Um Procedimento para o Estudo do Reintegração Footshock Induzida de cocaína Buscando em ratos de laboratório

Resumo

Modelos animais de recaída, conhecido como procedimentos de reintegração, têm sido amplamente utilizados para estudar o papel do estresse na recaída à busca de drogas. Aqui, nós relatamos em um método para induzir a reintegração de cocaína que procuram em ratos de laboratório através de uma exposição aguda ao leve, footshock intermitente elétrica.

Resumo

O aspecto mais insidioso da dependência de drogas é a alta propensão para a recaída. Modelos animais de recaída, conhecido como procedimentos de reintegração, têm sido amplamente utilizados para estudar a neurobiologia e fenomenologia de recaída ao uso de drogas. Embora as variações de procedimento surgiram ao longo das últimas décadas, os procedimentos de reintegração mais convencionais são baseadas no modelo auto-administração de drogas (SA). Neste modelo, um animal é treinado para desempenhar uma resposta operante para obter droga. Posteriormente, o comportamento é extinto pelo reforço retenção resposta contingente. Reposição da procura de drogas é, então, acionada por um evento discreto, como uma injeção de drogas na formação, re-exposição à droga associada com sinais ou exposição a um estressor ^1.

Procedimentos de reintegração foram originalmente desenvolvidos para estudar a capacidade de exposição aguda não contingente à droga treinamento para restabelecer drogas buscando em ratos e macacos ^{1, 2.} Procedimentos de reintegração já foram modificados para estudar o papel dos estímulos ambientais, incluindo drogas associadas pistas e exposição a várias formas de estresse, na recaída de drogas que procuram ^{1, 3, 4.}

Nos últimos 15 anos, o principal foco da literatura reintegração foi sobre o papel do estresse na recaída de drogas. Uma das formas mais utilizadas de estresse para estudar essa relação é uma exposição aguda ao leve, intermitente, footshocks elétrica. A capacidade de estresse para induzir footshock reintegração de drogas buscando foi originalmente demonstrado por Shaham e colegas (1995) em ratos com uma história de heroína intravenosa SA ^5. Posteriormente, o efeito foi generalizado em ratos com histórias de cocaína por via intravenosa, metanfetamina e nicotina SA, bem como o etanol por via oral SA ^{3, 6.}

Embora footshock induzida reintegração de busca de drogas podem ser alcançados de forma confiável e robusto, é um efeito que tende a ser sensível a certas variáveis ​​paramétricas. Estes incluem o arranjo das sessões de testes extinção e reintegração, a intensidade ea duração do estresse footshock, ea presença de drogas associado pistas durante a extinção e testes de reintegração. Aqui apresentamos um protocolo para footshock induzida reintegração de cocaína que procuram que temos utilizado com sucesso consistente para estudar a relação entre estresse e cocaína procurando.

Protocolo

1. Procedimentos animais Habitação e aclimatação

1. Ratos machos longo Evans, pesando 300-325 g no momento da chegada ao biotério, estão alojados individualmente em gaiolas de plástico padrão de papel reciclado contendo cama de pelotização, com tampa de grade de arame para acomodar garrafas de água e alimentos.
2. Ratos são mantidos em uma programação claro-escuro reversa (luzes acesas 19:00-07:00), em uma temperatura e umidade controladas viveiro.
3. Alimentos e água são ad libitum disponíveis nas gaiolas em casa durante todo o experimento.
4. Ratos estão autorizados a se acostumar com o viveiro e as condições de habitação para uma semana antes da cirurgia. Durante esse tempo, os ratos são perturbadas com a excepção da limpeza de rotina, alimentação e acompanhamento de peso.

2. Cirurgia Cateterismo intravenosa

1. Sob anestesia gás isoflurano, e usando o padrão de assepsia técnicas cirúrgicas, os ratos são preparados com cateteres silastic na veia jugular direita. As saídas de cateter em uma cânula modificados (Plastics One) na superfície do crânio, ea cânula é montado no crânio com joalheiros "parafusos e cimento dental. Para mais detalhes dos procedimentos cirúrgicos, ver ^{7, 8.}
2. No final da cirurgia, os cateteres são liberadas com aproximadamente 0,2 mL de uma solução contendo 50% heparina (1000 UI) e dextrose 50% (25 g/50 mL). Um bloqueador de plástico é colocado sobre a abertura da cânula para proteger o cateter de detritos externo, e para manter a permeabilidade do cateter.
3. No momento da cirurgia, e novamente no dia após a cirurgia, os ratos são administrados 5 mg / kg, SC, do cetoprofeno analgésico.
4. Ratos são permitidos pelo menos sete dias para se recuperar de cirurgia antes de experimentação. Durante este tempo, os ratos são perturbadas nas gaiolas em casa, com exceção da rotina de limpeza e alimentação e acompanhamento diário de peso e saúde em geral. No último dia do período de recuperação, os cateteres são liberadas com a solução de heparina / dextrose (Seção 2.2) para verificar a permeabilidade do cateter.

3. Procedimentos comportamentais

Todos os procedimentos comportamentais são realizadas com equipamentos fornecidos pela Med Associates Inc. (St Albans, VT). O equipamento, instalado numa sala dedicada, inclui um conjunto de câmaras padrão operante, cada contido dentro de um gabinete de som atenuantes. Cada câmara operante é equipado com duas alavancas retrátil, ambos elevados 6,5 centímetros acima de um piso em aço inoxidável. Uma luz branca estímulo está localizado logo acima uma alavanca, e as respostas em que a alavanca (o chamado alavanca "ativo") resultam na iluminação simultânea da luz estímulo e ativação de uma bomba de infusão (Razel Scientific Instruments, St. Albans, VT). A bomba está situado em uma prateleira do lado de fora da câmara operante, mas dentro do gabinete som atenuantes. A outra alavanca (o chamado alavanca "inativo") é esquerda estendida na câmara em todos os procedimentos experimentais; respondendo desta alavanca é sem conseqüência. Finalmente, cada câmara está equipada para fornecer corrente constante, intermitente, footshock, inescapável elétrica através de um scrambler no chão barra de aço. Todas as condições experimentais (por exemplo, apresentações de estímulo, infusões de medicamentos, aplicação de choque), bem como a gravação de dados e consolidação, são realizadas por meio de interfaces entre as câmaras de teste e um computador central operacional Med Associates software (MED-IV).

O experimento é realizado em 5 fases: 1) habituação; 2) A cocaína SA; 3) sem drogas período; 4) Extinção, e 5) Teste de reintegração. Em todas as fases (exceto para o período livre de drogas), os ratos são transferidos para as sessões diárias da sala de habitação para as câmaras de teste operante. Animais são transferidos individualmente, em pequenos recipientes de plástico. Alimentos e água não estão disponíveis nas câmaras operante.

1. Habituação
   1. Vinte e quatro horas que antecedem a primeira sessão de cocaína SA (. Ver Secção 3.2), os ratos estão autorizados a habituar às câmaras operante durante uma sessão de 2 h único; durante esta sessão a alavanca ativa é recolhido.
2. Cocaína SA treinamento
   1. Antes de cada sessão diária de treinamento, os ratos são pesados ​​na sala de habitação. Posteriormente, eles são transferidos para as câmaras de operante.
   2. Ao ser colocada na câmara operante, uma mola e montagem tubulação (estendendo-se da bomba de infusão de drogas) é conectada à cânula crânio-montado.
   3. Ratos são permitidos para a auto-administração de cocaína HCl durante diária de 3 h sessões, para um total de 8-10 dias (consecutiva ou com dois intervenientes "dias de folga" entre as sessões 5 e 6).
   4. SA sessões alternam entre a manhã (9:00-00:00) e tarde (13:00-16:00). O momento da SA sessões é alternada porque os procedimentos em fases subseqüentes do experimento (isto é, extinção e testes) ocorrem em ambas as times do dia para todos os animais (ver Secções 3.4 e 3.5), portanto, este acordo impede qualquer efeito de confusão da hora do dia sobre o comportamento droga-procurando subseqüentes.
   5. Cada sessão de treino é precedido por um período de aclimatação de 5 min, durante o qual os animais são colocados em câmaras operante com a alavanca ativa retraída.
   6. No início da sessão de treino, a alavanca ativo é estendido para dentro da câmara ea luz de estímulo (localizado acima da alavanca ativa) é iluminado por 30 s. Além disso, a luz da casa é ativado neste momento, e permanece iluminado durante toda a sessão. Juntos, esses eventos sinal da disponibilidade de cocaína.
   7. Durante a sessão, as respostas sobre a alavanca ativa são reforçados por uma infusão de 3-s de cocaína (0,23 mL mg/65, iv) em uma proporção fixa-1 esquema de reforçamento. Concomitante com a ativação da bomba de infusão e administração de medicamentos é uma ativação de 20 s da luz estímulo acima da alavanca ativa. Esta apresentação luz 20 s corresponde a um "time-out" período durante o qual as respostas adicionais alavanca ativos são registrados, mas não reforçadas.
   8. Animais são permitidos um máximo de 50 infusões por 3 h sessão. Rotineiramente, impor este critério em nosso trabalho e, em nossa experiência, descobriram que ele reduz, se não elimina, os incidentes de mortes por overdose.
   9. No final de cada sessão diária, cateteres ratos são liberadas com 0,2-0,3 mL de heparina-dextrose solução (ver secção 2.2) e os ratos são devolvidos às suas gaiolas casa.
3. Livre de drogas período
   1. Após a sessão final de cocaína SA, os ratos são perturbadas (com excepção da limpeza de rotina, alimentação e acompanhamento de peso) em sua gaiola para um mínimo de sete dias.
4. Extinção de cocaína treinados comportamento
   1. Ratos são transferidos para as câmaras de operante entre 9:00-10:00 para a formação de extinção.
   2. A mola e montagem tubulação é conectada à cânula crânio-montado.
   3. Coerente com as condições para a formação SA, cada dia de treinamento extinção é precedida por um período de aclimatação de 5 min, durante o qual os animais são colocados em câmaras operante com a alavanca ativa retraída.
   4. Ratos são dadas quatro sessões de 60 min extinção, separados por intervalos de 30 minutos. Cada sessão de 60 min é iniciada por os mesmos eventos que ocorrem no início das sessões de treinamento (ie, a iluminação do farol, a extensão da alavanca ativa, e de 30 segundos de iluminação da luz de estímulo acima da alavanca ativa). Ao longo das sessões, todas as condições que estavam presentes durante o treinamento SA são mantidas (ou seja, a resposta contingente de iluminação de luz estímulo para 20 segundos e 3-s ativação da bomba de infusão), exceto que as respostas alavanca de ativos não são mais reforçados com infusões de cocaína . Durante os intervalos de 30 minutos que separam cada sessão de extinção de 60 min, a alavanca ativa é retraída ea luz da casa é extinto.
   5. No final da sessão de 60 min última, os ratos são devolvidos às suas gaiolas casa.
   6. Passos 3.4.1. a 3.4.5. são repetidos durante 3 dias consecutivos.
5. Reposição da cocaína treinados comportamento pelo estresse footshock
   1. Ratos são transferidos para as câmaras de operante entre 9:00-10:00
   2. Ao ser colocada na câmara operante, a mola e montagem tubulação é conectada à cânula crânio-montado.
   3. Coerente com as condições para a formação e extinção, um período de aclimatação de 5 min é fornecido, durante o qual os ratos são colocados em câmaras operante com a alavanca ativa retraída.
   4. Os ratos são, então, dado duas sessões de 60 min de extinção (ver 3.4.4.) Separados por um intervalo de 30 min, idênticas às durante a fase de extinção.
   5. Se, após a sessão de 60 min segundo o número total de respostas sobre a alavanca anteriormente ativa é inferior a 15, os animais são submetidos a um teste de reintegração após um intervalo de 30 min adicionais. Neste intervalo de 30 min, footshock ou simulada footshock (ou seja, não footshock) é administrado (ver 3.5.6.). Se um critério de 15 respostas ou menos na alavanca ativa não é alcançado após a segunda sessão, uma sessão de extinção adicional (s) é dada antes do teste de reintegração.
   6. Dez minutos após a sessão de segunda extinção de 60 min (ou depois de qualquer sessão extinção adicional de 60 min (s) necessário para estabelecer o critério de extinção de 15 ou menos respostas), os animais são expostos a 20 min de stress footshock intermitente elétrico (ou farsa footshock) na câmara operante. Footshock é ministrada durante um tempo quando a alavanca ativa é retraída e luzes de casa e estímulo são extintas. Footshock é entregue de acordo com um cronograma de tempo variável em um intervalo médio de 40 s (10-70 s range). Cada choque é entregue a uma intensidade de 0,9 mA, e é de 0,5 s de duração. Estes parâmetros de footshock são baseados no trabalho-piloto extensarealizados em nosso laboratório para estabelecer a reintegração de confiança de cocaína que procuram, com a intensidade mínima e duração da exposição footshock. Sob esses parâmetros, os animais apresentam uma resposta reflexa pulando ao choque de 0,5 s, e ocasionalmente emitem uma vocalização breve. Embora os animais são observados durante o período de choque, a intensidade do choque não é de magnitude suficiente para induzir sinais mais evidentes de angústia.
   7. Imediatamente após a cessação da sessão footshock, a alavanca ativo é estendido e ratos estão autorizados a alavanca de imprensa em condições de extinção (ou seja, as respostas não são reforçadas com a cocaína, mas continuarão a conduzir a iluminação da luz de estímulo e ativação da bomba de infusão ). Este período de tempo é definido como o teste de reintegração e é tipicamente 1-3 horas de duração. Mais respondendo ocorre na parte inicial da sessão de teste (primeiros 30 min-1 h) e, posteriormente, extingue ao longo de períodos de teste mais prolongado. Assim, a 1 teste h é suficiente para captar o efeito de reintegração, com períodos mais longos de análises que forneçam um perfil mais completo extinção do efeito.
   8. Quando medidas repetidas é empregado, cada rato foi testado sob condições footshock footshock e sham. Passos 3.5.1. a 3.5.8 são repetidos em um dia de testes subsequentes, eo teste alternativo de reintegração (footshock ou simulada footshock) é administrado.

4. Resultados representativos:

Figura 1. Perfis de resposta estilizado para a atividade nas alavancas ativos e inativos durante a auto-administração, formação de extinção, e testes de reintegração.

A Figura 1 apresenta estilizada perfis de resposta operante, típicos, obtidos durante as várias fases do protocolo experimental aqui descrito.

1. Ativos respostas alavanca

1. Cocaína treinamento SA. Figura 1 (painel esquerdo) mostra uma típica curva de cocaína SA treinamento que inclui tanto o número de infusões e número total de prensas alavanca ativa. Ratos geralmente adquirir cocaína SA dentro das sessões 1-3 e, quando o comportamento é estabelecida, manter uma taxa estável de ingestão da droga (normalmente menos de 20% entre a sessão de variância) ao longo de sessões subseqüentes.
2. Extinção de cocaína treinados comportamento. Pode ser visto na figura 1 (painel do meio), que no dia 1 de Extinção, quando as respostas não são reforçadas pela primeira vez, o número total de respostas na alavanca ativa é inicialmente mais elevado do que no final da fase de formação (que corresponde a uma "explosão extinção" so-called), gradualmente, ao longo dos quatro sessões de extinção, responder diminui. Nos Dias 2 e 3 de extinção, alguma recuperação de responder (em relação ao observado durante a última sessão do dia anterior) pode ser observada, no entanto, as respostas são geralmente menos do que no início do dia anterior de extinção, e extinção geralmente prossegue mais rapidamente ao longo dos quatro sessões para esse dia.
3. Reintegração de cocaína que procuram. Pode ser visto na figura 1 (painel direito) que 20 min de exposição ao footshock intermitente induz um aumento no não-reforçada responder a alavanca ativa, em relação ao observado no final da sessão de extinção anterior. Footshock também induz um aumento na resposta em relação ao observado em condições em que sham footshock é administrada. Assim, a reintegração de cocaína que procuram por estresse footshock pode ser expressa como: 1) o aumento do número de não-respostas reforçada após a exposição ao footshock, em relação às respostas na sessão de extinção antes footshock ou 2) aumento o número de não-reforçada respostas após a relação footshock footshock farsa.

2. Inativos respostas alavanca

Ele pode ser visto na Figura 1 (linha vermelha) que, em todas as fases experimentais, existem níveis de resposta muito baixa associada com a alavanca de inativos. No entanto, um aumento modesto na resposta sobre esta alavanca é por vezes observada após a exposição ao estresse footshock. Mesmo nos casos em que tal aumento ocorre em resposta, o aumento da alavanca ativa responder tende a ser proporcionalmente muito maior.

Discussão

Ao longo dos últimas décadas, três variações do processo de reintegração SA têm sido desenvolvidos para estudar a reintegração de drogas que procuram em ratos de laboratório e macacos. As diferenças que definem as variações processuais referem-se principalmente ao facto de drogas SA, extinção e sessões de testes ocorrem no mesmo dia ou em dias diferentes ^1. O procedimento que descrevemos neste artigo é comumente referido como o "dentro de entre" variação sessão, porque droga SA ocorre durante sessões diárias (ou seja, de uma forma entre as sessões), que são separados de extinção e sessões de testes, mas a extinção e testes ocorrem no mesmo dia (ou seja, de uma forma dentro de sessão) [por ^{exemplo, 7, 9].} Alternativamente, nos chamados "entre as sessões de" procedimentos, todas as fases do experimento ocorrer sequencialmente, de tal forma que SA, extinção e sessões de teste são dadas em dias diferentes (ou seja, todas as fases estão entre as sessões) [por exemplo, ^{8, 10, 11].} Em contraste, nos procedimentos de completa "dentro das sessões", SA a formação, extinção e sessões de testes ocorrem todos no mesmo dia [por exemplo, ^12].

Embora existam relatos publicados de footshock induzida reintegração de drogas que procuram usar diferentes variações do processo de reintegração, temos encontrado este estressor (pelo menos em animais com histórico de cocaína SA) para ser mais eficaz quando extinção e testes ocorrem no mesmo dia (ou seja, em um "dentro de entre" maneira sessões). Em alternativa, temos tido sucesso com a obtenção de reintegração footshock induzida confiável de cocaína que procuram utilizando um completamente "entre as sessões de" procedimento, mas apenas sob condições em que os animais estão alojados nas câmaras SA durante todo o experimento ^8, ou, pelo menos, durante a extinção e testes ^13. A desvantagem desta abordagem entre as sessões, ao longo das atividades descritas no presente protocolo, é que ele limita o número de assuntos que podem ser treinados e testados ao mesmo tempo e, assim, diminui a eficiência de coleta de dados. Embora nas condições do presente protocolo apenas um grupo de animais pode ser extinta e testado em um determinado momento, um maior rendimento pode ser alcançado por incrível por uma semana o horário de início da fase de treinamento SA para dois grupos de ratos. Neste cenário, um primeiro grupo de ratos podem entrar na fase livre de drogas como o segundo grupo entra Semana 2 de treinamento SA, e, posteriormente, a extinção e os testes podem ser realizados no primeiro grupo, enquanto o segundo grupo está em sua droga livre de fase. Esta abordagem permite uma utilização mais eficiente dos recursos e acelera a taxa de aquisição de dados, enquanto levando a muito eficaz e confiável reintegração footshock induzida.

Importante, em nosso procedimento, a extinção do comportamento previamente reforçado com drogas e testes de reintegração ocorre na presença de drogas associado pistas. Embora nunca tenhamos realizado treinamento extinção ou testes na ausência de pistas de drogas associadas, é nosso entendimento, com base em comunicações pessoais, que o estressor pode de fato ser ineficaz na indução de reintegração quando o teste ocorre na ausência de pistas extinto ( pelo menos no caso de animais com histórico de cocaína SA). A análise sistemática desta variável, e as implicações teóricas que ela representa, é uma questão importante para pesquisas futuras.

Um último fator processuais que o comentário é que garante o efeito do estresse sobre footshock reintegração parece ser altamente sensíveis às manipulações do contexto. Por exemplo, o stress footshock só é eficaz em induzir a reintegração de drogas que procuram se for administrado em ambiente em que drogas SA ea extinção ocorrer, isto é, footshock não restabelecer de drogas que procuram se a exposição ao estressor ocorre em um contexto novo, sugerindo uma interação importante entre o estressor e do ambiente de drogas em seus efeitos sobre a reintegração ^14.

Em conclusão, os procedimentos de reintegração footshock, como os descritos neste documento, têm sido usadas com sucesso considerável para elucidar os mecanismos básicos comportamentais e neurobiológicos que regulam a relação entre estresse e recaída de drogas. Na verdade, estes procedimentos, quando modificado para acomodar pré-tratamentos farmacológicos ou manipulações neuroquímicos direcionamento específico substratos neuronais, podem servir como ferramentas poderosas para a caracterização da neurobiologia de reintegração de drogas que procuram por stress.

Materiais

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Name	Company	Catalog Number	Comments
Basic Drug Self-Administration Test Package for Rat Package		Med Associates, Inc	MED-008-CT-B1
Deep extra tall MDF sound attenuating cubicle	Basic Drug Self-Administration Test Package for Rat Package Component	Med Associates, Inc	ENV-018MD
Standard modular test chamber with drug infusion top and waste pan	Basic Drug Self-Administration Test Package for Rat Package Component	Med Associates, Inc	ENV-008CT
Stainless steel grid floor	Basic Drug Self-Administration Test Package for Rat Package Component	Med Associates, Inc	ENV-005
House light, hooded, 28V	Basic Drug Self-Administration Test Package for Rat Package Component	Med Associates, Inc	ENV-215M
Stimulus light 1” white lens	Basic Drug Self-Administration Test Package for Rat Package Component	Med Associates, Inc	ENV-221M
Low profile retractable response lever	Basic Drug Self-Administration Test Package for Rat Package Component	Med Associates, Inc	ENV-112CM
SmartCtrl 8 Input/16 output package	Basic Drug Self-Administration Test Package for Rat Package Component	Med Associates, Inc	DIG-716P2
Single speed syringe pump, 3.33 RPM	Basic Drug Self-Administration Test Package for Rat Package Component	Med Associates, Inc	PHM-100
Rat self infusion package	Basic Drug Self-Administration Test Package for Rat Package Component	Med Associates, Inc	PHM-119B-23-D
Drug Delivery, Arm assembly	Basic Drug Self-Administration Test Package for Rat Package Component	Med Associates, Inc	PHM-110-SAI
Square wave aversive stimulator	Footshock Stress Component	Med Associates, Inc	ENV-414S
Patented quick disconnect harness for stainless steel grid floor	Footshock Stress Component	Med Associates, Inc	ENV-005-QD
Shock output cable	Footshock Stress Component	Med Associates, Inc	SG-219G-10
MED-PC IV Software	Software	Med Associates, Inc	SOF-735