Погрузка на грузовые кинезин Powered молекулярной Автобусы

Резюме

Молекулярные челноки, состоящий из микротрубочек функционализированных скользит по поверхности, придерживался кинезин моторных белков могут служить в качестве наноразмерных транспортной системы. Здесь, сборка типичной системе трансфер описывается.

Аннотация

Клетки развивались сложные молекулярные машины, такие как кинезин моторных белков микротрубочек и нитей, для поддержки активного внутриклеточного транспорта грузов. Хотя кинезины хвост домен связывается с различными грузами, домены кинезины голову использовать химическую энергию, запасенную в молекулах АТФ, чтобы шаг по микротрубочек решетки. Длинные, жесткие микротрубочки служат треков для дальних внутриклеточного транспорта.

Эти двигатели и нити могут быть также использованы в microfabricated синтетических средах в качестве компонентов молекулярных челноков ^1. В часто используемых дизайн, кинезин двигатели крепятся к поверхности трассы через их хвосты, и функциональных микротрубочки служат в качестве груза несущих элементов, которые в движение с помощью этих двигателей. Эти челноки могут быть загружены с грузом, используя сильное и избирательное связывание между биотином и стрептавидином. Ключевых компонентов (биотинилированного тубулина, стрептавидина и биотинилированного груза) имеются в продаже.

Опираясь на классическое перевернутой анализа подвижности ^2, строительство молекулярные челноки подробно здесь. Кинезин моторных белков адсорбируются на поверхности предварительно нанесенным покрытием с казеина; микротрубочки полимеризуются с биотинилированного тубулина, придерживались кинезин, а затем покрыты родамин-меченого стрептавидином. Концентрации АТФ поддерживается на subsaturating концентрации, чтобы достичь скорости скольжения микротрубочек оптимальным для погрузки груза ^3. Наконец, биотинилированного флуоресцеина меченых наносферы добавляются в качестве груза. Наносфер, придают микротрубочек в результате столкновений между микротрубочек скольжение и наносфер присоединения к поверхности.

Протокол может быть легко изменены, чтобы загружать как различные грузы, такие как ДНК биотинилированного ^4, квантовые точки, ⁵ или разнообразных антигенов с помощью антител биотинилированного ^4-6.

протокол

1.) Буферы и реагенты

Эти решения должны быть подготовлены заранее и хранить в удобной размера порции. Аликвоту должна содержать достаточное решение для типичного эксперимента и свежей аликвоты должна использоваться для каждого моторики анализа. Условий хранения и типичные размеры аликвоту также упоминаются в следующих протоколов.

1. BRB80 буфера (80 мМ ТРУБЫ, 1 мМ MgCl _2, 1 мМ EGTA в деионизированной дистиллированной (день) воды, рН до 6,9 по КОН)

• Макияж 100 мл маточного раствора 0,5 М EGTA в воде дд. Отрегулируйте рН до 7,0 с использованием 2 М NaOH решение.
• Макияж 100 мл исходного раствора 1 М MgCl ₂ в воде дд. Автоклав решение.
• Добавить 24,2 г труб и 3,1 г КОН гранул в приблизительно 800 мл воды, дд и размешать до растворения. Отрегулируйте рН до 6,9 с помощью 1 М КОН решение. Добавьте 2 мл 0,5 М EGTA маточного раствора и 1 мл 1 М MgCl ₂ маточного раствора. Доведите до объема 1000 мл водой дд.
• Алиготе в 50 мл труб сокола и замерзает при -20 ° C для дальнейшего использования. BRB80 трубки в настоящее время используется можно хранить при температуре 4 ° С или при комнатной температуре.

2. Хлорид магния, MgCl ₂ (100 мМ в воде дд)

• Развести в воде дд для достижения конечной концентрации 100 мМ.
• Алиготе (10 мкл) в 0,5 мл труб микроцентрифужных и храните при температуре от -20 ° C для дальнейшего использования

3. Гуанозин-5'-трифосфата, динатриевая соль, ГТФ (25 мМ дд воды, рН до 7, NaOH)

• Взвесьте, и растворяются в воде дд и отрегулировать рН до 7, 2 М раствора NaOH.
• Проверьте концентрацию путем измерения УФ-поглощению при 260 нм. (Использование коэффициента экстинкции 11,7 х 103 М ^-1 см ^-1).
• Алиготе (10 мкл) в 0,5 мл труб микроцентрифужных и храните при температуре от -20 ° C для дальнейшего использования.

4. Диметилсульфоксид, ДМСО

• Алиготе (10 мкл) в 0,5 мл труб микроцентрифужных и храните при температуре от -20 ° C для дальнейшего использования.

5. Таксол (1 мМ в ДМСО)

• Взвесьте, и растворяется в ДМСО под вытяжным шкафом для достижения конечной концентрации 1 мМ.
• Алиготе (20 мкл объема) в 0,5 мл труб микроцентрифужных и храните при температуре от -20 ° C для дальнейшего использования.

6. D-(+)-Глюкоза, (2 М в воде дд)

• Взвесьте, и растворяются в воде дд для достижения конечной концентрации 2 М.
• Алиготе (20 мкл объема) в 0,5 мл труб микроцентрифужных и храните при температуре от -20 ° C для дальнейшего использования.

7. Глюкозооксидазы, (2 мг / мл в BRB80)

• Растворите в BRB80 для достижения конечной концентрации 2 мг / мл.
• Алиготе (20 мкл объема) в 0,5 мл труб микроцентрифужных и храните при температуре от -20 ° C для дальнейшего использования.

8. Дитиотреитола, DVB-T (1 М дд воды)

• Растворите в воде дд под вытяжным шкафом для достижения конечной концентрации 1 М.
• Алиготе (20 мкл объема) в 0,5 мл труб микроцентрифужных и храните при температуре от -20 ° C для дальнейшего использования.

9. Каталазы, (0,8 мг / мл в BRB80)

• Растворите в BRB80 по крайней мере в 2 этапа для достижения конечной концентрации 0,8 мг / мл. Определить концентрацию на каждом этапе путем измерения УФ-поглощению при 276 нм и 406 нм (Использование коэффициента экстинкции 3,1 · 10 ⁵ М ^-1 см ^-1 при 276 нм и 2,2 х 10 ⁵ М ^-1 см ^-1 при 406 нм и Уравнение = Cl).
• Алиготе (20 мкл объема) в 0,5 мл труб микроцентрифужных и храните при температуре от -20 ° C для дальнейшего использования.

10. Аденозин-5'-трифосфат, АТФ (100 мМ в 100mM MgCl ₂₎

• Подготовка исходного раствора 100 мМ MgCl ₂ в воде дд. Взвесьте из сухой порошок и растворить в этой акции решением для достижения конечной концентрации 100 мм.
• Проверьте концентрацию путем измерения УФ-поглощению при 260 нм. (Использование коэффициента экстинкции 15,4 х 10 ³ М ^-1 см ^-1).
• Алиготе (20 мкл объема) в 0,5 мл труб микроцентрифужных и храните при температуре от -20 ° C для дальнейшего использования.

11. Казеин раствор (20 мг / мл казеина в BRB80)

• Добавьте примерно 3 г казеина в 30 мл воды в дд 50 мл трубки сокола. Vortex в течение примерно 1 час, пока решение развивает густую консистенцию.
• Центрифуга примерно в 15000 г в течение 30 минут. Фильтры супернатанта через 0,5 мкм и 0,2 мкм фильтры шприц.
• Определить концентрацию супернатанта путем измерения УФ-поглощению при 280 нм (Использование коэффициента экстинкции 0,67 мл мг ^-1 см ^-1). Развести ее до 20 мг / мл в BRB80.
• Алиготе (20 мкл объема) вдо 0,5 мл микроцентрифужных труб и хранить при -20 ° C для дальнейшего использования.

2.) Типовые Решения

Они подготовлены на день эксперимента и должен быть уничтожен после того, эксперимент завершен. Подготовка 1 мл каждая.

1. BRB80CS0.5

• Развести казеин решение в BRB80 до конечной концентрации 0,5 мг / мл и хранят на льду. Данное решение вводится в проточной ячейке до кинезин и помогает сохранить кинезин деятельность после поверхностной адсорбции.

2. BRB80CA

• Подготовка 0,2 мг / мл, казеина и 1 мМ АТФ в BRB80 и хранить на льду. Кинезин далее разбавляется с помощью этого решения до вступления в потоке клеток.

3. BRB80T

• Развести таксола решение в BRB80 в конечной концентрации 10 мкМ и хранить при комнатной температуре. Это решение используется для стабилизации микротрубочек.

4. BRB80CT

• Подготовка 10 таксола мкМ и 0,2 мг / мл казеина в BRB80 и хранить при комнатной температуре. Это используется для дальнейшей подготовки antifade и микротрубочек решений.

5. BRB80AF

• Подготовка 20 мМ D-глюкозы, 20 мкг / мл глюкозооксидазы, 8 мкг / мл каталазы, 10 мМ DTT, и 20 мкМ АТФ в BRB80CT и хранить при комнатной температуре. Это решение используется для разбавления стрептавидином и наносферы и "вымывание" избыток стрептавидином в потоке клеток. Скорость кинезин можно управлять, регулируя концентрацию АТФ в этом растворе.

3.) Кинезин подготовка

• Экспресс кинезин построить состоящий из дикого типа, полнометражные дрозофилы кинезин тяжелой цепи и С-концевой Его-тег в кишечной палочки и очистить использовании Ni-NTA колонке, как описано в ^6.
• Сделать аликвоты (10 мкл каждой) в 0,5 мл микроцентрифужных труб и хранить при температуре -80 ° C для дальнейшего использования. Концентрация активного кинезин в этих аликвоты приблизительно 200 нм. ⁷
• Для типичного эксперимента, развести раствор кинезин 20 раз в BRB80CA. Этикетка KIN20 решение и хранить на льду.

4.) Микротрубочек подготовка

• В трубке микроцентрифужных 0,5 мл, подготовить 25 мкл роста решения: 4 мМ MgCl _2, 1 мМ GTP и 5% ДМСО (об. / об) в BRB80 буфера.
• Добавить 6,25 мкл этого раствора до 20 мкг аликвоту лиофилизированный биотинилированного тубулина.
• Vortex, затем поместить в термостате при температуре 37 ° С в течение 30 минут к полимеризации. Развести в 100 раз в BRB80T и вихревые мягко. Этикетка MT100 решение и хранить при комнатной температуре.
• Сделать 10 раз разбавления MT100 в BRB80AF. Этикетка решение MT1000.

5.) Стрептавидином и наносферы решения

Подготовка AlexaFluor568 меченных стрептавидин в концентрации 100 нМ в BRB80AF. Этикетка это STV100 и хранить на льду. Аналогично, развести наносферы 5000 раз в растворе BRB80AF. Этикетка это NS5000 и хранить на льду.

6.) Расход сотового Строительство

Построить проточной ячейкой с помощью двух стеклянных покровных разделенных двухсторонней ленты. Этот поток ячейки составляет примерно 2 см в длину, 1 см в ширину и 100 мкм, высокая, и имеет объем около 20 мкл. Решения вводятся в проточной ячейке с одной стороны с помощью пипетки и злой из друга с помощью фильтровальной бумаги.

7.) Перевернутый Ассамблеи Пробирной

Стекло поверхность покрыта первым казеин, который позволяет кинезин сохранять свою функциональность при адсорбции. После кинезин адсорбируется, микротрубочки вводятся, которые проводятся по кинезин. Микротрубочки затем покрытые флуоресцентной стрептавидином. После вымывания избыточного стрептавидин, биотинилированного полистирола флуоресцеина наносфер (40 нм в диаметре) вводятся. Поверхность адсорбированных стационарных наносферы столкнуться с движущимся микротрубочек и загружаются на них (рис. 1).

Порядок поток решений и время до введения следующему решению перечислены ниже.

• BRB80CS0.5, 5 минут
• KIN20, 5 минут
• MT1000, 5 минут
• STV100, 5 минут
• BRB80AF, 3x
• NS5000

8.) Микроскопии

Горы проточной ячейки на столике микроскопа сразу же после введения наносферы. В этом эксперименте Затмение TE2000-U флуоресцентного микроскопа (Nikon, Мелвилл, штат Нью-Йорк), оснащенных 100X цель нефти (NA 1,45), X-Cite 120 ламп (EXFO, Онтарио, Канада) и IXON EMCCD камеры (ANDOR, Юг Виндзор, штат Коннектикут) была использована. FITC фильтр куб (# 48001) и TRITC куб фильтра (# 48002, Chroma технологий, Рокингем, VT) были использованы для изображения наносферы и микротрубочки respectiВели на нижней поверхности потока клеток. Время экспозиции 0,2 с, а время между экспозициями было 2 с

Рисунок 1. Схематическое изображение молекулярной челноков.

Обсуждение

С незначительными изменениями этот протокол был успешно используется различными группами, чтобы собрать кинезин-микротрубочек основан анализов подвижности. 10 мМ DTT в окончательном решении моторики может быть заменен на 0,5% β-меркаптоэтанола. Стандартные решения (BRB80AF, KIN20 и MT1000) больше,...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adenosine-5’-triphosphate (ATP)	Invitrogen	A1049
Biotin tubulin	Cytoskeleton, Inc.	T333
Casein	Sigma-Aldrich	C-0376
Catalase	Sigma-Aldrich	C-9322
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G-7528
Dimethylsulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D-8779
Dithiotreitol (DTT)	Bio-Rad	161-0610
Ethylene glycol-bis(2-amin–thylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA)	Sigma-Aldrich	E-4378
FluoSpheres Biotinylated microspheres, 40 nm, yellow-green fluorescent (505/515)	Invitrogen	F-8766
Glucose oxidase	Sigma-Aldrich	G-7016
Guanosine-5’-triphosphate (GTP)	Roche Group	106399
Magnesium Chloride (MgCl2)	Sigma-Aldrich	63069
Paclitaxel (Taxol)	Sigma-Aldrich	T1912
1,4-Piperazinediethanesulfonic acid, Piperazine-1,4-bis(2-ethanesulfonic acid), Piperazine-N,N′-bis(2-ethanesulfonic acid) (PIPES)	Sigma-Aldrich	P-6757
Potassium hydroxide (KOH)	Sigma-Aldrich	P-6310
Sodium hydroxide (NaOH)	Sigma-Aldrich	480878
Streptavidin Alexa Fluor 568 conjugate	Invitrogen	S11226