PGS elastomérico Andaimes em Engenharia de Tecidos Arterial

Resumo

Andaimes elastomérico PGS com células musculares lisas vasculares cultivadas em biorreator fluxo pulsátil pode levar a promissora construções de pequeno diâmetro arterial com a produção de ECM nativas em um período relativamente curto cultura.

Resumo

Doença cardiovascular é uma das principais causas de mortalidade em os EUA e, especialmente, a doença arterial coronariana aumenta com o envelhecimento da população e aumento da obesidade ^1. Atualmente, a cirurgia de bypass utilizando navios autólogos, enxertos e enxertos sintéticos são conhecidos como comumente usado para substitutos arterial ^2. No entanto, esses enxertos tem aplicações limitadas quando um diâmetro interno das artérias é menos de 6 mm, devido à baixa disponibilidade, complicações trombóticas, incompatibilidade de conformidade, e hiperplasia intimal final ^3,4. Para superar essas limitações, a engenharia de tecidos tem sido aplicado com sucesso como uma alternativa promissora para desenvolver construções de pequeno diâmetro arterial, que são não-trombogênica, robusto, e compatível. Vários estudos anteriores desenvolveram construções de pequeno diâmetro arterial com tri-estrutura lamelar, excelentes propriedades mecânicas e pressão de ruptura comparável ao artérias nativas ^5,6. Enquanto elevada resistência à tração e pressão de ruptura de colágeno, aumentando a produção de um material rígido ou camada de células andaime, essas construções ainda tinham a produção de elastina baixa e de conformidade, que é um problema grave para causar a falência do enxerto após o implante. Considerando essas questões, a hipótese de que um biomaterial elastometric combinado com o condicionamento mecânico daria elasticidade e conduzir sinais mecânicos de forma mais eficiente de células vasculares, que aumentam a produção de matriz extracelular e apoio de orientação celular.

O objetivo deste relatório é apresentar uma técnica de fabricação de materiais porosos andaimes tubulares e um condicionamento dinâmico mecânica de aplicação para a engenharia de tecidos arterial. Usamos um elastômero biodegradável, poli (sebacato glicerol) (PGS) ⁷ para a fabricação de andaimes tubular poroso a partir do método de fusão de sal. Adulto primário babuíno células musculares lisas (PMEs) foram semeadas na luz de andaimes, que cultivadas em nosso biorreator de fluxo pulsátil projetado para 3 semanas. PGS andaimes tinham uma espessura consistente e distribuídos aleatoriamente macro e micro-poros. Condicionamento mecânico de biorreator fluxo pulsátil apoiado SMC orientação e maior produção de ECM em andaimes. Estes resultados sugerem que andaimes elastomérico e condicionamento mecânica da cultura biorreator pode ser um método promissor para a engenharia de tecidos arterial.

Protocolo

1. Andaime Tubular Fabricação

1. Prepare tubos de vidro (comprimento = 70 mm, diâmetro externo = 9,0 mm, espessura da parede = 1,0 mm; peças pequenas, Miramar, FL) como um molde para andaime.
2. Prepare 1,0 wt / vol% ácido hialurônico (AH) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) pela dissolução de 100 mg de HA em 10 ml de água deionizada. Misture usando um rotator durante a noite até que não haja bolhas de ar na solução.
3. Despeje solução de HA de 1,0% no topo do tubo de vidro. Deixe-a fluir lentamente ao longo da parede interna do molde. Vire o tubo quando a solução atingiu o fundo do molde usando o rotator e repita este passo até que a parede interna do molde é revestido uniformemente pela solução.
4. Após o revestimento, seque todas as tubulações de vidro no forno a vácuo a 37 ° C por 24 h.
5. Moer e partículas de sal peneira (size = 25-32 mm) usado como porogens.
6. Montar um tubo de vidro (interior revestido com 1,0% HA solução), mandril (aço inoxidável revestido por tubo de PTFE), calor shrinkable luva (HS), e PTFE anel, conforme descrito anteriormente ^8.
7. Adicionar partículas de sal do tamanho desejado para o molde de vidro com uma espátula através do funil de borracha de silicone. Toque o molde com cuidado para assegurar uma distribuição uniforme de partículas de sal. Raspe as partículas excesso de sal na parte superior do molde usando o lado da espátula.
8. Ligue a hibridização incubadora por 30 minutos antes de transferir o molde de sal embalado. Desligue a hibridização incubadora e Coloque o sal-embalados molde para a hibridização incubadora para a fusão de sal.
9. Remove os moldes da hibridação incubadora e seque-as no forno a vácuo a 37 ° C por 24 h.
10. Remove os moldes de sal-embalados do forno a vácuo e deixe esfriar em temperatura ambiente. Remova o mandril de aço inoxidável, empurrando-a para baixo com segurando o anel PTFE. Se o mandril é demasiado apertado para o molde, use o alicate para puxá-lo para fora. Remova o anel de PTFE a partir do fundo do molde.
11. Coloque os moldes no forno a 120 ° C por 5 min para termoencolhíveis HS. Verificar se a luva HS é encolhido. Remova a luva HS a partir dos moldes de sal embalado e deixe esfriar em temperatura ambiente. Manter os moldes para o exsicador até que eles são usados.
12. Prepare a solução PGS dissolvendo 3 g de PGS em 15 ml de tetraidrofurano (THF) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) para formar um wt 20 / vol solução%.
13. Adicionar a solução PGS para o lúmen de sal-embalados moldes, largando-o usando um spoid na capa hume. Magra o molde de vidro cerca de 45 ° e soltar a solução PGS em lúmen interno com rotação do molde lentamente. Verifique se a solução PGS flui para baixo ao longo da parede do molde. Se lugar seco é observado, adicione mais solução.
14. Após a adição da solução PGS, coloque os moldes no bairro hume por pelo menos 30 min para a evaporação THF.
15. Coloque os moldes no forno a vácuo para pré-determinado o tempo de cura (ex. 24/36 / 48 h) a 100 mTorr e 150 ° C para a PGS cura.
16. Após a cura, tire os moldes e colocá-los em temperatura ambiente para esfriar. Dip cada molde para a água deionizada com posição vertical lentamente. Não mergulhe-os na água rapidamente, porque as bolhas de ar podem causar desgaste ao cadafalso.
17. Transferir os moldes para o banho de água com cuidado e coloque-os em um ângulo de 1 h usando tubo de silicone para dissolver HA facilmente. Verifique se HA é dissolvido a partir do molde. Se não HA é liberado a partir do molde, empurre a uma extremidade do andaime lentamente usando a espátula para soltá-la do molde. Repita este passo na outra extremidade do andaime e agitar o molde e para trás lentamente em banho-maria. Verifique se o andaime é movido dentro do molde.
18. Transferir o andaime para outro banho-maria com agitador com cuidado. Não pegue o andaime firme, o que pode rachar o cadafalso. Coloque o andaime no banho de água por pelo menos três dias com a mudança de água para lixiviar as partículas de sal.
19. Depois de lixiviação de partículas de sal, a transferência de cada cadafalso para o tubo de centrifugação de 15 ml preenchido com a água deionizada e coloque-os na caixa de gelo seco por 1 h para congelar. Colocar tubos de centrífuga para o liofilizador (todos os táxis do tubo devem ser abertas) e lyophilize-los durante 2 dias.
20. Coloque todos os andaimes para o dessecador antes até que elas são usadas.

2. Preparação para o cadafalso Seeding celular

1. Retire andaimes do exsicador e cortá-los até 25-30mm de comprimento.
2. Prepare duas rolhas de borracha de silicone (diâmetro = 20 mm, espessura da parede = 6,35 mm, diâmetro do furo do meio = 3 mm) e conectar dois tubos de PTFE (diâmetro externo = 3,97 milímetros, diâmetro interno = 2,38 milímetros, espessura da parede = 0,79 mm, comprimento = 60 mm e 40 mm) através dos furos meio de cada rolha.
3. Corte um anel como um HS 1.5 mm de comprimento e colocá-lo em cima de uma das extremidades do andaime. Empurrar um tubo de PTFE (ligado rolha de borracha de silicone) em uma extremidade de andaime como parte sobreposição menor possível.
4. Coloque o tubo de andaime e PTFE para o forno a 120 ° C por 10 min a encolher anel HS. Verifique se o anel de HS é encolhido e andaimes são conectados a tubagem de PTFE com firmeza.
5. Retire o tubo de andaime e PTFE e colocá-los em temperatura ambiente para esfriar. Coloque o conjunto tubo de andaime-PTFE para dentro do tubo de policarbonato (diâmetro externo = 15,5 mm, diâmetro interno = 9 mm, comprimento = 50 mm) como uma câmara de biorreator.
6. Conectar outro final de tubagem de PTFE para o cadafalso como passos 2.3) e 2.4).
7. Ajustar duas rolhas de borracha de silicone para fixar suas superfícies internas de ambas as extremidades do tubo de policarbonato. Prenda as duas superfícies externas de rolhas de borracha de silicone para duas placas de liga de alumínio (superior e inferior; width = 20 mm, comprimento = 70 mm, espessura = 6,35 mm). Coloque duas varas enfiadas no buraco do lado da placa e fixar o tubo de policarbonato (incluído o interior andaime) para placas apertando o parafuso porca polegar no prato.
8. Medir o comprimento de cada seedable andaime (comprimento entre dois anéis HS) e calcular a área da superfície interna (π x comprimento x diâmetro interior seedable) de cada andaime para a semeadura de células.
9. Enrole uma unidade de câmara de biorreator com papel alumínio e esterilizar em autoclave a 120 ° C por 30 min. Esterilizar cada parte (reservatório de meio, a tubulação da bomba, trocador de gás, manifolds, e válvula de agulha) do biorreator em autoclave a 120 ° C por 30 min e montá-los dentro do capô de cultura de células.
10. Pré-tratamento e enxaguar andaimes com uma série de perfusões (70, 50 e 25% de etanol para 1 h, tampão fosfato (PBS; Mediatech, Herndon, VA) por 2 h, e meio de cultura SMC por 24 h, utilizando uma bomba peristáltica em 1,0 ml / min no circuito de fluxo.

3. Seeding celular e Cultura

1. Isolar arterial primária células musculares lisas (PMEs) das artérias carótidas de juvenis de babuínos machos (Papio anubis) e caracterizá-los em duas dimensões da cultura (2D) antes passaging e semeadura, como descrito anteriormente ^9.
2. Expandir SMCs usando o MCDB 131 médio (Mediatech, Herndon, VA) com 10% de soro fetal bovino (Lonza, Walkersville, MD), 1% de L-glutamina (Mediatech), 50 mcg / ml de ácido ascórbico (Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ), e uma solução antibiótica-antimicótica (10.000 UI / ml de penicilina, 10.000 mg / ml, estreptomicina e 25 mg / ml anfotericina B; Mediatech).
3. Retire cada câmara biorreator do circuito de fluxo no biorreator. SMCs semente (passagem 4-6) para o cadafalso com uma densidade de 2x10 ⁶ células / cm ² através da injeção de suspensão com 5 ml no lúmen de andaimes, após cortar os abluminal (entrada) e luminal (saída) os fluxos.
4. Coloque todas as câmaras de biorreatores para a hibridização incubadora a 37 ° C e gire-a 2 rpm por 4 h para permitir que as células a se espalhar uniformemente no cadafalso.
5. Retire câmaras biorreator da hibridação incubadora anexá-los ao fluxo de circuito do biorreator na capa. Transferência de todo o sistema de cultura de células em biorreatores incubadora.
6. Conecte a tubulação da bomba (diâmetro interno = 1,6 mm) para a cartilagem da bomba peristáltica e carregar meio de cultura novo no reservatório. Iniciar a perfusão através de parede (luminal para abluminal) em 1,0 ml / min para 15 min seguido de fluxo luminal só.
7. Aumentar a taxa de fluxo e pressão gradualmente a partir de 1,0 ml / min (estresse de cisalhamento luminal: 1.1 dinas / cm ²⁾ e 20 mmHg no dia 1-14,2 ml / min (15,3 dinas / cm ²⁾ e 120 mmHg no dia 21, respectivamente. Alterar a tubulação da bomba (diâmetro interno = 3,2 mm) no dia 4 e meio uma vez por semana.

4. A colheita de tecidos e Preparação de Amostras para Análise

1. Após o cultivo de 21 dias, parar a bomba e tubulações braçadeira (entrada e saída) do reservatório de médio porte. Separar a tubulação da bomba a partir da cartilagem da bomba peristáltica e um sistema de biorreator transferência para o capô.
2. Braçadeira de entrada e tubulações de saída de cada câmara de reactores biológicos e retirá-la da alça fluxo. Abra o tubo de admissão e preparar um prato de petri-na tubulação de saída para coletar meio de cultura no interior do tubo de policarbonato. Abrir a tubulação de saída de forma lenta e remova a mídia da câmara.
3. Separar agulha abluminal e tubos de silicone luminal da câmara e retire placas de alumínio, liberando parafusos. Retire o tubo de policarbonato e retire uma das extremidades do tecido construção da tubulação de PTFE.
4. Prepare um prato de petri preenchida com 10 ml de PBS e retire outro lado da construção da tubulação de PTFE. Coloque construir no PBS e lavar três vezes.
5. Corte a construir com uma lâmina de barbear como 5 mm de comprimento. Congelar a -80 ° C para o congelador bioquímica ou transferi-lo para 15 tubo de centrifugação ml preenchida com 5 ml de meio fresco para testes mecânicos ou congelar encaixem no composto temperatura Tissue-Tek ideal de corte (Sakura Finetek Inc., Torrance, CA ) para histologia / immunoflucoloração orescence.

5. Resultados representativos:

Os andaimes tubular PGS foram confeccionadas em elastômeros biodegradáveis ​​pelo método de sal de fusão (Fig. 1A). Cada câmara biorreator desde andaimes com os fluxos tanto luminal e abluminal e poderia ser destacado como uma unidade separada de um loop de fluxo principal (Figura 1B). Biorreator sistema foi projetado para cultura quatro andaimes de uma vez por meio do controle e monitoramento de fluxo, bem como a pressão (Fig. 1C e D).

Esquemática da cultura biorreator foi mostrado na figura. 2. Após a semeadura SMCs, cada câmara biorreator foi rodado a 37 ° C por 4 h para distribuir uniformemente as células no lúmen do andaime. E, em seguida, o fluxo pulsátil foi aplicado para andaimes até o dia 14 com taxa de fluxo aumentando gradualmente (Fig. 2A) e pressão (Fig. 2B). Após o dia 14, o fluxo ea pressão mantida constante até o final da cultura (dia 21).

Morfologia da superfície do andaime PGS foi examinada por microscopia eletrônica de varredura (MEV). Microscopia eletrônica de varredura mostrou que andaime tinha parede consistente espessuras (539 ± 18 mm) (Fig. 3A) e distribuídos aleatoriamente macro e micro-poros na superfície luminal (Fig. 3B). Parâmetros morfométricos do andaime foi medido a partir microcomputed tomografia (micro-CT) e análise de imagem. Tamanho dos poros média é de 23,3 ± 3,9 mm e interconectividade dos poros é 99,4 ± 0,62%, o que significa que todos os poros estão totalmente interligados em andaime. Porosidade medidos pelo deslocamento de etanol é de 75,6 ± 2,7%.

Morfologia celular da construção PGS foi examinado por MEV (Fig. 4). SMCs multicamadas completamente coberto a superfície luminal e eles foram orientados perpendicularmente ao sentido do fluxo. Estes resultados mostram que o condicionamento mecânico de biorreator fluxo pulsátil suporta orientação SMC no cadafalso.

A presença de matriz extracelular (ECM) e fibras elásticas foram examinadas por H & E e coloração autofluorescência elastina (Fig. 5). Coloração H & E demonstraram que as células e proteínas ECM completamente coberto do lúmen do PGS construir. Elastina autofluorescência também mostrou organizadas circunferencialmente fibras elásticas na superfície luminal do construto. Produção de proteínas ECM em construções PGS foram medidos a partir ensaios bioquímicos. A elastina e conteúdo de colágeno insolúvel foram 20,2 ± 9,1 mg / mg de tecido e de 6,3 ± 1,9 mg / mg de tecido, respectivamente.

Figura 1. Scaffold fabricação e sistema de biorreatores. (A) Esquema de andaime tubular de fabricação. (B) da câmara biorreator. Andaimes foram conectados a tubagem de PTFE, colocadas dentro do tubo de policarbonato, e fixado por rolhas de borracha de silicone e placas de liga de alumínio. Cada câmara tem dois caminhos de fluxo: fluxo luminal (por tubo de silicone) e abluminal (por agulha). (C) sistema de biorreator colocado dentro da incubadora. Inclui reservatório de meio, módulo de bomba peristáltica, trocador de gás, transdutores de pressão, dois manifolds (superior e inferior), e válvula de agulha. (D) sistema de biorreator colocado fora da incubadora. Ele inclui monitor de pressão, unidade de controle de fluxo, dados do sistema, aquisição e computador.

Figura 2. Esquemática da cultura biorreator. (A) protocolo de Cultura. (B) Aplicada perfis de pressão em cada ponto do tempo (dia 1, 4, 7 e 14).

Figura 3. Morfologia da superfície do andaime PGS. (A) Corte transversal. (B) Lumen.

Figura 4. Morfologia celular da PGS construir. (A) Lumen. (B) Seção transversal de corte 45 °. Setas em ambos os números representam a direção do fluxo.

Figura 5. Histologia e elastina autofluorescência do PGS construir. (A) coloração H & E. (B) autofluorescência elastina correspondentes. L: lúmen. Ampliação: 40X. Barra de escala: 50 mm.

Discussão

A técnica de fabricação utilizando um elastômero biodegradável descrito aqui tem várias características. (1) Foi utilizado ácido hialurônico (HA) como uma desmoldagem. Desde HA é solúvel em água, andaime foi facilmente liberado do molde de vidro após imersão em água. Neste relatório, foram utilizados 1,0% wt / vol de solução de HA, porque baixa concentração (<0,5% wt / vol) de solução não é viscoso e flui tão rápido quando coloca-lo em cima do tubo de vidro. Para solução de HA revestimento uniforme, que virou o tubo de vidro quando a solução voou baixo na parte inferior do tubo e repetiu esta etapa. Este revestimento HA é uma crítica ao nosso procedimento de fabricação para liberar andaimes final. (2) Usamos calor shrinkable luva (HS) para a retenção de sais no tubo de vidro. Desde sais foram densamente no espaço entre a parede interna do tubo de vidro ea luva HS, manga HS sais retidos após a remoção do mandril eo anel de PTFE no fundo da tubulação. Poderíamos remover manga HS facilmente colocando o molde em um forno a 120 ° C por 5 min, e então obter modelos sal tubular. (3) Foi utilizado o método de fusão de sal. É sabido que o método de fusão de sal pode aumentar a interconectividade dos poros e propriedades mecânicas, variando o tempo de fusão ^10. Além disso, como usamos PGS, macro-poros foram produzidas pelas partículas de sal durante o processo de lixiviação, enquanto a micro-poros foram provavelmente gerado por vapor glicerol formado durante PGS cura como descrito anteriormente ^11. Assim, este método tem um potencial para fabricar andaimes tubular poroso com macro e micro-estruturas diferentes, variando partículas de sal, bem como PGS cura condição.

O condicionamento mecânico do biorreator forneceu fluxo de perfusão pulsátil (média máxima de fluxo = 14 ml / min, tensão de cisalhamento máxima = 15,3 dina / cm ^2, freqüência = 0,5-1,7 Hz) e fisiologicamente pressão relevante com o andaime PGS, o que levou a SMC crescimento e orientação (Fig. 4). Estes resultados são consistentes com estudos anteriores relatórios que se estendem cíclico nessa freqüência e tensão de cisalhamento aumenta a proliferação SMC ^12, e ECM produção de proteína ^13,14. Além de SMC crescimento e orientação, PGS construir apoiado ECM produção de proteína, especialmente circunferencialmente organizado fibras elásticas (Fig. 5) dentro de 3 semanas de cultura no biorreator. Alguns estudos usando um andaime elastomérica como uma construção de pequeno diâmetro arterial têm demonstrado resistência mecânica e pressão de ruptura comparável ao artérias nativas ^15, SMC e integração rápida em andaimes compatível usando giratório frasco ^16,17, enquanto as fibras elásticas não foram encontrados nessas construções. Nossos resultados sugerem que a distensão cíclica radial do biorreator melhorou a transdução do sinal mecânico mais eficaz para PMEs no PGS andaime, o que provavelmente contribuiu para a síntese de elastina e organização.

Desde SMCs vasculares foram as únicas células que produzem proteínas ECM na nossa abordagem endotélio, repouso e melhorar a resistência mecânica são necessários para desenvolver uma clínica de sucesso pequeno diâmetro constrói arterial. Temos relatado que as células endoteliais co-cultivados com SMCs gerado uma monocamada confluente e expressão da proteína apoiado fenótipo em condições de nossa cultura e condicionamento mecânica ^9. Portanto, com base em nossa abordagem descrita aqui, modificação das condições de co-cultura experimento seria um próximo passo para melhorar as funções de construções resultantes e gerar não-trombogênica, robusto e compatível arterial construção semelhante às artérias nativas.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo
Sal sódico do ácido hialurônico	Sigma-Aldrich	H7630
Tetrahidrofurano	Sigma-Aldrich	401757
MCDB 131	Mediatech	15-100-CV
Soro fetal bovino	Lonza	BW14-502F
L-glutamina	Mediatech	25-005-CV
Ácido ascórbico	Fisher Scientific	A62-500
Antibiótico antimicótico solução	Mediatech	30-004-CI
Tampão fosfato salino (PBS)	Mediatech	21-031-CV
Tissue Tek compostos temperatura ideal de corte, 4583	Sakura Finetek	25608-930