Detecção de imunofluorescência de dois análogos da timidina (CldU e UDI), em tecido primário

Resumo

Temos uma estratégia de derivados para detectar incorporação seqüencial de análogos da timidina (CldU e UDI) em tecidos de camundongos adultos para quantificar duas rodadas sucessivas de divisão celular. Esta estratégia é útil para detectar renovação celular de longa duração tecidos, transformação oncogênicos, ou de trânsito ampliando-células.

Resumo

Medição precisa da divisão celular é um desafio fundamental em biologia experimental, que se torna cada vez mais complexo quando lentamente células em divisão são analisados. Métodos estabelecidos para detectar a divisão celular incluem a visualização direta por microscopia contínua em cultura de células, a diluição de corantes vitais como carboxifluoresceína di-aetate succinimidyl éster (CFSE), imuno-detecção de antígenos mitogênicos como a Ki67 ou PCNA, e os análogos da timidina. Análogos da timidina pode ser detectado por uma variedade de métodos incluindo rádio-detecção de timidina tritiada, imuno-detecção de bromo-deoxiuridina (BrdU), cloro-deoxiuridina (CldU) e iodo-deoxiuridina (UDI), e detecção química de etinil-deoxiuridina (Edu). Temos uma estratégia de derivados para detectar incorporação seqüencial de diferentes análogos da timidina (CldU e UDI) em tecidos de ratos adultos. Nosso método permite que os investigadores quantificar com precisão duas rodadas sucessivas de divisão celular. Por meio da otimização de protocolos imunocoloração nossa abordagem pode detectar análogos dose muito baixa timidina administrada através da água potável, segura para administrar a ratinhos durante períodos prolongados de tempo. Conseqüentemente, a nossa técnica pode ser usada para detectar renovação celular nos tecidos muito longa. Obter óptimos resultados de coloração immunofluoresent pode ser conseguido em vários tipos de tecido, incluindo pâncreas, pele, intestino, fígado, adrenal, testículos, ovários, tireóide, linfonodos e cérebro. Temos também aplicou esta técnica para identificar a transformação oncogênica dentro dos tecidos. Temos ainda mais aplicada essa técnica para determinar se o trânsito ampliando células contribuem para o crescimento ou renovação dos tecidos. Neste sentido, a administração seqüencial de análogos da timidina representa uma nova abordagem para estudar as origens ea sobrevivência das células envolvidas na homeostase do tecido.

Protocolo

1. Tecidos rotulagem com CldU e UDI

1. Dissolver análogos da timidina (CldU ou UDI) na água. Pesar mL 1mg / de cada produto químico e adicionar para separar garrafas de vidro de água destilada. Normalmente, prepare um litro de cada vez.
2. Dissolver os produtos químicos em uma placa de agitação ou outra forma de agitador. CldU vai dissolver em 10 min. de agitação à temperatura ambiente. UDI requer mais de uma hora de agitação a 37 ° C em um agitador. Fontes de água podem influenciar a solubilidade UDI. Se UDI permanece reativada após a agitação durante a noite, tente uma fonte mais limpa de água. As soluções são armazenadas a 4 ° C no escuro.
3. Administrar a solução contendo timidina primeiro (ou CldU ou UDI) para os ratos para o período de rotulagem desejado. Não permita que ratos para ter acesso à água sem rótulo durante o período de etiqueta. Quando o período de rotulagem designado é concluída, iniciar um washout com água sem rótulo, pelo menos, 24 horas (os análogos da timidina contendo soro têm meias-vidas de várias horas). Administrar a solução contendo timidina segundo (ou CldU ou UDI) para os ratos para o período de rotulagem desejado. Garrafas de água de recarga regularmente para evitar a desidratação!
4. Alternativamente, os camundongos podem ser rotulados por injeção intraperitoneal seqüencial de CdlU e UDI. Prepare CldU UDI ou de 10 mg / mL de concentração. UDI podem exigir gota a gota, adição de solução concentrada de hidróxido de sódio seguido de agitação vigorosa para entrar em suspensão. Não adicionar hidróxido de sódio em excesso. Adicionar uma gota de hidróxido de sódio a uma solução de 10 mL de UDI seguido por uma hora de agitação a 37 ° C em um agitador. Se não na solução, repita adição de hidróxido de sódio. Injetar 100mcg por g de peso corporal no espaço intraperitoneal.
5. As lâminas de controlo são essenciais para este protocolo. Como resultado, nós sugerimos investigadores realizar diversas variações de timidina rotulagem analógica para garantir a sensibilidade e especificidade. Estes devem incluir 1. Ratos que foram apenas marcados com CldU, 2. Ratos que foram rotulados apenas com parceiros UDI; 3. Ratos que foram seqüencialmente marcados com CldU e UDI, em seguida, 4. Ratos que foram rotulados sequencialmente na ordem inversa, primeiro com UDI e, em seguida, CldU, 5 ratos que são rotulados simulada apenas com água. Quando aprender a etiqueta com CldU e UDI, os investigadores devem sempre realizar todo o protocolo com todos os 5 jogos acima de lâminas de controlo a partir do tecido de interesse.

2. Preparação de colheita de tecidos, Fixação, e Slide

1. Usando anestésico apropriado, realizar overdose letal e, em seguida, o sacrifício do mouse através de sangria. Remover o tecido fresco e fixar com paraformalehyde 4% a 4 ° C por 24 horas. Transferência de tecido para 1:04 tampão formalina e armazenar a 4 ° C para a incorporação.
2. Alternativamente, execute overdose letal e, em seguida, perfundir o mouse através do ventrículo cardíaco esquerdo com solução salina até que o sangue é eliminado do organismo, em seguida, imediatamente perfundir com 30-50 cc de paraformaldeído 4%. Remover os tecidos de interesse e armazenar em 1:04 tampão formalina a 4 ° C para a incorporação.
3. Após a desidratação dos tecidos e inclusão em parafina, corte seções 5 micra de tecido e coloque em lâminas carregadas. Asse as lâminas a 65 ° C por 16 horas para assegurar a adesão de tecido a deslizar (essencial com passos antígeno de recuperação abaixo).

3. Recuperação de desidratação, permeabilização, Antigen e

1. Retire o excesso de parafina pela imersão slides em dois banhos de xileno por 5 min. cada um.
2. Reidratar o tecido por imersão slides em etanol diluído com água: 100, 95, 90, 80 70 e 50%. Embeber os slides durante 3 min. para cada concentração, começando com 100% e indo para 50% para a imersão final.
3. Lavagem das lâminas durante 5 min. em 1x PBS.
4. Permeabilizar as células por imersão slides em 0,2% solução de Triton X-por 5 min (feito fresco de cada vez).
5. Prepare slides para microondas recuperação antigênica do tecido. Colocar as lâminas em um copo de vidro com um número suficiente de 0,01 M pH 6,0 volume de citrato de sódio, de modo que a solução abrange cinco centímetros acima da parte superior dos slides para explicar a perda por evaporação.
6. Microondas slides até que a solução está fervendo (3-10 min. Potência máxima). Reduzir o poder até que a solução está lentamente a ebulição (10-80%) e continue por um adicional de 20 min. Verifique microondas periodicamente para garantir a solução mantém-se em uma fervura lenta.
7. Copo contendo slides lugar em uma bancada e deixe esfriar ligeiramente à temperatura ambiente, (aproximadamente 2 horas).
8. Confirmar que os slides estão em temperatura ambiente usando um termômetro.
9. Imergir as lâminas em 1.5N HCL por 40 min. à temperatura ambiente.
10. Lavagem das lâminas duas vezes em 1X PBS, 5 min. por lavagem.

4. Anticorpos primários e secundários

1. É importante que os slides continuam muito úmido através de todo o protocolo. Tecido seco terá muito mais autoFluorescência, tornando as imagens resultantes inutilizável. Para evitar morrer, deslize um processo de cada vez.
2. Seção de cada círculo nos slides com um líquido de bloqueio (ie, cera) caneta. Coloque os slides de volta para o recipiente de 1x PBS.
3. Faça uma câmara de incubação úmida, colocando toalhas de papel molhado deitadas no fundo de um recipiente plástico hermeticamente fechado.
4. Compõem solução de bloqueio de soro burro de 10% diluído em PBS 1x. É importante cobrir inteiramente cada seção com a solução. Para secções de tecido que são 1 x 1,5 centímetros, um volume de 50 micro-litros de solução por seção é suficiente.
5. Adicionar a solução de bloqueio para os slides. Remover slides de 1x PBS e eliminar o excesso de líquido batendo na borda de slides em uma pilha de toalhas de papel seco. Slides lugar na câmara de incubação e adicionar 50 micro-litros de solução de bloco de 10% para cada seção. Quando todos os slides estão concluídas fechar o recipiente e deixe em temperatura ambiente por 1 hora.
6. Prepare diluição do anticorpo primário para detectar UDI. Diluir rato anti-BrdU na concentração 1:250 em 5% burro soro feito em 1x PBS. Torneira solução bloco de slide e coloque de volta para a câmara de incubação. Adicione o anticorpo primário acima de cada seção e incubar overnight a 4 ° C.
7. Prepare lavar rigor elevado (o que minimiza ligação com o mouse anti-soros anti-BrdU para CldU). Compõem tampão TBST fresco baixo sal (36mm Tris, 50 mM NaCl, 0,5% tween-20, pH 8,0). Você vai precisar de 40 mL de tampão por par de slides. Adicionar 40 mL de tampão a cada tubo cônico de 50 mL. Antes de adicionar slides, pré-aquecer a solução a 37 ° C.
8. Dois ao mesmo tempo, remover slides da câmara de incubação, coloque-os back-to-back (de modo que amostras de tecido rosto um do outro) e torneira anticorpo primário em excesso. Coloque as lâminas na tubos cheios de TBST baixo teor de sal e tampe. Agitar os tubos por 20 min. em um tremendo cultura bacteriana incubadora com a temperatura a 37 ° C, ea velocidade ajustada para 225 rpm.
9. Lavar as lâminas duas vezes em fresco 1X PBS. 5 min. por lavagem.
10. Prepare a solução de anticorpos próxima primária para detecção de antígeno CldU e tecido, se desejar. Diluir rato anti-BrdU na concentração 1:250 em 5% burro soro feito em 1x PBS. Diluir anti-soros primários contra o antígeno do tecido em trabalhar a concentração na solução de anticorpo primário.
11. Toque excesso de PBS 1x fora dos slides, e colocá-los na câmara de incubação. Adicionar anticorpo primário para cada seção e incubar overnight a 4 ° C.
12. Lavar as lâminas duas vezes em fresco 1X PBS. 5 min. por lavagem.
13. Preparar a solução de anticorpo secundário. Diluir Cy2 burro anti-rato de 1:250 e Cy5 burro anti-rato a 1:500 em PBS 1X uma solução contendo soro burro de 5%. Adicionar Cy3 secundário para detectar as espécies primárias do anti-soro antígeno de tecido. Além disso, diluir uma solução estoque 0,4 mg / mL de DAPI a 1:150 em solução de anticorpo secundário.
14. Toque excesso de 1X PBS desliza e coloque na câmara de incubação. Adicionar solução de anticorpo secundário para cada seção e incubar por 1 hora à temperatura ambiente.
15. Lavar as lâminas duas vezes em fresco 1X PBS. 5 min. por lavagem.
16. Toque excesso de 1X PBS fora dos slides e aderir tampa de vidro com Prolong Ouro anti-fade meios de montagem (NÃO use Vectashield com corantes dyanine!). Imprensa sobre lamínulas para eliminar bolhas de ar. Armazenar a 4 ° C.

5. Análise de imagem e

1. Imagem do tecido de interesse com um microscópio de fluorescência equipado com uma fonte de alta energia da luz, plano-apocromático objetivos, e uma câmera de microscópio de alta eficiência (por exemplo, Hamamatsu Orca ER). Capturar imagens no AMCA (DAPI), Cy2 (CldU), Cy3 (antígeno do tecido), e Cy5 (UDI) canais. Mesclar imagens para criar um único arquivo de imagem multi-camada.
2. Se realizado corretamente, DAPI núcleos corados será homogeneamente brilhante. Antígeno do tecido (insulina por exemplo) deve revelar células de interesse. Se a coloração com DAPI ou tecido antígeno é fraca ou inconsistente slide, mergulhe em 1X PBS durante a noite para remover tampa de deslizamento e repita a aplicação do anti-soro secundário.
3. Concentre-se no antígeno em tecido Cy3. Verifique CldU e UDI coloração em Cy2 e Cy5 canais, alternando entre os canais. Olhar para o potencial de reatividade cruzada entre os marcadores, como indicado pela UDI excessiva e CldU co-positividade. Procure tecidos que contêm apenas CldU ou UDI. Falta de CldU ou UDI núcleos positivos podem indicar um problema técnico com a rotulagem ou marcação. Neste caso, procure um tecido altamente replicativo (por exemplo, linfonodos).
4. Analisar imagens. Mostrar camadas contendo DAPI e antígeno do tecido. Usando um marcador de quadro branco na mão dominante e um contador de células na mão não-dominante, marca cada núcleo com um ponto de contraste com um marcador seca apagar (aka branco marcador board). Contagem de células DAPI positivas no tecido de interesse. Registro da contagem de células total. Use uma borracha seca para remover marcas. Camada de apresentaçãos contendo DAPI, antígeno do tecido, e CldU. Contagem de células CldU positivo no tecido de interesse. Registro da contagem de células CldU mas não apagar as marcas. Mudar o display para visualizar as camadas contendo antígenos do tecido, CldU, e UDI. Contar CldU UDI dupla células positivas. Valor recorde, apagar todas as marcas, e exibir camadas contendo DAPI, antígeno do tecido, e UDI. Contar o número total de células UDI positivos dentro do tecido de interesse. Registro da contagem de células UDI.

6. Resultados representante

Nós rotulados sequencialmente 6 semanas de idade camundongos fêmeas com CldU por uma semana e depois UDI por duas semanas, seguido pelo sacrifício imediato. Pancreata foram coradas para detectar CldU, UDI, e insulina (um antígeno do tecido), bem como DAPI. Ilhotas foram uniformemente corados com insulina. CldU núcleos corados eram distintos UDI núcleos corados (Figura 2). Muitos núcleos fora do ilhéu foram CldU UDI co-positivos (Figura 2, abaixo à direita, setas brancas). Uma célula de insulina único positivos tinham coloração nuclear para ambos CldU e UDI (Figura 2, parte inferior direita, seta magenta).

Camundongos. Todos os experimentos com camundongos foram realizados de acordo com as diretrizes do comitê IACUC do Hospital Infantil da Filadélfia. Feminino B6.129 F1 do tipo selvagem ratos foram adquiridos da Taconic (Germantown New York), alojados nas instalações com animais de laboratório do Hospital Infantil da Filadélfia, e alimentados com a dieta do rato de 5015 PMI Nutrition International (Richmond. Indiana).

Rotulagem estratégia. Ao classificar o evento de primeira divisão celular com CldU (marcado verde nesse esquema) e da divisão celular em segundo lugar com UDI (marcado a vermelho neste esquema), os resultados de células seqüenciais divisão em co-rotulados com as duas células CldU e UDI (verde / vermelho) .

Resultados representativos da rotulagem timidina do volume de negócios no pâncreas de células dentro de camundongos. Imunofluorescência imagem de um pâncreas de rato com ilhotas de Langerhans no centro. Mouse foi infundido com CldU por 1 semana e depois UDI por 2 semanas na água de beber antes de sacrifício imediato. Amostra de pâncreas foi processado como descrito no protocolo. 40x imagens objetivas, com camadas distintas exibido adequado para contagem. Imagens fundidas contêm DAPI (branco) CldU (verde), UDI (vermelho), insulina (amarelo). (Superior, à esquerda) DAPI e insulina. (Superior, direita) CldU e insulina. (Inferior, à esquerda) UDI e insulina. (Inferior, à direita) CldU, UDI, e insulina. Barra de escala: 100μm.

Figura 1. Estratégia de Etiquetagem. Ao classificar o evento de primeira divisão celular com CldU (marcado verde nesse esquema) e da divisão celular em segundo lugar com UDI (marcado a vermelho neste esquema), os resultados de células seqüenciais divisão em co-rotulados com as duas células CldU e UDI (verde / vermelho) .

Figura 2. Resultados Representante da rotulagem timidina do volume de negócios no pâncreas de células dentro de camundongos. Imunofluorescência imagem de um pâncreas de rato com ilhotas de Langerhans no centro. Mouse foi infundido com CldU por 1 semana e depois UDI por 2 semanas na água de beber antes de sacrifício imediato. Amostra de pâncreas foi processado como descrito no protocolo. 40x imagens objetivas, com camadas distintas exibido adequado para contagem. Imagens fundidas contêm DAPI (branco) CldU (verde), UDI (vermelho), insulina (amarelo). (Superior, à esquerda) DAPI e insulina. (Superior, direita) CldU e insulina. (Inferior, à esquerda) UDI e insulina. (Inferior, à direita) CldU, UDI, e insulina. Barra de escala: 100μm.

Discussão

Nossa abordagem para timidina abordagem baseada em volume de negócios à rotulagem célula tem muitas aplicações potenciais na pesquisa biomédica. Até à data, têm-se concentrado sobre o pâncreas, mas também temos aplicado esta estratégia para examinar a renovação celular da pele, intestino, fígado, rim, adrenal, testículos, ovários, tireóide, linfonodos, hematopoiese e cérebro ^1. Porque renovação celular varia de tecido para tecido, as estratégias de rotulagem deve ser personalizado para obter as informações mais interessantes do órgão de interesse. Morrison e seus colegas usaram CldU e UDI para 1 a cada dia para rotular hematopoiese ^2. Kuhn e seus colegas usam CldU e UDI, durante 4 dias cada um para detectar a divisão celular na regeneração do miocárdio ^3. Em contraste, temos usado CldU e UDI por até 9 meses total a etiqueta volume de negócios de células basais dentro de ilhotas pancreáticas, um tecido com volume de negócios célula mínima que o animal envelhece ^1,4-6. A aplicação mais óbvia potencial da nossa estratégia de rotulagem é de estudos para definir a renovação celular dentro da homeostase do tecido. Mas a nossa técnica tem várias outras aplicações potenciais. Por exemplo, nós também recentemente aplicou esta técnica para identificar a transformação oncogênica dentro dos tecidos, onde áreas focais de aumento da replicação pode ser facilmente identificado pela incorporação crescente de UDI CldU ou ^5. Morrison e seus colegas usaram CldU e UDI para 1 a cada dia para testar o comportamento de fixação da etiqueta de células-tronco hematopoéticas ^2. Temos também aplicada rotulagem analógica sequencial timidina para determinar se o trânsito ampliando células contribuem para o crescimento ou renovação dos tecidos ^1. Nesta administração de aplicações seqüenciais de análogos de timidina representa uma nova abordagem para estudar as origens ea sobrevivência das células envolvidas na homeostase do tecido.

Análogos da timidina não deve ser utilizado sem precaução. Análogos da timidina sintéticos têm toxicidade potencial de células em divisão, e seu uso pode, teoricamente, prejudicar a renovação das células em animais em crescimento. Análogos da timidina têm sido usados ​​como agentes radiosuscetível para pacientes com câncer, e pode retardar a renovação celular. Assim, apelamos a investigadores para investigar com cautela para toxicidades potenciais em seus tecidos de interesse. Por exemplo, Trumpp e seus colegas acham que BrdU sistêmica pode forçar células-tronco hematopoéticas para entrar ciclo celular ^7. Por exemplo, Rutter e colegas observaram que os análogos da timidina altas doses são tóxicos para o desenvolvimento de pâncreas ^8. Mais recentemente Hellerstein e seus colegas na KineMed, Inc descobriu que retarda BrdU administração intra-ilhota proliferação de 16-25% usando uma técnica de rotulagem de propriedade de água pesada ^9. Os preparativos da ilhota utilizada por toda Hellerstein e colegas contidas endócrinas e muitos outros tipos de células endócrinas não, o qual pode incluir até 50% das preparações das ilhotas total. No entanto, descobrimos que a infusão prolongada de BrdU não influencia a proliferação de células beta em camundongos adultos jovens, medido pelo Ki67 expressão ^4. Da mesma forma, a longo prazo administração de CldU e UDI não parece prejudicar a expansão da massa de células beta ^1. Além disso, as taxas de proliferação de células beta são equivalentes entre camundongos rotulados com BrdU por longos períodos de tempo e de ratos que só são rotulados por algumas horas (taxas são normalizados para períodos de tempo equivalente). Juntos, esses resultados sugerem que os ratos podem tolerar com segurança a longo prazo da administração de baixa dose de análogos da timidina. Ainda assim, não podemos descartar potencial de toxicidade por análogos da timidina na pâncreas crescimento das células beta. Como resultado, continuamos a realizar os controlos quando rotulagem camundongos com análogos da timidina, e exortar outros investigadores a fazê-lo também.

Nossa técnica de marcação seqüencial análogos da timidina não isenta de riscos e desafios técnicos. Como resultado, lâminas de controlo são especialmente importantes. Temos gerado slides de controle que consistem em vários tecidos a partir de 1) Os ratos que foram apenas marcados com CldU;.. 2) Os ratos que foram rotulados apenas com parceiros UDI;. 3) Os ratos que foram seqüencialmente marcados com CldU e UDI;. 4) ratos que foram rotulados sequencialmente na ordem inversa, primeiro com UDI e, em seguida, CldU;. 5) Os ratos que são rotulados simulada apenas com água. Quando aprender a etiqueta com CldU e UDI, os investigadores devem sempre realizar todo o protocolo com todos os 5 jogos acima de slides a partir do tecido de interesse.

Reatividade cruzada entre ligeira CldU e UDI é uma desvantagem infeliz, mas inevitável para rotulagem com ambos os análogos da timidina. A técnica CldU e UDI é baseada nas diferenças de afinidades entre anti-soros que foram originalmente derivados contra BrdU em diferentes espécies (rato e rato). Nosso protocolo, enquanto pesado, é projetado para minimizar tais reatividade cruzada. Conseqüentemente, nós pedimos cautela entre os pesquisadores que consideram pular etapa (s) do protocolo. Em particular, temosencontrou problemas com anti-soros secundárias que são reativos cruzada entre ratos e ratinhos. Isto pode ser minimizado pelo uso de anti-soros Jackson que são totalmente cross-adsorvidas entre ratos e ratinhos.

Ocasionalmente, não conseguem detectar adequadamente a incorporação de timidina. Em tais casos, é extremamente importante o uso de lâminas de controlo positivo para determinar qual reagente ou passo não estava funcionando. Dificuldades são tipicamente devido à má alíquotas de soros, slides seco, ou permeabilização nuclear inadequada. Falhamos com sucesso rótulo desenvolver embriões com UDI. Assim, nem todos os tecidos podem ser permeável ao UDI.

Alternativas para CldU e UDI para a dupla marcação análogo da timidina estão no horizonte. Edu (5-etinil-2 deoxiuridina) pode ser um substrato para a detecção de cobre química catalisada clique ^10,11. Métodos de detecção Edu não requerem a separação das fitas de DNA, e são, portanto, altamente passível de análise por citometria de fluxo ^12. Edu é compatível, mas não reativa cruzada com BrdU ^10. Edu tem sido utilizada para quantificar a renovação celular dos tecidos do mouse diversos, incluindo células pancreáticas beta ^13, células L intestinais ¹⁴ e epiderme ^15. Edu é bastante caro no momento (mil dólares dos EUA por 500mg). Ainda assim, a detecção de Edu parece ser muito mais sensível que a detecção BrdU ^10. Assim, pode ser economicamente viável para combinar Edu e BrdU em vez de CldU e UDI. Este método também pode permitir a detecção de três diferentes rodadas de divisão celular em camundongos triplamente rotulado para Edu, CldU, e UDI.

Em resumo, a nossa técnica de marcação seqüencial análogos da timidina é uma nova abordagem para detecção de renovação celular. Esperamos que a nossa abordagem permite que outros cientistas para quantificar com mais precisão a divisão celular, e esperar que ele vai abrir novos paradigmas na homeostase do tecido.

Materiais

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Name	Company	Catalog Number	Comments
5-chloro-2-deoxyuridine (CldU)		MP Biomedical	0210547891
5-Iodo-2-deoxyuridine (IdU)		MP Biomedical	0210035701
4% Paraformaldehyde		USB	19943
10% Buffered Formalin		Fisher Scientific	23-427-098
XYLENES		VWR	EM-XX0060-4
Ethanol, Anhydrous (Histological)		Fisher Scientific	A405P-4
PBS, 10X Powder Concentrate		Fisher Scientific	BP665-1
Triton –X-100		Fisher Scientific	BP151-500
Hydrochloric Acid		VWR	BDH3028-2.5LG
Normal Donkey Serum		Jackson ImmunoResearch	017-000-121
Mouse Anti BrdU		BD Pharmingen	347580
Rat mab anti BrdU		Accurate Chemical	OBT0030
Cy2 donkey anti-rat		Jackson Immuno	712-225-153	Fully adsorbed secondaries from Jackson (minimal cross reactivity).
Cy5 donkey anti-mouse		Jackson immuno	715-175-151	See above
Glass Cover Slips		Sigma-Aldrich	C9056-1CS
YFP Filter		Chroma	49003 ET EYFP	Reduces auto-fluorescence in Cy2 channel
Cy3 Filter		Chroma	49004 ET Cy3
Cy5 Filter		Chroma	49006 ET Cy5
ORCA ER Microscope Camera		Hamamatsu	C4742-95-12ER	Excellent detection of fluorophores
ProLong Gold antifade reagent		Invitrogen	P36930	Do not use Vectashield (toxic to cyanine dyes).