Avaliação de Captação de nanopartículas em tumores em tempo real usando imagens intravital

Resumo

Nós apresentamos uma nova abordagem para quantificar a localização das nanopartículas na vasculatura de tumores humanos xenografted utilizando dinâmicas, imagens em tempo real intravital em um modelo embrião aviária.

Resumo

As tecnologias atuais para a imagem latente do tumor, como ultra-som, ressonância magnética, PET e CT, são incapazes de produzir imagens de alta resolução para a avaliação da absorção de nanopartículas em tumores em nível microscópico ^1,2,3, destacando a utilidade de um modelo adequado xenoenxerto em que para realizar análises detalhadas captação. Aqui, usamos imagens de alta resolução intravital para avaliar a absorção de nanopartículas em humanos xenoenxertos tumor em um modelo de embriões modificados, shell-less frango. O modelo de embrião de galinha é particularmente bem adequada para esses análise in vivo porque ele suporta o crescimento de tumores humanos, é relativamente barato e não requer cirurgia anestesiados ou 4,5. Células tumorais forma xenoenxertos totalmente vascularizado dentro de 7 dias quando implantados na membrana corioalantóide (CAM) ^6. Os tumores resultantes são visualizadas por não-invasivos de imagem em tempo real, de alta resolução que pode ser mantido por até 72 horas, com pouco impacto sobre o host ou sistemas de tumor. Nanopartículas com uma ampla gama de tamanhos e formulações administradas distal ao tumor podem ser visualizados e quantificados como elas fluem através da corrente sanguínea, extravasamento de vascularização tumoral com vazamentos, e se acumulam no local do tumor. Descrevemos aqui a análise de nanopartículas de derivados do vírus do mosaico do caupi (CPMV) decorado com infravermelho próximo corantes fluorescentes e / ou polímeros de polietileno glicol (PEG) ^{7, 8, 9,10,11.} Após a administração intravenosa, essas nanopartículas virais são rapidamente internalizados pelas células endoteliais, resultando em rotulagem global da vasculatura tanto fora como dentro do tumor ^7,12. PEGylation das nanopartículas viral aumenta sua meia-vida plasmática, estende seu tempo na circulação, e, finalmente, aumenta a sua acumulação nos tumores através da permeabilidade aumentada e efeito de retenção (EPR) ^{7, 10,11.} A taxa ea extensão da acumulação de nanopartículas em um tumor é medido ao longo do tempo usando o software de análise de imagem. Esta técnica fornece um método para tanto visualizar e quantificar a dinâmica de nanopartículas em tumores humanos.

Protocolo

1. Inoculação do tumor em CAM embrião aviária

1. Prepare shell-less embriões de galinha fertilizados, conforme descrito ^8.
2. No dia 9 do desenvolvimento embrionário, montar uma micro-injector utilizando uma agulha de calibre 18 conectada em uma seringa mL. Corte um pedaço 5-6 polegadas de tubo Tygon (1 / 32 "de diâmetro interior, 3 / 32" de diâmetro externo, 1 / 32 "a espessura da parede) e insira cuidadosamente bisel da agulha na tubulação. Aproximadamente 4-5 polegadas da tubulação deve estendem desde a ponta da agulha (Figura 1a).
3. Encha a seringa e tubo com suspensão de células. Em seguida, insira uma agulha de vidro microinjeção no final da tubulação e remova cuidadosamente as bolhas de ar.
4. Injetar Dia 9 embriões (Figura 1b), sob um escopo dissecção com um iluminador com 10.000-100.000 células do câncer como um bolo dentro do CAM (Figura 1c). Lentamente injetar células e cuidadosamente garantir que a agulha está no lugar correto para as células para formar um bolo visível dentro da CAM. Células que por gotejamento sobre a superfície CAM podem ser limpos utilizando aplicador Kimwipe ou outros.
5. Retorno embriões para incubadora umidificada a 38 ° C com umidade de 60% e permitir que o tumor cresça e irrigar (até 7 dias).

2. Preparação de nanopartículas

1. Para preparar nanopartículas fluorescente etiquetado CPMV para injecção no embrião de galinha; diluir as nanopartículas viral (sintetizado como ⁸ em PBS, pH 7,4, a uma concentração de 100 mg / ml mistura Vortex bem antes de usar e centrifugar por um minuto para remover qualquer. agregados Sonication. também pode ser útil dependendo conjugados e grau de agregação. Stocks de CPMVs fluorescente etiquetado são estáveis ​​por pelo menos 1 ano quando armazenado a 4 ° C no escuro. Verifique periodicamente ações, colocando algumas gotas numa lâmina de vidro e verificação de fluorescência. microscopia eletrônica de transmissão (TEM) também pode ser usado para determinar se as partículas permaneceram intactas após conjugação.
2. Resumidamente, um micrograma de nanopartículas viral (em um volume final de 2 mL) podem ser adicionados às redes de cobre revestido. Em seguida, adicione um volume igual de acetato de uranila 2% durante 1 minuto, microscópio eletrônico (Philips EM 410).

3. Injeção intravenosa de fluorescência marcado com nanopartículas viral

1. No dia 16, montar micro-injector, como descrito acima. Elaborar volume desejado de nanopartículas viral através do tubo para dentro da seringa (> mL 200). Remova cuidadosamente as bolhas de ar. Inserir a agulha de vidro microinjeção no final da tubulação. Assegurar que a agulha é tão longo e afilado possível (Figura 2a). Se a agulha estiver muito fechado, não será capaz de perfurar o ectoderma e deixará de penetrar no navio. Se a agulha estiver muito acentuado, a ponta entrará em colapso ao penetrar tecidos.
2. Por via intravenosa injetar 100 ml de 1 mg / ml de fluoresceína dextran (70.000 MW Da, Invitrogen) em embrião tendo tumor distal do site desejado a ser visualizado (Figura 3d). Canulação da veia CAM sucesso é evidente pela clearing de sangue no caminho do fluxo da injeção (Figura 2b). Avaliar vascular 1 hora após a injeção de vazamento.
3. Por via intravenosa injetar 50 ul de 1 mg / ml de solução de CPMV-Alexa Fluor 647 (CPMV AF-647) ou peguilado CPMV-Alexa Fluor 647 (CPMV-PEG-AF 647) em embriões com tumores com vazamento vascular distal do site desejado ser visualizados.
4. Tumores imagem imediatamente ea cada hora após a injeção usando uma Zeiss Examiner Z1 microscópio vertical equipado com um disco giratório Yokogawa, Hamamatsu Imagem 9100-12 câmera EM-CCD.

4. Em tempo real de imagens intravital

1. Para montar a unidade de imagem do embrião, aplique uma fina camada de graxa de vácuo em torno da circunferência do porto de imagem na parte inferior da tampa da unidade de imagem do embrião, e se encaixam uma lamela de vidro 18 milímetros para o porto.
2. Posição do embrião de tal forma que a lamela vai cobrir a área desejada para a imagem latente. Lentamente abaixe a tampa até que a lamínula só faz contato com o embrião, e então parafuso a tampa sobre a unidade para segurá-la no lugar (Figura 2c).
3. Adicione a água aquecida a 37 ° C para a unidade de imagem do embrião fora do prato contendo o embrião, e em seguida, coloque a unidade inteira para o palco de um microscópio confocal na vertical com o interior da câmara ambiental equilibrado a 37 ° C.
4. Unidade de posição da imagem contendo o embrião sob o Spinning microscópio de fluorescência confocal de disco (Figura 2e). A unidade de imagem irá realizar o embrião no lugar e manter o campo de visão, enquanto a captura de imagens fixas, permitindo a ambas as pilhas tridimensionais Z e lapso de tempo que as imagens sejam capturadas. Nós adquirir e analisar tridimensional lapso de tempo imagens usando Perkin Elmer (anteriormente Improvisation) Pacote de software Volocity (Figura 3a). Adquirir uma alta resolução tridimensional pilha do tumor e vascularização em torno de visualizar detailed análises estruturais específicas em tempo de pontos. Adquirir tridimensional pilhas em intervalos regulares de tempo, aponta para mapa detalhado mudanças estruturais na vasculatura tumoral. Tumores de imagem a cada hora após a injeção.
5. Quantificar a absorção de nanopartículas viral através do cálculo da média Alexa Fluor (AF) 647 sinal dentro de regiões selecionadas no tumor ou no estroma software quantificação (não-tumorais área) usando a imagem como Volocity (Perkin Elmer). O tumor de estroma proporção foi calculada dividindo a média AF 647 sinal no tumor sobre a média AF 647 sinal no estroma. A relação tumor / estroma maior que 1 indica que as nanopartículas está sendo tomada pelo tumor.

5. Resultados representativos:

No exemplo aqui descrito, injetamos HT-29 células de câncer de cólon para formar um bolo de aproximadamente 1 milímetro de tamanho dentro da CAM de embriões dia 9 de frango (Figura 1b). Após a inoculação, os embriões foram cultivados por 7 dias em uma incubadora umidificada para permitir o crescimento do tumor suficiente e vascularização (Figura 1c). Embriões foram injetados por via intravenosa com um baixo peso molecular dextran para confirmar a vascularização do tumor, e os tumores foram visualizadas ao microscópio Zeiss Z1 AxioExaminer vertical (Figura 2d).

Após a administração intravenosa de CPMV AF-647 ou CPMV-PEG-AF 647 nanopartículas (Figura 3a e b), de alta resolução em tempo real confocal de imagem (Figura 2e) revelou que tanto CPMV e CPMV-PEG nanopartículas rapidamente rotulados toda a vasculatura, mas a captação de CPMV-PEG pelo tumor foi de aproximadamente 3 vezes superior CPMV após 12 horas (Figura 3). A captação tumoral relativa de nanopartículas foi determinada utilizando software de análise de imagem (Volocity da Perkin Elmer). Regiões de interesse foram selecionados dentro e fora do tumor (no compartimento estromal) ea intensidade média de fluorescência de cada um era determinado. Os dados são expressos como tumor / estroma ratio.

Figura 1. Microinjeção de tumores no CAM de um embrião aviária. (A) O aparelho microinjeção é montado a partir dos componentes, como indicado. (B) os embriões das aves no dia 9 está pronto para ser inoculado com tumor quando o CAM tem se espalhado para cobrir toda a superfície. (C) No dia 16, o tumor terá crescido a até 1 cm de diâmetro (linha pontilhada) e está pronto para a injecção com nanopartículas.

Figura 2. Injeção de nanopartículas e imagem intravital. Injeção sob um microscópio de dissecação mostrando (a) a ponta da agulha microinjetor pronto para ser injetado na veia CAM e (b) a agulha microinjetor introduzida na veia (indicado pela seta) e nanopartículas injetadas no fluxo de sangue (visto limpando de sangue). (C) da unidade de imagem contendo embrião aviária com a lamela interface diretamente com o CAM. (D) Antes da injeção de nanopartículas, vascularização do tumor é avaliada através de imagens intravital após a injeção de fluoresceína dextran. (E) da unidade de imagem contendo o embrião posicionado no palco de um microscópio confocal na vertical dentro de uma temperatura regulada a clausura a 37 ° C.

Figura 3. Visualização intravital da captação de nanopartículas em tumores humanos. Tumores são visualizados sete horas após a injeção de (a) CPMV-AF647 e (b) CPMV-PEG-AF647. d) Excisão de tumor de embrião de aves para análise posterior.

Discussão

A membrana corioalantóide (CAM) do embrião aviária é um modelo útil para avaliar a dinâmica vascular e farmacocinética de tumores humanos. A estrutura ea posição do CAM permite a aquisição de imagem de alta qualidade e acomoda de muitos tipos de câncer xenoenxertos sem procedimentos cirúrgicos invasivos. Além disso, xenotransplantes tumorais do câncer implantados na membrana corioalantóide tornar vascularizado dentro de 7 dias, oferecendo um meio rápido, barato e semi-high-throughput para avaliar o acúmulo de nanopartículas no tecido tumoral. Desde xenoenxertos câncer implantado no CAM de embriões shell-less de frango são acessíveis para as ópticas de alta resolução de um microscópio de epifluorescência, na posição vertical ou confocal, a informação contextual e temporal em relação a captação de nanopartículas na vasculatura do tumor pode ser facilmente obtida. Xenoenxerto de câncer neste modelo tendem a crescer lateralmente através da CAM, resultando em tumores que são grandes, permanecendo menos de 200 m de profundidade. Isso os torna particularmente adequado para geração de imagens intravital por causa de epifluorescência microscópios padrão pode penetrar eficazmente a massa do tumor inteiro. Em contraste, os tumores implantados em ambos os sítios superficiais ou ortotópico dentro do rato proliferam em três dimensões, o que torna difícil localizar com precisão as nanopartículas profunda dentro desses tumores por técnicas não invasivas. Nós utilizamos este modelo para avaliar a aceitação de pontos quânticos, lipossomas, nanopartículas de óxido de ferro e em um número de xenotransplantes tumorais humanos, destacando o potencial para este modelo a ser apropriado para o análise in vivo de uma ampla gama de formulações de nanopartículas.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome reagente / Equipamentos	Companhia	Número Catálogo	Comentários
Ovos fertilizados leghorn	Frey `s Hatchery, St. Jacobs	N / A
Ferramenta rotativa Dremel	Dremel		Pode ser usado qualquer modelo
Rodas de corte Dremel não. 36	Dremel	409
Sportsman nascedouro	Berry Hill	1550HA
Sportsman incubadora	Berry Hill	1502EA
Etanol			70% (vol / vol)
Poliestireno pesar barcos	VWR	12577-01
Pratos quadrados Petri	Simport, VWR	25378-115
Rubbermaid recipiente com tampa de borracha	Guillevin	RH3-228-00-BLU	furos em lados
Vertical pipeta extrator	David Kopf Instruments	modelo 720	Settings: 16,3 (aquecedor) e 2,3 (solenóide)
Sódio tubos de vidro de borosilicato capilar	Instrumento Sutter	BF100-58-10	(OD, 1,0 mm; ID 0,58 milímetros; de 10 cm comprimento)
Modificado 1X Dulbecco Eagle Medium (DMEM)	Invitrogen	11995073
Dulbecco	Invitrogen	14190250	pH 7,4
Tampão fosfato (D-PBS) (1X), líquido
Tripsina, 0,05% (1X) com EDTA 4NA, líquido	Invitrogen	25300054
Soro fetal bovino	Invitrogen	12483-020	Calor inativar
Hemocitômetro	Hausser Scientific, VWR	15170-090
Centrifugador	Eppendorf modelo 5810R	5811 000.010
De ponta fina forceps	VWR	25607-856
Tygon R-3603 tubulação	VWR	63009-983	50 pés (diâmetro interno 1/32-inch, diâmetro externo 3/32-inch, espessura da parede 1/32-inch
Agulhas hipodérmicas para injectáveis ​​calibre 18 agulhas	BD	305195	Caixa de 100
1 ml seringas para injectáveis	BD	309602	Caixa de 100
Iluminador de fibra óptica de microscópio	Amscope	HL250-AY	150W
kimwipes	VWR	10805-905
Sementes de V. unguiculata (California preto olho-no. 5)	Burpee	51771A
Indoor luzes crescimento	SunLite, Abastecimento jardineiro
Metil-éster PEO4-NHS	Perfurar	PI22341
MPEG-NHS, PEG succinimidyl éster, MW 2000	NANOCS	PEG1-0002
Alexa Fluor 647 ácido carboxílico (succinimidyl éster)	Invitrogen	A20006
Oregon Verde 488 éster succinimidyl * 6-isômero *	Invitrogen	O-6149
Dimetilsulfóxido (DMSO)	Sigma	D8418
Dibásico monohydrogen fosfato	Sigma	379980	K2HPO4 (para buffer phopshate)
Monobásico dihidrogenofosfato		P5655	KH2PO4 (para buffer phopshate)
Superose 6 coluna de tamanho-exclusão	GE Healthcare ciências da vida	17-0673-01
AKTA Explorador 100 Cromatógrafo	GE Amersham Pharmacia	WS-AKTA100
AKTA kit de alto fluxo	GE Healthcare ciências da vida	18-1154-85
Sacarose	Sigma	S0389
Ultracentrífuga	Beckman
SW 28 Ti rotor	Beckman	342204	Balde balanço
50,2 Ti rotor	Beckman	337901	Ângulo fixo
Amicon Ultra-15 Centrífuga Unidades Filtro	Millipore	UFC910008	100 kDa cortado
Gradiente de ex-	Biorad
dextran, fluoresceína, 70.000 MW, aniônicos	Invitrogen	D1823
Spinning microscópio de fluorescência confocal de disco	Quorum; Yokogawa CSU 10, Yokogawa	N / A
Microscópio de campo amplo de epifluorescência	Quorum; Zeiss Axio Examiner, Zeiss	N / A
Hamamatsu Imagem 9100-12 câmera EM-CCD	Quorum; Hamamatsu	N / A
Unidade de temperatura do compartimento para microscópio	Plásticos de Precisão	N / A
Graxa de vácuo	VWR	59344-055
Lamínulas de vidro circulares não. 1 (18 mm)	VWR	16004-300
Software Volocity	Perkin Elmer
Pinto gabinete embrião		fabricados sob medida
Tesoura delicada	VWR	25608-203
Formalina	Bioshop	FOR201.500	Uso em fumehood
Corte ideal	Fisher; Tissue Tek	1437365
Temperatura (OCT)
Moldes de plástico	Pescador	22-038217
VWR VistaVision HistoBond Adhesive Slides	VWR	16004-406
Prolongar a ouro com DAPI	Invitrogen	P36931
Lâminas descartáveis ​​para criostato	Pescador	12-634-2
Criostato	Leica CM 3050 S	14047033518