Una procedura per lo studio della Footshock indotta Ripristino di cocaina Cerco nei ratti di laboratorio

Riepilogo

Modelli animali di ricaduta, noto come le procedure di ripristino, sono stati ampiamente utilizzati per studiare il ruolo dello stress nella ricaduta alla ricerca di droga. Qui, segnaliamo su un metodo per indurre il ripristino della cocaina ricerca nei ratti di laboratorio attraverso l'esposizione acuta a mite, footshock elettrico intermittente.

Abstract

L'aspetto più insidioso della tossicodipendenza è la propensione per la ricaduta. Modelli animali di ricaduta, noto come le procedure di ripristino, sono stati ampiamente utilizzati per studiare la neurobiologia e la fenomenologia di ricaduta all'uso di droga. Anche se le variazioni procedurali emerse nel corso degli ultimi decenni, le procedure di ripristino più convenzionale si basano su l'auto-somministrazione del farmaco (SA) del modello. In questo modello, un animale viene addestrato per eseguire una risposta operante per ottenere della droga. Successivamente, il comportamento si estingue mediante ritenuta di risposta contingente di rinforzo. Ripristino della ricerca di droga è poi innescata da un evento discreto, come una iniezione del farmaco formazione, ri-esposizione a stimoli associati al farmaco, o l'esposizione a un fattore di stress ^1.

Procedure di ripristino sono stati originariamente sviluppati per studiare la capacità di acuta non contingente esposizione al farmaco formazione di reintegrare ricerca di droga in ratti e scimmie ^{1, 2.} Procedure di ripristino da allora sono stati modificati per studiare il ruolo degli stimoli ambientali, tra cui droga associati spunti e l'esposizione a varie forme di stress, in ricaduta di ricerca di droga ^{1, 3, 4.}

Negli ultimi 15 anni, un obiettivo importante della letteratura ripristino è stato sul ruolo dello stress nella ricaduta di droga. Una delle forme più comuni di stress per lo studio di questa relazione è l'esposizione acuta lieve, intermittente, footshocks elettrico. La capacità di stress footshock per indurre il ripristino della ricerca di droga è stato originariamente dimostrato da Shaham e colleghi (1995) in ratti con una storia di per via endovenosa heroin SA ^5. Successivamente, l'effetto è stato generalizzato a ratti con storie di cocaina per via endovenosa, metanfetamine, e la nicotina SA, così come l'etanolo orale SA ^{3, 6.}

Anche se footshock indotta ripristino della ricerca di droga può essere ottenuto in modo affidabile e robusta, è un effetto che tende ad essere sensibile a certe variabili parametriche. Questi includono l'organizzazione di sessioni di test estinzione e la reintegrazione, l'intensità e la durata di stress footshock, e la presenza di droga associata spunti durante l'estinzione e test di reintegrazione. Qui vi presentiamo un protocollo per footshock indotta ripristino di cocaina ricerca che abbiamo usato con successo in linea per studiare la relazione tra stress e cocaina cercando.

Protocollo

1. Di ricovero per animali e Acclimatazione procedure

1. Ratti maschi lungo Evans, del peso di 300-325 g al momento di arrivo nel vivaio, sono alloggiati individualmente in gabbie standard di plastica contenente lenzuola di carta riciclata a pellet, con coperchio a griglia metallica per ospitare bottiglie d'acqua e cibo.
2. I ratti sono mantenuti su un reverse luce-buio pianificazione (luci accese 19:00-07:00), a temperatura e umidità controllata vivaio.
3. Cibo e acqua sono disponibili ad libitum nelle gabbie a casa tutto l'esperimento.
4. I ratti sono autorizzati a acclimatarsi al vivaio e le condizioni abitative per una settimana prima dell'intervento. Durante questo periodo i ratti sono lasciati indisturbati ad eccezione della normale pulizia, alimentazione, e il monitoraggio di peso.

2. Cateterizzazione chirurgia per via endovenosa

1. Sotto anestesia gas isoflurano, e utilizzando le normali tecniche di asepsi chirurgica, i ratti vengono preparati con silastic cateteri nella vena giugulare destra. Le uscite catetere in una cannula modificato (Plastica One) sulla superficie del cranio, e la cannula viene montato al cranio con viti e gioiellieri 'cemento dentale. Per i dettagli delle procedure chirurgiche, cfr ^{7, 8.}
2. Alla fine della chirurgia, cateteri vengono svuotati con circa 0,2 ml di una soluzione contenente 50% di eparina (1000 UI) e il 50% di destrosio (25 g/50 ml). Un blocco di plastica è posta sopra l'apertura della cannula per proteggere il catetere da detriti esterni, e per mantenere la pervietà del catetere.
3. Al momento dell'intervento, e di nuovo il giorno dopo l'intervento chirurgico, i ratti vengono somministrati 5 mg / kg, SC, del ketoprofene analgesico.
4. I ratti sono ammessi almeno sette giorni per recuperare da un intervento chirurgico prima sperimentazione. Durante questo periodo, i ratti sono lasciati indisturbati nelle gabbie a casa, con l'eccezione di routine di pulizia e di alimentazione, e il monitoraggio quotidiano del peso e di salute generale. L'ultimo giorno del periodo di recupero, cateteri sono lavata con l'eparina / destrosio soluzione (Sezione 2.2) per verificare la pervietà del catetere.

3. Procedure comportamentali

Tutte le procedure comportamentali vengono effettuate con apparecchiature fornite da Med Associates Inc. (St Albans, VT). L'attrezzatura, ospitato in una sala dedicata, include una serie di standard di camere operante, ogni contenuto all'interno di un suono attenuazione custodia. Ogni camera operante è dotato di due leve a scomparsa, entrambi elevati 6,5 centimetri sopra un pavimento di tondino di acciaio inox. Una luce bianca stimolo si trova appena sopra una leva, e risposte che la leva (la cosiddetta leva "attiva") comportano l'illuminazione simultanea della luce stimolo e l'attivazione di una pompa di infusione (Razel Scientific Instruments, St. Albans, VT). La pompa si trova su uno scaffale appena fuori dalla camera operante, ma all'interno del suono attenuazione custodia. L'altra leva (la cosiddetta leva "inattiva") è lasciato esteso nella camera in tutte le procedure sperimentali; di rispondere su questa leva è senza conseguenze. Infine, ogni camera è attrezzata per fornire a corrente costante, intermittente, inevitabile, footshock elettrica attraverso una scrambler al pavimento tondino di acciaio. Tutte le condizioni sperimentali (per esempio, presentazioni stimolo, infusi di droga, l'erogazione di shock), così come la registrazione dei dati e il consolidamento, vengono eseguite tramite interfacce tra le camere di prova e di una centrale operativo del computer Med Associates software (MED-IV).

L'esperimento si svolge in 5 fasi: 1) L'abitudine, 2) La cocaina SA, 3) Drug-free periodo; 4) Estinzione, e 5) test di reintegrazione. In tutte le fasi (ad eccezione del periodo di drug-free), i ratti sono trasferiti per sessioni giornaliere dalla sala alloggiamento nelle camere di saggio operante. Gli animali vengono trasferiti individualmente, in piccoli contenitori di plastica. Cibo e acqua non sono disponibili nelle camere operante.

1. Assuefazione
   1. Ventiquattro ore che precedono la prima sessione di cocaina SA (. Vedi Sezione 3.2), i ratti possono abituare alle camere operante nel corso di una singola sessione di 2-h, durante questa sessione la leva attiva è retratto.
2. Cocaina SA formazione
   1. Prima di ogni sessione di allenamento quotidiano, i ratti sono pesati in sala alloggi. Successivamente vengono trasferiti alle camere operante.
   2. Al momento di essere immessi nelle camere operante, una molla e l'assemblaggio tubo (che si estende dalla pompa di infusione di farmaci) è collegata al cranio montato cannula.
   3. I ratti sono autorizzati ad auto-somministrarsi cocaina HCl per la durata giornaliera di 3 ore sedute, per un totale di 8-10 giorni (sia consecutivamente, sia intervenendo con due "giorni di riposo" tra le sessioni 5 e 6).
   4. Sessioni di SA si alternano tra la mattina (9:00-12:00) e pomeriggio (13:00-16:00). I tempi di SA sessioni si alternano, perché le procedure in fasi successive della sperimentazione (cioè l'estinzione e test) si sia tIME di giorno per tutti gli animali (cfr. sezioni 3.4 e 3.5); quindi, questa disposizione impedisce eventuali effetti confondenti del tempo del giorno successivo su un comportamento di ricerca della droga.
   5. Ogni sessione di allenamento è preceduto da un periodo di 5 minuti di ambientamento, durante il quale gli animali sono collocati nelle camere operante con la leva attivo retratto.
   6. All'inizio della sessione di allenamento, la leva attiva è estesa nella camera e la luce stimolo (che si trova sopra la leva attiva) viene illuminato per 30 secondi Inoltre, la luce casa è attiva in questo momento, e resta illuminato tutta la sessione. Insieme, questi eventi segnalare la disponibilità di cocaina.
   7. Durante la sessione, le risposte sulla leva attiva sono rinforzati da una 3-s infusione di cocaina (0,23 mg/65 microlitri, iv) su un rapporto fisso-1 programma di rinforzo. In concomitanza con l'attivazione della pompa di infusione e somministrazione di farmaci è una attivazione 20-s della luce sopra la leva di stimolo attivo. Questo 20-s presentazione luce corrisponde a un periodo di "time-out" durante il quale sono registrati ulteriori risposte leva attivo ma non armato.
   8. Gli animali sono ammessi un massimo di 50 infusioni per 3-ore di sessione. Noi abitualmente imporre questo criterio nel nostro lavoro e, nella nostra esperienza, hanno scoperto che riduce notevolmente, se non elimina, gli episodi di decessi dovuti a overdose.
   9. Alla fine di ogni sessione giornaliera, cateteri topi 'sono lavata con 0,2-0,3 mL di eparina-destrosio soluzione (vedi Sezione 2.2) ed i topi sono tornati alle loro gabbia casa.
3. Libera dalla droga periodo
   1. Dopo la sessione finale di cocaina SA, i ratti sono lasciati indisturbati (ad eccezione della normale pulizia, alimentazione, e il monitoraggio di peso) nella loro gabbia a casa per un minimo di sette giorni.
4. Estinzione di cocaina addestrati comportamento
   1. I ratti sono trasferiti alle camere operante tra 9:00-10:00 per la formazione estinzione.
   2. La primavera e l'assemblaggio tubo è collegato al cranio montato cannula.
   3. Coerente con le condizioni per la formazione SA, ogni giorno di allenamento estinzione è preceduta da un periodo di 5 minuti di ambientamento, durante il quale gli animali sono collocati nelle camere operante con la leva attivo retratto.
   4. I ratti sono poi dato quattro sessioni di 60 minuti estinzione, separate da intervalli di 30 min. Ogni 60 minuti di sessione è iniziata con gli stessi eventi che si verificano all'inizio di sessioni di formazione (ad esempio, l'illuminazione della luce casa, l'estensione della leva attivo, e 30-sec illuminazione della luce sopra la leva di stimolo attivo). Nel corso delle sessioni, tutte le condizioni che erano presenti durante l'allenamento SA sono mantenuti (vale a dire, la risposta-contingente illuminazione di luce stimolo per 20 secondi e 3-s attivazione della pompa di infusione), salvo che le risposte leva attivi non sono più rinforzati con infusioni di cocaina . Durante i 30 minuti di intervalli che separano ogni 60 minuti di sessione di estinzione, la leva attiva è retratto e la luce si spegne casa.
   5. Al termine degli ultimi 60 minuti di sessione, i ratti sono tornati alle loro gabbia casa.
   6. Passi 3.4.1. alla 3.4.5. sono ripetuti per 3 giorni consecutivi.
5. Ripristino di cocaina addestrati comportamento da stress footshock
   1. I ratti sono trasferiti alle camere operante tra 9:00-10:00
   2. Al momento di essere immessi nelle camere operante, la primavera e l'assemblaggio tubo è collegato al cranio montato cannula.
   3. Coerente con le condizioni per la formazione e l'estinzione, a 5 min periodo di acclimatazione è previsto, durante il quale i ratti sono disposti nelle camere operante con la leva attivo retratto.
   4. I ratti sono poi dato due sessioni di 60 minuti estinzione (vedi 3.4.4.) Separate da un intervallo di 30 minuti, identiche a quelle previste in fase di estinzione.
   5. Se dopo la seconda sessione di 60 minuti il ​​numero totale delle risposte sulla leva precedentemente attivo è inferiore a 15, gli animali sono un test per il reinserimento dopo un supplementare di 30 minuti di intervallo. In questo intervallo di 30 minuti, footshock o farsa footshock (cioè non footshock) viene somministrato (vedi 3.5.6.). Se un criterio di 15 o meno risposte sulla leva attiva non è stato raggiunto dopo la seconda sessione, una sessione supplementare estinzione (s) è dato prima del test di reintegrazione.
   6. Dieci minuti dopo la seconda sessione di 60 min di estinzione (o dopo altri 60 minuti di sessione di estinzione (s) necessario per stabilire il criterio di estinzione di 15 o meno risposte), gli animali sono esposti a 20 minuti di tensione intermittente footshock elettrica (o sham footshock) nella camera operante. Footshock è dato durante un periodo in cui la leva attiva è retratto e luci di casa e stimolo si estinguono. Footshock viene consegnato secondo un calendario variabile in un intervallo medio di 40 s (10-70 s range). Ogni shock è consegnato a una intensità di 0,9 mA, ed è di 0,5 s di durata. Questi parametri di footshock si basano sul lavoro pilota ampiasvolto nel nostro laboratorio per stabilire ripristino affidabile di cocaina alla ricerca, con l'intensità minima e la durata dell'esposizione footshock. Secondo questi parametri, gli animali mostrano una risposta riflessiva saltare al 0,5 s shock, e, occasionalmente, emettono un breve vocalizzazione. Anche se gli animali sono stati osservati durante il periodo di shock, l'intensità della scossa non sia di entità tale da indurre i segni più evidenti di disagio.
   7. Immediatamente dopo lo scioglimento della sessione footshock, la leva attiva è estesa e ratti sono autorizzati a leva di stampa in condizioni di estinzione (ad esempio, le risposte non sono rinforzati con la cocaina, ma ad una serie di illuminazione della luce stimolo e l'attivazione della pompa di infusione ). Questo periodo di tempo è definito come il test di reintegrazione e viene in genere 1-3 ore di durata. La maggior parte risponde avviene nella prima parte della sessione di test (primi 30 min-1 h), e si spegne in seguito periodi di test più estesi. Così, un 1 test h è sufficiente per cogliere l'effetto reintegrazione, con periodi di prova più lunghi fornendo un profilo di estinzione più completa l'effetto.
   8. Quando un disegno a misure ripetute è impiegato, ogni ratto è testato in condizioni footshock footshock e finzione. Passi 3.5.1. a 3.5.8 sono ripetuti in un giorno di test successivo, e il test alternativi di reintegrazione (o finto footshock footshock) viene somministrato.

4. Rappresentante dei risultati:

Figura 1. Profili stilizzati di risposta per l'attività sulle leve attivi e inattivi durante l'auto-somministrazione di formazione, l'estinzione, e test reintegrazione.

La Figura 1 presenta profili stilizzati di risposta operante, tipico di quelli ottenuti durante le varie fasi del protocollo sperimentale descritto nel presente documento.

1. Risposte leva attivo

1. La cocaina formazione SA. Figura 1 (riquadro a sinistra) mostra una tipica curva di cocaina formazione SA, che comprende sia il numero di infusioni e il numero totale delle presse a leva attiva. Ratti generalmente acquisiscono cocaina SA entro le sessioni 1-3 e, una volta che il comportamento è stabilito, mantenere un tasso stabile di assunzione del farmaco (tipicamente meno del 20% tra le sedute varianza) in sessioni successive.
2. Estinzione di cocaina addestrati comportamento. Lo si può vedere nella figura 1 (pannello centrale), che il giorno 1 di estinzione, quando le risposte non sono rinforzate per la prima volta, il numero totale delle risposte sulla leva attiva è inizialmente superiore al fine della fase di formazione (corrispondente ad una cosiddetta "esplosione estinzione"), gradualmente, nel corso delle quattro sessioni di estinzione, rispondendo diminuisce. Nei giorni 2 e 3 di estinzione, una certa ripresa di rispondere (rispetto a quella osservata durante l'ultima sessione del giorno precedente) si può osservare, tuttavia, le risposte sono in genere meno rispetto all'inizio del giorno precedente di estinzione, e in generale l'estinzione procede più rapidamente nel corso delle quattro sessioni per quel giorno.
3. Ripristino di cocaina ricerca. Lo si può vedere nella figura 1 (pannello di destra) che 20 minuti di esposizione al footshock intermittente induce un aumento non armato risposta sulla leva attivo, rispetto a quello osservato alla fine della sessione di estinzione precedente. Footshock induce anche un aumento nella risposta rispetto a quella osservata in condizioni in cui viene somministrato farsa footshock. Così, il ripristino di cocaina cercando da stress footshock può essere espressa come: 1) il maggior numero di risposte non armato dopo l'esposizione a footshock, rispetto alle risposte nella sessione di estinzione prima footshock o 2) il maggior numero di non armato dopo le risposte relative al footshock footshock farsa.

2. Risposte leva inattivo

Si può vedere in figura 1 (linea rossa) che, in tutte le fasi di sperimentazione, ci sono livelli di risposta molto bassi associati con la leva inattivo. Tuttavia, un modesto aumento di rispondere su questa leva è a volte osservata dopo l'esposizione allo stress footshock. Anche nei casi in cui tale aumento si verifica in risposta, l'aumento della leva attivo risposta tende ad essere proporzionalmente molto maggiore.

Discussione

Nel corso degli ultimi decenni, tre varianti della procedura di reintegrazione SA sono stati sviluppati per studiare ripristino della ricerca di droga in topi di laboratorio e nelle scimmie. Le differenze che definiscono le variazioni procedurali riguardano principalmente se farmaco SA, l'estinzione, e le sessioni di test avvenire entro lo stesso giorno o in giorni diversi ^1. La procedura che abbiamo descritto in questo articolo è comunemente indicato come il "dentro-tra" variazione della sessione, a causa della droga SA si verifica durante le sessioni al giorno (cioè, in una tra le sedute modo) che sono separati da estinzione e sessioni di test, ma l'estinzione e test avvengono nello stesso giorno (cioè, in una sessione in maniera) [ad ^{esempio, 7, 9].} In alternativa, nei cosiddetti "tra le sessioni di" procedure, tutte le fasi dell'esperimento si verificano in sequenza, in modo tale che SA, l'estinzione, e le sessioni di prova sono indicati in giorni diversi (per esempio, tutte le fasi sono tra le sessioni) [ad ^{esempio, 8, 10, 11].} Al contrario, in procedure complete "entro sessioni", formazione SA, l'estinzione, e tutte le sessioni di prova avvenire entro il giorno stesso [ad esempio, ^12].

Anche se ci sono rapporti pubblicati di footshock indotta ripristino della ricerca di droga utilizzando varianti differenti della procedura di reintegrazione, abbiamo trovato questo stress (almeno negli animali con una storia di cocaina SA) per essere più efficace quando l'estinzione e test verifica sullo stesso giorno (cioè, in un "dentro-tra" maniera sessioni). In alternativa, abbiamo avuto successo con l'ottenimento affidabile footshock indotta ripristino di cocaina cercando utilizzando una completamente "tra le sessioni" procedimento, ma solo in condizioni in cui gli animali sono ospitati nelle camere SA tutto l'esperimento ^8, o almeno durante l'estinzione e test ^13. Lo svantaggio di questo approccio tra-session, oltre che descritte nel presente protocollo, è che limita il numero di soggetti che possono essere addestrati e testati in una sola volta e, di conseguenza, diminuisce l'efficienza della raccolta dei dati. Anche se nelle condizioni del presente protocollo solo un gruppo di animali può essere estinto e testati in un dato momento, un volume superiore può essere ottenuto sconcertante di una settimana l'orario di inizio della fase di formazione SA per due gruppi di ratti. In questo scenario, un primo gruppo di ratti può entrare nella fase di drug-free come il secondo gruppo entra Settimana 2 di formazione SA, e, successivamente, l'estinzione e la sperimentazione può essere effettuata nel primo gruppo, mentre il secondo gruppo è nel suo farmaco senza fase. Questo approccio permette un uso più efficiente delle risorse e accelera la velocità di acquisizione dei dati, mentre conduce a molto efficace ed affidabile footshock indotta reintegrazione.

È importante sottolineare che nella nostra procedura, l'estinzione del comportamento precedentemente droga rinforzato e test di reintegrazione si verifica in presenza di stimoli associati al farmaco. Anche se non abbiamo mai hanno effettuato formazione estinzione o test in assenza di stimoli associati al farmaco, è la nostra comprensione, sulla base di comunicazioni personali, che il fattore di stress può infatti essere inefficace nell'indurre reintegrazione durante il test si verifica in assenza di spunti estinto ( almeno nel caso di animali con una storia di cocaina SA). Un esame sistematico di questa variabile, e le implicazioni teoriche che pone, è una domanda importante per la ricerca futura.

Un ultimo fattore procedurale che garantisce commento è che l'effetto dello stress sul ripristino footshock sembra essere molto sensibile alle manipolazioni di contesto. Per esempio, lo stress footshock è efficace solo per indurre il ripristino della ricerca di droga, se viene somministrato in un ambiente nel quale farmaco SA e l'estinzione si verificano, cioè, footshock non ripristinare ricerca di droga se l'esposizione al fattore stressante avviene in un contesto nuovo, suggerendo un importante interazione tra i fattori di stress e l'ambiente della droga nei suoi effetti sul ripristino ^14.

Nelle procedure footshock conclusione, reintegrazione, come quelli descritti in questo documento, sono stati impiegati con notevole successo di chiarire i meccanismi di base comportamentali e neurobiologiche che disciplinano il rapporto tra stress e ricadute farmaco. Infatti, queste procedure, se modificati per pre-trattamenti farmacologici o manipolazioni neurochimiche targeting specifici substrati neuronali, possono servire come potenti strumenti per la caratterizzazione della neurobiologia di ripristino di ricerca di droga da stress.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Basic Drug Self-Administration Test Package for Rat Package		Med Associates, Inc.	MED-008-CT-B1
Deep extra tall MDF sound attenuating cubicle	Basic Drug Self-Administration Test Package for Rat Package Component	Med Associates, Inc.	ENV-018MD
Standard modular test chamber with drug infusion top and waste pan	Basic Drug Self-Administration Test Package for Rat Package Component	Med Associates, Inc.	ENV-008CT
Stainless steel grid floor	Basic Drug Self-Administration Test Package for Rat Package Component	Med Associates, Inc.	ENV-005
House light, hooded, 28V	Basic Drug Self-Administration Test Package for Rat Package Component	Med Associates, Inc.	ENV-215M
Stimulus light 1” white lens	Basic Drug Self-Administration Test Package for Rat Package Component	Med Associates, Inc.	ENV-221M
Low profile retractable response lever	Basic Drug Self-Administration Test Package for Rat Package Component	Med Associates, Inc.	ENV-112CM
SmartCtrl 8 Input/16 output package	Basic Drug Self-Administration Test Package for Rat Package Component	Med Associates, Inc.	DIG-716P2
Single speed syringe pump, 3.33 RPM	Basic Drug Self-Administration Test Package for Rat Package Component	Med Associates, Inc.	PHM-100
Rat self infusion package	Basic Drug Self-Administration Test Package for Rat Package Component	Med Associates, Inc.	PHM-119B-23-D
Drug Delivery, Arm assembly	Basic Drug Self-Administration Test Package for Rat Package Component	Med Associates, Inc.	PHM-110-SAI
Square wave aversive stimulator	Footshock Stress Component	Med Associates, Inc.	ENV-414S
Patented quick disconnect harness for stainless steel grid floor	Footshock Stress Component	Med Associates, Inc.	ENV-005-QD
Shock output cable	Footshock Stress Component	Med Associates, Inc.	SG-219G-10
MED-PC IV Software	Software	Med Associates, Inc.	SOF-735