Иммунофлуоресцентного Обнаружение два аналога тимидина (CldU и ПИН) в первичных тканей

Резюме

Мы вывели стратегии для обнаружения последовательного включения тимидина аналогов (CldU и ПИН) в тканях взрослых мышей количественно двух последовательных раундов деления клеток. Эта стратегия полезна для обнаружения обновления клеток долгоживущих тканей, онкогенных трансформации, или транзит-усилительных элементов.

Аннотация

Точное измерение деления клеток является фундаментальной проблемой в экспериментальной биологии, которая становится все более сложной, когда медленно делящиеся клетки, анализируются. Основанная методов обнаружения деления клеток включает прямой визуализации непрерывным микроскопии в клеточной культуре, размывание витальных красителей, таких как карбоксифлуоресцеина ди-aetate сукцинимидил эфира (CFSE), иммуно-обнаружение митогенных антигены, такие как Ki67 или PCNA, и тимидина аналогов. Тимидина аналоги можно обнаружить с помощью различных методов, включая радио-детектирования тритием тимидина, иммуно-обнаружения бром-дезоксиуридина (BrdU), хлор-дезоксиуридина (CldU) и йод-дезоксиуридина (ПИН) и химического обнаружения этинил-дезоксиуридина (EDU). Мы вывели стратегии для обнаружения последовательного включения различных аналогов тимидина (CldU и ПИН) в тканях взрослых мышей. Наш метод позволяет исследователям точно количественно двух последовательных раундов деления клеток. Благодаря оптимизации иммуноокрашивания протоколов наш подход может обнаружить очень низкие дозы тимидина аналогов вводят через питьевую воду, безопасную для управления мышам в течение длительных периодов времени. Следовательно, наш метод может быть использован для обнаружения обновления клеток в очень долгоживущих тканей. Оптимальное immunofluoresent результаты окрашивания могут быть достигнуты в нескольких типов тканей, в том числе поджелудочной железы, кожи, кишечника, печени, надпочечников, семенников, яичников, щитовидной железы, лимфатических узлов и мозга. Мы также применили этот метод для определения онкогенных преобразования в тканях. У нас есть дальнейшие применил эту технику, чтобы определить транзит-усилительных клетки способствуют росту и обновлению тканей. В этом смысле, последовательное введение аналогов тимидина представляет собой новый подход для изучения происхождения и выживания клеток, участвующих в тканевого гомеостаза.

протокол

1. Маркировка тканей с CldU и ПИН

1. Растворите тимидина аналогов (CldU или ПИН) в воде. Взвесьте 1 мг / мл каждого химического вещества, и добавить к отдельным стеклянные бутылки дистиллированной воды. Как правило, мы приготовления 1 литра каждая на время.
2. Растворите химических веществ на пластине перемешать или другую форму агитатора. CldU растворяются в 10 мин. агитации при комнатной температуре. ПИН требуется больше, чем час агитации при 37 ° С в шейкере. Источники воды могут влиять ПИН растворимости. Если ПИН остается без отсрочки после встряхивания ночь, попробуйте чистого источника воды. Решения хранить при температуре 4 ° С в темноте.
3. Администрирование первый тимидина раствор, содержащий (либо CldU или ПИН) для мышей для желаемой маркировки период. Не позволяйте мыши получить доступ к немеченого воды в период этикетке. Когда назначенный маркировки период завершен, начинается вымывание с немеченого воды в течение 24 часов (тимидина содержащие аналоги сыворотке полураспада несколько часов). Администрирование второй тимидина раствор, содержащий (либо CldU или ПИН) для мышей для желаемой маркировки период. Refill бутылки воду регулярно, чтобы предотвратить обезвоживание!
4. Кроме того, мыши могут быть помечены последовательными при введении препарата в CdlU и ПИН. Подготовка CldU или ПИН в 10 мг / мл, концентрация. ПИН могут потребовать каплям добавлением концентрированного раствора гидроксида натрия следует энергичного встряхивания идти в подвеске. Не следует добавлять избыток гидроксида натрия. Добавить одну каплю раствора гидроксида натрия в 10 мл раствора с ПИН, затем час агитации при 37 ° С в шейкере. Если не в решении, повторите добавлением гидроксида натрия. Inject 100мкг в г веса тела в внутрибрюшинного пространства.
5. Управление слайды являются существенными для данного протокола. В результате, мы настоятельно рекомендуем следователи проводят несколько вариантов маркировки аналог тимидина для обеспечения чувствительности и специфичности. Эти меры должны включать 1. Мыши, которые были только маркированы CldU 2. Мыши, которые были помечены только с потребителями инъекционных наркотиков, 3. Мыши, которые были последовательно помечены CldU ПИН, а затем, 4. Мыши, которые были помечены последовательно в обратном порядке, сначала с ПИН, а затем CldU, 5 мышей, которые макет помечены только воду. При обучении на этикетке с CldU и ПИН, следователи должны всегда выполнять весь протокол со всеми 5 выше наборов контроль слайды из тканей, представляющих интерес.

2. Ткань Урожай, фиксации, и слайд-подготовка

1. Используя соответствующие анестетика, выполнить смертельной передозировки, а затем жертву мыши с помощью кровопускания. Удалить чистую ткань и закрепите с помощью 4% paraformalehyde при 4 ° С в течение 24 часов. Передача ткани до 1:4 формалина буфера и хранить при 4 ° С для вложения.
2. Кроме того, выполнять смертельные передозировки, а затем заливать мышь через левый желудочек сердца с солевым раствором, пока кровь выводится из организма, а затем сразу же заливать по 30-50 мл 4% параформальдегида. Удалить тканей интерес и хранить в 1:04 Формалин буфера при 4 ° С для вложения.
3. После обезвоживания тканей и парафина вложение, вырезать 5-микронных срезов ткани и поместите на заряженные слайдов. Выпекать слайды при 65 ° С в течение 16 часов, чтобы обеспечить адгезию ткани скользить (эфирные с антигеном поиска шаги ниже).

3. Обезвоживание, пермеабилизации, и антиген поиска

1. Удалите излишки парафина путем погружения слайда в двух ксилол ванны в течение 5 мин. каждая.
2. Увлажняет ткань путем погружения слайда в этаноле разбавляют водой: 100, 95, 90, 80 70 и 50%. Замочите слайды в течение 3 мин. при каждой концентрации, начиная с 100% и идет к 50% для окончательного погружения.
3. Вымойте слайды в течение 5 мин. В 1x PBS.
4. Permeabilize клетки путем погружения слайда в 0,2% Triton-X решение в течение 5 мин (из свежих каждый раз).
5. Подготовка слайдов для СВЧ-поиска антигена ткани. Место слайды в стеклянный стакан с достаточным объемом 0,01 М буфера рН 6,0 цитрат натрия, так что решение охватывает 5 см выше верхней части слайда к ответственности за потерю испарением.
6. Микроволновая слайды, пока раствор не кипит (3-10 мин. При полной мощности). Уменьшить власти до решения медленно кипящей (10-80%) и продолжаться в течение еще 20 мин. Проверьте микроволновой периодически, чтобы гарантировать решение остается на медленное кипение.
7. Место стакан, содержащий слайды на настольные и позволяют плавно остыть до комнатной температуры (примерно 2 часа).
8. Убедитесь, что слайды при комнатной температуре на термометре.
9. Погрузите слайдов в HCL 1.5N течение 40 мин. при комнатной температуре.
10. Вымойте слайдов дважды в 1X PBS, 5 мин. в стирке.

4. Первичные и вторичные антитела

1. Важно, чтобы слайды остаются очень влажный в течение всего протокола. Сухой тканью будет иметь намного больше автоматическоеФлуоресценции, что делает полученные изображения непригодным для использования. Для предотвращения смерти, процесс одного слайда за один раз.
2. Круг каждой секции на слайды с жидким блокировки (например, воск) пера. Место слайды обратно в контейнер 1x PBS.
3. Сделать влажной камере инкубации путем размещения мокрые бумажные полотенца в горизонтальном положении на дне герметичном пластиковом контейнере.
4. Макияж блокирующий раствор 10% осла сыворотки, разведенной в 1x PBS. Важно, чтобы полностью покрывать каждую секцию с раствором. Для срезах тканей, которые 1 х 1,5 см, объем 50 микро-литра раствора на разделе достаточно.
5. Добавить блокирование решения слайды. Удалить слайд из 1x PBS и устранить лишнюю жидкость, слегка нажав слайд край стопки сухие бумажные полотенца. Место слайда в инкубационный камеру и добавить 50 микро-литра 10% блока решение к каждому разделу. Когда все слайды будут завершены близко контейнер и инкубировать при комнатной температуре в течение 1 часа.
6. Подготовка первичного разведения антител для обнаружения ПИН. Развести мыши анти-BrdU в концентрации 1:250 в 5% сыворотки осла, сделанные в 1x PBS. Нажмите от блока раствор из слайдов и место обратно в камеру инкубации. Добавить выше первичного антитела к каждому разделу и инкубировать в течение ночи при 4 ° C.
7. Подготовка высокой мыть жесткости (что сводит к минимуму связывания мыши анти-BrdU антисыворотки к CldU). Макияж свежие низкой буфера TBST соли (36 мм трис, 50 ​​мМ NaCl, 0,5% Твин-20, рН 8,0). Вам понадобится 40 мл буфера на каждую пару слайдов. Добавить 40 мл буфера для каждого 50 мл коническую трубку. Прежде чем добавлять слайды, подогреть раствор до 37 ° C.
8. Два за один раз, удалить слайды из инкубационных камер, поместите их спина к спине (так, что образцы тканей лица друг от друга) и кран избыток первичного антитела. Место слайдов в трубки, наполненные низкой TBST соль и крышку. Перемешивают труб в течение 20 мин. В пожимая бактериальной культуры инкубатор с температурой 37 ° С, а скорость набора до 225 оборотов в минуту.
9. Вымойте слайды два раза в пресной 1X PBS. 5 мин. в стирке.
10. Подготовка следующего первичного решение антител для обнаружения CldU и тканевой антиген, если это необходимо. Развести крысы анти-BrdU в концентрации 1:250 в 5% сыворотки осла, сделанные в 1x PBS. Развести первичной сыворотки против антигена ткани на рабочей концентрации в первичный раствор антител.
11. Нажмите избыток 1x PBS прочь слайды, и поместите их в инкубационной камере. Добавить первичного антитела к каждому разделу и инкубировать в течение ночи при 4 ° C.
12. Вымойте слайды два раза в пресной 1X PBS. 5 мин. в стирке.
13. Подготовка вторичного решение антител. Развести Су2 осла против крысы 1:250 и Cy5 осла антимышиным до 1:500 в растворе 1X PBS, содержащий 5% осла сыворотки. Добавить Cy3 вторичной для выявления первичных видов тканей антисывороток антигена. Кроме того, развести 0,4 мг / мл исходного раствора DAPI к 1:150 в средних решение антител.
14. Нажмите избыток 1X PBS с горками и место в инкубационный камеры. Добавить вторичных решение антител к каждому разделу и инкубировать в течение 1 часа при комнатной температуре.
15. Вымойте слайды два раза в пресной 1X PBS. 5 мин. в стирке.
16. Нажмите избыток 1X PBS прочь слайдов и придерживаться покровного стекла с золотой Продли анти-Fade монтажа СМИ (НЕ используйте Vectashield с dyanine красителями!). Нажмите на крышку скользит устранить пузырьки воздуха. Хранить при температуре 4 ° С.

5. Работа с изображениями и анализ

1. Изображение ткани интересов с флуоресцентный микроскоп оснащен высокой источник световой энергии, план-апохроматические цели и микроскоп камеры высокого КПД (например, Хамамацу Orca ER). Захват изображений в AMCA (DAPI), Су2 (CldU), Cy3 (ткани антиген), и Cy5 (ПИН) каналов. Объединение изображений для создания одного многослойного файла изображения.
2. Если выполнены правильно, DAPI окрашенных ядер будет однородно ярким. Ткань антигена (например, инсулина) должны выявить клетки интерес. Если окрашивание DAPI или ткани-антиген является слабым и непоследовательным, погрузите слайд в 1X PBS ночь, чтобы снять крышку скольжения и повторить применения вторичных иммунных сывороток.
3. Сосредоточьтесь на ткани антигена в Cy3. Проверьте CldU и ПИН окрашивания в Су2 и Cy5 каналов, переключение между каналами. Ищите потенциальных перекрестной реактивности между маркерами, о чем свидетельствует чрезмерное ПИН и CldU совместно положительности. Посмотрите на тканях, которые содержат только CldU или ПИН. Отсутствие CldU или ПИН положительных ядер может свидетельствовать о технической проблеме с маркировки или окрашивания. В этом случае, обратите внимание на ткань высоко репликативной (например, лимфатических узлов).
4. Анализ изображений. Показать слои, содержащие DAPI и тканевой антиген. Использование белый маркер доски в доминирующую руку и ячейки счетчика не доминантной рукой, отметьте каждое ядро ​​с контрастными знаком с сухим маркер стереть (он же доске маркером). Граф DAPI положительных клеток в тканях, представляющих интерес. Запись общего количества клеток. Использование сухих ластик, чтобы удалить знаки. Показать слойс содержащей DAPI, ткани антигена и CldU. Граф CldU положительных клеток в тканях, представляющих интерес. Запись CldU количества клеток, но не стереть знаки. Изменение дисплей для визуализации слоев, содержащих антиген ткани, CldU и ПИН. Граф CldU ПИН двойной положительных клеток. Запись значения, удалить все знаки, и отображения слоев, содержащих DAPI, ткани антигена и ПИН. Подсчитать общее число ПИН-положительных клеток в ткани, представляющих интерес. Запись ПИН клеток.

6. Представитель Результаты

Мы последовательно помечены 6-недельных самок мышей с CldU в течение одной недели, а затем ПИН в течение двух недель, после чего немедленно жертву. Pancreata окрашивали для выявления CldU, ПИН, и инсулин (ткани антиген), а также DAPI. Островки были равномерно окрашенные с инсулином. CldU окрашенных ядер отличие от ПИН окрашенных ядер (рис. 2). Многие ядра за пределами островка были CldU ПИН совместно положительный (рис. 2, внизу справа, белые стрелки). Одного инсулина положительные ячейки было ядерное окрашивание для CldU и ПИН (рис. 2, внизу справа, пурпурный стрелкой).

Мыши. Все эксперименты с мышами проводились в соответствии с руководящими принципами IACUC комитета детской больнице Филадельфии. Женский B6.129 F1 мышей дикого типа были приобретены у Taconic (Germantown Нью-Йорк), который находится на объекте лабораторных животных при Детской больницы Филадельфии, и кормили мышей Диета 5015 от PMI Nutrition International (Richmond. штат Индиана).

Маркировка стратегии. Называя первое мероприятие деление клеток с CldU (отмечены зеленым в этой схеме), а второе деление клеток с потребителями инъекционных наркотиков (отмечен красным в этой схеме), последовательное деление клеток приводит к со-меченых клеток с обеих CldU и ПИН (зеленый / красный) .

Представитель результаты тимидина маркировки поджелудочной обновления клеток в мышах. Иммунофлуоресцентного образ мыши поджелудочной железы с островка Лангерганса в центре. Мышь был проникнут CldU в течение 1 недели, а затем ПИН в течение 2 недель в питьевой воде до немедленного жертвоприношения. Поджелудочная железа образец был обработан, как описано в протоколе. 40x цель изображений, с различными слоями отображается подходит для подсчета голосов. Объединенный изображения содержат DAPI (белый) CldU (зеленый), ПИН (красный), инсулин (желтый). (Верхний, левый) DAPI и инсулина. (Верхний правый) CldU и инсулина. (Ниже, слева), ПИН и инсулина. (Ниже, справа) CldU, ПИН, и инсулина. Шкала бар: 100 мкм.

Рисунок 1. Маркировка стратегии. Называя первое мероприятие деление клеток с CldU (отмечены зеленым в этой схеме), а второе деление клеток с потребителями инъекционных наркотиков (отмечен красным в этой схеме), последовательное деление клеток приводит к со-меченых клеток с обеих CldU и ПИН (зеленый / красный) .

Рисунок 2. Представителю результаты тимидина маркировки поджелудочной обновления клеток в мышах. Иммунофлуоресцентного образ мыши поджелудочной железы с островка Лангерганса в центре. Мышь был проникнут CldU в течение 1 недели, а затем ПИН в течение 2 недель в питьевой воде до немедленного жертвоприношения. Поджелудочная железа образец был обработан, как описано в протоколе. 40x цель изображений, с различными слоями отображается подходит для подсчета голосов. Объединенный изображения содержат DAPI (белый) CldU (зеленый), ПИН (красный), инсулин (желтый). (Верхний, левый) DAPI и инсулина. (Верхний правый) CldU и инсулина. (Ниже, слева), ПИН и инсулина. (Ниже, справа) CldU, ПИН, и инсулина. Шкала бар: 100 мкм.

Обсуждение

Наш подход к тимидина подход к маркировке обновления клеток имеет много потенциальных применений в области биомедицинских исследований. На сегодняшний день мы сосредоточены на поджелудочную железу, но мы так же применили эту стратегию для изучения обновления клеток кожи, кишечника, печени, надпочечников, почек, семенников, яичников, щитовидной железы, лимфатических узлов, кроветворения, и головной мозг ^1. Потому что клетка оборота варьируется от ткани к ткани, маркировка стратегии должны быть настроены, чтобы получить наиболее убедительную информацию от органов, представляющих интерес. Моррисон и его коллеги использовали CldU и ПИН в течение 1 дня каждый маркировать кроветворения ^2. Кун и коллеги используют CldU и ПИН в течение 4 дней каждый обнаружить деления клеток в миокард регенерирующим ^3. В отличие от этого, мы использовали CldU и ПИН на срок до 9 месяцев общий для обозначения базально обновления клеток в панкреатических островков, ткани с минимальным оборотом клетки как животное возрасте ^1,4-6. Наиболее очевидный потенциал применения наших маркировки стратегия проведения исследований, чтобы определить обновления клеток в тканях гомеостаза. Но наша методика имеет и ряд других потенциальных применений. Например, мы недавно применил этот метод для определения онкогенных преобразования в тканях, где основными областями повышенной репликации можно легко определить по увеличились включение CldU или ПИН ^5. Моррисон и его коллеги использовали CldU и ПИН в течение 1 дня каждый, чтобы проверить на этикетке сохраняя поведение кроветворных стволовых клеток ^2. Мы также применяется последовательная маркировка аналогом тимидина, чтобы определить транзит-усилительных клетки способствуют росту и обновлению тканей ^1. В этом приложении последовательное введение аналогов тимидина представляет собой новый подход для изучения происхождения и выживания клеток, участвующих в тканевого гомеостаза.

Тимидина аналогов не должна быть использована без осторожности. Синтетические аналоги тимидина имеют потенциал токсичности для деления клеток, и их использование теоретически может нарушать обновления клеток у растущих животных. Тимидина аналогов были использованы в качестве агентов radiosensitizing для больных раком, и может замедлить обновления клеток. Таким образом, мы призываем следователей осторожно исследовать потенциальные токсические эффекты в тканях, представляющих интерес. Например, Trumpp и его коллеги обнаружили, что системные BrdU может заставить гемопоэтических стволовых клеток ввести клеточного цикла ^7. Например, Раттер и его коллеги отметили, что высокие дозы аналогов тимидина являются токсичными для развивающихся поджелудочной железы ^8. Совсем недавно Hellerstein и его коллеги из KineMed, Inc обнаружили, что BrdU администрации замедляет внутри островка распространения на 16-25% с помощью собственной тяжелой техникой маркировке воды ^9. Вся подготовка островок используется Hellerstein и коллег содержится много других эндокринных и не эндокринных типов клеток, которые могут составлять целых 50% от общей подготовки островок. Тем не менее, мы находим, что длительная инфузия BrdU не влияет на бета-клеточной пролиферации у молодых взрослых мышей, если судить по выражению Ki67 ^4. Кроме того, долгосрочные администрации CldU и ПИН-видимому, не ухудшать бета расширения клеточной массы ^1. Кроме того, бета ставки пролиферации клеток эквивалентны между мышами помечены BrdU в течение длительных периодов времени и мышей, которые только маркировку, указывающую на несколько часов (ставки приведены к эквивалентной периоды времени). Вместе взятые, эти результаты позволяют предположить, что мыши, можно смело переносить долгосрочных низких доз администрации тимидина аналогов. Тем не менее, мы не можем исключить потенциальную токсичность тимидина аналогов в рост клеток поджелудочной железы бета-тестирования. В результате, мы продолжаем выполнять элементы управления при маркировке мышей с аналогами тимидина, и призываем другие исследователи, чтобы сделать то же самое.

Наша методика последовательной маркировки аналог тимидина не без ошибок и технических проблем. В результате, контроль слайды особенно важны. Мы сформировали контроль слайды, которые состоят из различных тканей с 1) Мыши, которые были только маркированы CldU;.. 2) Мыши, которые были только помечены с потребителями инъекционных наркотиков;. 3) Мыши, которые были последовательно помечены CldU а затем ПИН;. 4) Мыши, которые были помечены последовательно в обратном порядке, сначала с ПИН, а затем CldU;. 5) Мыши, которые макет помечены только воду. При обучении на этикетке с CldU и ПИН, следователи должны всегда выполнять весь протокол со всеми 5 выше набора слайдов из тканей, представляющих интерес.

Незначительные перекрестной реактивности между CldU и ПИН печально, но неизбежным недостатком маркировки с обоими тимидина аналогов. CldU и ПИН методика основана на различиях в сродство между антисыворотки, которые первоначально были производным от BrdU у разных видов (мыши и крысы). Наш протокол, в то время как громоздкие, предназначена для сведения к минимуму такой перекрестной реактивности. Следовательно, призывают к осторожности среди исследователей, которые считают, пропуская шаг (ы) протокол. В частности, мы имеемстолкнулись с проблемами со средним антисыворотки, которые крест реактивной между мыши и крысы. Это может быть сведен к минимуму за счет использования сыворотки Джексон, который полностью кросс-адсорбированная между мыши и крысы.

Иногда мы не в состоянии адекватно обнаружить тимидина. В таких случаях крайне важно использовать слайды контроль чтобы определить, какой реагент или шаг не работала. Трудности, как правило, из-за плохой аликвоты сыворотки, сухие слайды, или неадекватного ядерной пермеабилизации. Мы не смогли успешно этикетку развивающихся эмбрионов с потребителями инъекционных наркотиков. Таким образом, не все ткани могут быть проницаемы для ПИН.

Альтернативы CldU и ПИН для двойной маркировки аналога тимидина на горизонте. Эду (5-этинил-2 дезоксиуридина) может быть субстратом для меди катализируемой нажмите химии обнаружения ^10,11. Методы обнаружения EDU не требуют разделения цепей ДНК, и, таким образом, очень поддаются анализу с помощью проточной цитометрии ^12. EDU совместимо, но не пересекают реакцию с BrdU ^10. EDU была использована для количественного обновления клеток различных тканей мыши в том числе бета-клеток поджелудочной железы ^13, кишечных клеток L ¹⁴ и Эпидермис ^15. EDU является довольно дорогим на данный момент ($ 1000 США за 500 мг). Тем не менее, Эду обнаружения представляется гораздо более чувствительны, чем BrdU обнаружения ^10. Таким образом, это может быть экономически целесообразным объединить EDU и BrdU вместо CldU и ПИН. Этот метод может также позволить обнаружение трех раундов деления клеток у мышей трижды, предназначенного для EDU, CldU и ПИН.

Таким образом, наша методика последовательной маркировки аналог тимидина является новый подход к выявлению обновления клеток. Мы надеемся, что наш подход позволяет другим ученым для более точного количественного клеточного деления, и ожидать, что оно откроет новые парадигмы в тканевого гомеостаза.

Материалы

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Name	Company	Catalog Number	Comments
5-chloro-2-deoxyuridine (CldU)		MP Biomedical	0210547891
5-Iodo-2-deoxyuridine (IdU)		MP Biomedical	0210035701
4% Paraformaldehyde		USB	19943
10% Buffered Formalin		Fisher Scientific	23-427-098
XYLENES		VWR	EM-XX0060-4
Ethanol, Anhydrous (Histological)		Fisher Scientific	A405P-4
PBS, 10X Powder Concentrate		Fisher Scientific	BP665-1
Triton –X-100		Fisher Scientific	BP151-500
Hydrochloric Acid		VWR	BDH3028-2.5LG
Normal Donkey Serum		Jackson ImmunoResearch	017-000-121
Mouse Anti BrdU		BD Pharmingen	347580
Rat mab anti BrdU		Accurate Chemical	OBT0030
Cy2 donkey anti-rat		Jackson Immuno	712-225-153	Fully adsorbed secondaries from Jackson (minimal cross reactivity).
Cy5 donkey anti-mouse		Jackson immuno	715-175-151	See above
Glass Cover Slips		Sigma-Aldrich	C9056-1CS
YFP Filter		Chroma	49003 ET EYFP	Reduces auto-fluorescence in Cy2 channel
Cy3 Filter		Chroma	49004 ET Cy3
Cy5 Filter		Chroma	49006 ET Cy5
ORCA ER Microscope Camera		Hamamatsu	C4742-95-12ER	Excellent detection of fluorophores
ProLong Gold antifade reagent		Invitrogen	P36930	Do not use Vectashield (toxic to cyanine dyes).