depois de cinesina é adsorvido, os microtúbulos são introduzidas, que são detidos por cinesina. Microtúbulos são então revestidas com estreptavidina fluorescente. Depois de lavar o excesso de estreptavidina, biotinilado poliestireno fluoresceína nanoesferas (40 nm de diâmetro) são introduzidos. Superfície adsorvido nanoesferas estacionária colidem com os microtúbulos em movimento e são carregados para eles (Figura 1).

A ordem do fluxo de soluções e tempo permitido antes da introdução da próxima solução estão listados abaixo.

• BRB80CS0.5, a 5 minutos
• KIN20, a 5 minutos
• MT1000, a 5 minutos
• STV100, a 5 minutos
• BRB80AF, 3x
• NS5000

8.) Microscopia

Montar a célula de fluxo no palco microscópio imediatamente após a introdução nanosphere. Neste experimento, um Eclipse TE2000-U microscópio de fluorescência (Nikon, Melville, NY) equipado com um objetivo de petróleo 100X (NA 1,45), um X-cite 120 lâmpada (EXFO, Ontario, Canadá) e uma ixon EMCCD câmera (ANDOR, South Windsor, CT) foi utilizado. Um filtro FITC cubo (# 48001) e um cubo de filtro TRITC (# 48002, Chroma Technologies, Rockingham, VT) foram usados ​​para nanoesferas imagem e respecti microtúbulosvely sobre a superfície inferior das células de fluxo. O tempo de exposição foi 0.2s, enquanto o tempo entre as exposições foi de 2 s.

Figura 1. Desenho esquemático do ônibus molecular.

Discussão

Com pequenas modificações, este protocolo tem sido usado com sucesso por uma variedade de grupos para montar kinesin microtúbulos ensaios motilidade base. 10 mM DTT na solução motilidade final pode ser substituído por 0,5% β-mercaptoetanol. Soluções padrão (BRB80AF, KIN20 e MT1000) mais de 2 horas de idade não deve ser utilizado. Qualquer solução contendo microtúbulos taxol e, especialmente, nunca deve ser colocado no gelo. Exposição excessiva da célula de fluxo com os resultados de excitação de luz U...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adenosine-5’-triphosphate (ATP)	Invitrogen	A1049
Biotin tubulin	Cytoskeleton, Inc.	T333
Casein	Sigma-Aldrich	C-0376
Catalase	Sigma-Aldrich	C-9322
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G-7528
Dimethylsulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D-8779
Dithiotreitol (DTT)	Bio-Rad	161-0610
Ethylene glycol-bis(2-amin–thylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA)	Sigma-Aldrich	E-4378
FluoSpheres Biotinylated microspheres, 40 nm, yellow-green fluorescent (505/515)	Invitrogen	F-8766
Glucose oxidase	Sigma-Aldrich	G-7016
Guanosine-5’-triphosphate (GTP)	Roche Group	106399
Magnesium Chloride (MgCl2)	Sigma-Aldrich	63069
Paclitaxel (Taxol)	Sigma-Aldrich	T1912
1,4-Piperazinediethanesulfonic acid, Piperazine-1,4-bis(2-ethanesulfonic acid), Piperazine-N,N′-bis(2-ethanesulfonic acid) (PIPES)	Sigma-Aldrich	P-6757
Potassium hydroxide (KOH)	Sigma-Aldrich	P-6310
Sodium hydroxide (NaOH)	Sigma-Aldrich	480878
Streptavidin Alexa Fluor 568 conjugate	Invitrogen	S11226