Intravital Görüntüleme Gerçek Zamanlı tümörler Nanopartikül Alımı Değerlendirme

Özet

Biz bir kuş embriyo modeli dinamik, gerçek zamanlı intravital görüntüleme kullanarak insan xenografted tümörlerin vasküler nanoparçacık yerelleştirme ölçmek için yeni bir yaklaşım sunuyoruz.

Özet

Mevcut teknolojiler gibi ultrason, MR, PET ve CT gibi tümör görüntüleme için uygun bir xenograftlarının modeli yararını ^{vurgulayarak,} mikroskobik düzeyde ^1,2,3 tümörleri nanoparçacık alımını değerlendirilmesi için yüksek çözünürlüklü görüntüler veremezken Ayrıntılı alımı analizleri yapmak için hangi. Burada, değiştirilmiş bir kabuk, tavuk embriyo modeli insan tümör xenografts nanoparçacık alımını değerlendirmek için, yüksek çözünürlüklü intravital görüntüleme kullanın. Tavuk embriyo modeli özellikle in vivo analizlerde, insan tümörlerinin büyümesini destekleyen, nispeten ucuz ve 4,5 anesthetization veya cerrahi gerektirmez, çünkü bunlar için iyi uygundur . Chorioallantoic membran (CAM) ⁶ içine implante Tümör hücreleri, 7 gün içinde tamamen vaskülare xenografts oluşturur . Ortaya çıkan tümörler, ya ev sahibi veya tümör sistemleri üzerinde çok az etkisi ile 72 saate kadar korunabilir non-invaziv, gerçek zamanlı, yüksek çözünürlüklü görüntüleme tarafından görüntülenmiştir. Tümör distal uygulanan boyutları ve formülasyonları geniş bir yelpazesi ile Nanopartiküller görüntülenebilmekte ve kan yoluyla akışı gibi sayısal olabilir, sızdıran tümör damarsal extravasate ve tümör yerinde biriken. Biz burada, yakın-kızılötesi floresan boyalar ve / veya polietilen glikol (PEG) ^{polimerler 7, 8,} 9,10,11 süslenmiş Börülce mozaik virüsü (CPMV) türetilen nanoparçacıkların analizi açıklanmaktadır . Intravenöz üzerine, bu viral nanopartiküller dışında damar küresel etiketleme ve tümör ^7,12 içinde hızla endotel hücreleri tarafından içselleştirilmiş. Viral nanopartiküller PEGylation plazma yarılanma ömrü artırır, kan dolaşımını zamanlarını uzatır ve sonuçta gelişmiş geçirgenlik ve retansiyonu (EPR) etkisi ^{7, 10,11} ile tümörlerin birikimi artırır. Görüntü analiz yazılımı kullanarak bir tümör nanoparçacıkların birikimi hızı ve kapsamı zamanla ölçülür. Bu teknik, hem de görselleştirmek ve insan tümörlerinde nanoparçacık dinamiklerini ölçmek için bir yöntem sağlar.

Protokol

1. Kuş embriyo CAM içine tümör Aşılama

1. Kabuk az döllenmiş tavuk embriyolar ⁸ açıklandığı gibi hazırlayın.
2. Embriyonik gelişim Gün 9, 1 ml şırınga üzerine bağlı 18-gauge iğne kullanılarak bir mikro enjektör montajı. 5-6 inç Tygon boru (1 / 32 "iç çapı, 3 / 32" dış çapı, 1 / 32 "duvar kalınlığı) bir parça kesin ve tüp içine iğne konik dikkatlice yerleştirin. Tüp yaklaşık 4-5 cm iğne ucu kadar uzanır (Şekil 1a).
3. Hücre süspansiyonu ile şırınga ve tüp doldurun. Daha sonra, boru sonunda mikroenjeksiyon cam iğne takın ve dikkatli bir şekilde herhangi bir hava kabarcıkları.
4. Gün ışığı ile CAM (Şekil 1c) içinde bolus olarak 10,000-100,000 kanser hücreleri bir diseksiyon kapsamında 9 embriyolar (Şekil 1b) enjekte edilir. Hücreleri enjekte yavaş yavaş ve dikkatli bir iğne CAM içinde görünür bir bolus oluşturmak için hücreleri için doğru yerde olduğundan emin olun. Hücreler CAM yüzeye damla Kimwipe veya diğer aplikatör kullanılarak temizlenebilir.
5. % 60 nem ve 38 ° C'de nemlendirilmiş inkübatör embriyo dönün ve tümör izin büyümeye ve vascularize (7 güne kadar).

2. Nanoparçacıkların hazırlanması

1. Tavuk embriyo içine enjeksiyon için floresan etiketli CPMV nanopartiküller hazırlamak için; viral nanopartiküller (herhangi kaldırmak için kullanarak ve bir dakika boyunca santrifüj önce 100 mg / ml Vortex karışımı bir konsantrasyon, PBS, pH 7.4 ⁸ olarak sentezlenmiş sulandırmak toplar. Sonikasyon konjugatları ve agregasyon derecesi bağlı olarak yararlı olabilir 4 saklandığında floresan etiketli CPMVs stokları en az 1 yıl boyunca stabildir ° C karanlıkta bir çift koyarak stokları periyodik olarak kontrol edin bir cam slayt üzerine düşer ve floresan kontrol Transmisyon Elektron Mikroskobu (TEM) parçacıklar konjugasyon sonra değişmediğini belirlemek için kullanılır.
2. Kısaca, viral nanoparçacıkların bir mikrogram (2 ul nihai hacmi) bakır kaplı ızgaraları eklenebilir. Sonra, bir eşit miktarda elektron mikroskobu (Philips EM 410) az 1 dakika süreyle% 2 oranında uranil asetat ekleyin.

3. Floresan etiketli viral nanoparçacıkların İntravenöz enjeksiyon

1. 16 Gün, yukarıda açıklandığı gibi mikro enjektör montajı. Şırıngaya boru (> 200 mcL) ile viral nanoparçacık istenilen hacmi çizin. Herhangi bir hava kabarcığı dikkatlice çıkarın. Mikroenjeksiyon cam boru sonunda iğne takın. Iğne kadar uzun ve mümkün olduğunca konik (Şekil 2a) olduğundan emin olun. Iğne çok künt ise, ektoderm ile delmek için mümkün olmayacaktır ve gemi nüfuz başarısız olur. Iğne çok keskin ise doku nüfuz ederken, ucu çökecek.
2. İstediğiniz siteye distal tümör taşıyan embriyo haline intravenöz (Şekil 3d) görüntülenebilmekte 1 mg / ml flöresein dekstran (MW 70.000 Da, Invitrogen) 100 ul enjekte edilir. Başarılı CAM ven kanülasyonu enjeksiyon akış yolu kan temizleme (Şekil 2b) tarafından açıktır. Enjeksiyon sonrası vasküler sızıntı 1 saat değerlendirin.
3. İstediğiniz siteye distal vasküler sızıntı tümörleri içeren embriyolar halinde intravenöz CPMV-Alexa Fluor 647 (CPMV-AF 647) veya pegile CPMV-Alexa Fluor 647 (CPMV-PEG-AF 647) 1 mg / ml solüsyon enjekte 50 ul görüntülenebilmekte.
4. Görüntü hemen tümörler ve enjeksiyondan sonra bir Yokogawa dönen disk, Hamamatsu ImagEM 9100-12 EM-CCD kamera ile donatılmış bir Zeiss Examiner Z1 dik bir mikroskop kullanılarak her saat.

4. Gerçek zamanlı intravital görüntüleme

1. Embriyo görüntüleme birimi bir araya getirmek için, vakum gres embriyo görüntüleme ünitesi kapağın alt görüntüleme liman çevresinde ince bir tabaka halinde uygulayın ve liman üzerine 18 mm cam lamel uyacak.
2. Lamel görüntüleme için istediğiniz alanı kapsayacak böyle embriyo yerleştirin. Lamel yavaşça embriyo ile temas edinceye kadar kapağı düşük ve daha sonra birim üzerine kapağı vidalı bir yerde tutun (Şekil 2c).
3. Embriyo içeren çanak dışında embriyo görüntüleme ünitesi içine 37 ° C sıcak su ekleyin ve sonra 37 dengelenmiş içinde çevre odasına ° C ile dik bir konfokal mikroskop sahneye tüm birim
4. İplik disk konfokal floresan mikroskobu (Şekil 2e) altında embriyo içeren Pozisyon görüntüleme ünitesi. Görüntüleme ünitesi yakalanan üç boyutlu Z yığınları ve zaman atlamalı görüntüleri için izin, yer embriyo tutun ve görüş alanı yakalama görüntüleri ise sabit tutmak. Biz kazanmak ve Perkin Elmer (eski Doğaçlama) Volocity yazılım paketi (Şekil 3a) kullanarak üç boyutlu zaman atlamalı görüntüleri analiz. Tümörün üç boyutlu bir yığın yüksek çözünürlüklü ve detaile görselleştirmek için çevreleyen damar kazanmakd belirli bir zaman noktalarında yapısal analizler. Tümör damarsal ayrıntılı yapısal değişiklikler eşlemek için normal süre noktaları üç boyutlu yığınlar edinin. Görüntü tümörler her enjeksiyondan sonra saat.
5. Hesaplayarak ortalama Alexa Fluor (AF), tümör ya da böyle bir Volocity olarak stroma (non-tümör alan) kullanarak görüntü kantitatif yazılımı (Perkin Elmer) seçilen bölgeler içinde 647 sinyal alımını viral nanoparçacıkların Asitli. Stroma oranı tümör stroma ortalama AF 647 sinyal üzerinde tümörün ortalama AF 647 sinyal bölünmesi ile hesaplandı. Tümör / stroma oranı 1'den yüksek bir nanoparçacık tümörün alındığını olduğunu gösterir.

5. Temsilcisi sonuçları:

Örneğin burada anlatılan, biz günde 9 tavuk embriyolar (Şekil 1b) CAM içinde yaklaşık 1 mm boyutunda bir bolus oluşturmak için HT-29 kolon kanseri hücreleri enjekte etti. Aşılama sonra, embriyolar yeterli tümör büyümesi ve vaskülarizasyon (Şekil 1c) izin nemlendirilmiş bir inkübatör 7 gün süreyle kültüre edildi. Embriyolar tümör vaskülarizasyon onaylamak düşük molekül ağırlıklı dekstran ile intravenöz enjekte edildi ve tümörler Zeiss AxioExaminer Z1 dik mikroskobu (Şekil 2d) altında görüntülendi.

CPMV-AF 647 veya CPMV-PEG-AF 647 nanopartiküller intravenöz uygulamadan sonra (Şekil 3a ve b), yüksek çözünürlükte gerçek zamanlı konfokal görüntüleme (Şekil 2e) CPMV ve CPMV-PEG hızla tüm damarsal etiketli nanopartiküller saptandı, ancak tümör CPMV-PEG alımı (Şekil 3a) 12 saat sonra, CPMV daha yaklaşık 3 kat daha yüksek oldu. Nanoparçacıkların nispi tümör alımı, görüntü analiz yazılımı (Perkin Elmer Volocity) kullanılarak tespit edildi. Tümör içinde ve dışında ilgi Bölgeler seçildi (stromal bölmesi) ve her birinin ortalama floresan yoğunluğu tespit edilmiştir. Veri tümör / stroma oranı olarak ifade edilir.

Şekil 1 bir kuş embriyo CAM içine tümörlerin Mikroenjeksiyon. Belirtildiği gibi (a) mikroenjeksiyon cihaz bileşenleri bir araya. (B) 9 gün Kuş embriyolar CAM tüm yüzeyini kapsayacak şekilde yayıldı tümör ile aşılanmış olmak için hazırız. (C) 16 gün, tümör çapı 1 cm (kesikli çizgi) kadar büyüdü ve nanopartiküller ile enjeksiyon için hazır olacak.

Şekil 2 Nanopartikül enjeksiyon ve intravital görüntüleme. Gösteren bir diseksiyon mikroskop altında enjeksiyon (a), (temizleyerek görülen CAM damar içine enjekte edilir ve (b) mikroenjektör iğne kan akımı enjekte nanopartiküller damar içine eklenir (ok ile gösterilir) ve hazır mikroenjektör iğne ucu kan). (C) Görüntüleme birimi lamel CAM ile doğrudan arabirim ile kuş embriyo içeren. (D) nanoparçacık enjeksiyon öncesinde, tümör vaskülarizasyon floresein dekstran enjeksiyondan sonra intravital görüntüleme ile değerlendirildi. (E) Görüntüleme Ünitesi, 37 ° C sıcaklığa ayarlı muhafaza kümesi içinde dik bir konfokal mikroskop sahnede yer embriyo içeren

Şekil 3 insan tümörlerinde nanoparçacık alımı intravital görselleştirme. Tümörler (a) CPMV-AF647, (b) CPMV-PEG-AF647 enjeksiyonundan 7 saat sonra görüntülenir. d) sonraki analiz için kuş embriyo tümör eksizyonu.

Tartışmalar

Kuş embriyo chorioallantoic membran (CAM), vasküler dinamikler ve insan tümörlerinde farmakokinetiği değerlendirmek için kullanışlı bir modeldir. CAM yapısı ve konumu, yüksek kalitede görüntü elde etme sağlar ve invaziv cerrahi prosedürler olmaksızın birçok türde kanser xenografts barındırmaktadır. Ayrıca, kanser tümörü xenografts, tümör dokusu nanoparçacıkların birikimi değerlendirmek için hızlı, ucuz ve yarı-yüksek verimlilik anlamına gelir sunan, 7 gün içinde vaskülarize haline chorioallantoic membran yerleştirilir. CAM kabuk az tavuk embriyoların implante kanser xenografts tümör damarsal nanoparçacık alımı ile ilgili bir dik Epifloresans veya konfokal mikroskop, bağlamsal ve zamansal bilgiler yüksek çözünürlüklü optik erişilebilir olduğundan kolayca elde edilebilir. Bu modelde Kanser xenografts az 200 m derinlikte kalarak büyük tümörlerde, CAM üzerinde yanal büyümek eğilimindedir. Standart Epifloresans mikroskopları tüm tümör kitlesi etkin bir şekilde nüfuz eder, çünkü bu, onları özellikle iyi intravital görüntüleme için uygun hale getirir. Buna karşılık, fare içinde yüzeyel veya ortotopik siteleri ya implante tümörler zor non-invaziv teknikleri ile bu tümörler içinde derin nanopartiküller doğru lokalize etmek, üç boyutlu olarak çoğalırlar. Biz geniş bir yelpazede nanoparçacık formülasyonların in vivo analizi için uygun olduğu için bu model için potansiyel vurgulayarak, kuantum noktaları, lipozomlar ve demir oksit, insan tümör xenografts bir dizi nanopartiküller alımını değerlendirmek için bu model kullanılır.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reaktif Adı / Ekipman	Şirket	Katalog Numarası	Yorumlar
Döllenmiş leghorn yumurta	Frey `ın Kuluçkahane, Jacobs	N / A
Dremel döner aracı	Dremel		Herhangi bir model kullanılabilir
Hiçbir Dremel kesme tekerlekleri. 36	Dremel	409
Sporcu çıkım	Berry Hill	1550HA
Sporcu inkübatör	Berry Hill	1502EA
Etanol			% 70 (hacim / hacim)
Polistiren tekneler tartmak	VWR	12577-01
Kare Petri kutularına	Simport, VWR	25378-115
Rubbermaid kauçuk konteyner kapaklı	Guillevin	RH3-228-00-BLU	delik tarafı içine delinmiş
Dikey pipet çektirmesi	David Kopf Aletleri	modeli 720	Ayarlar: 16.3 (ısıtıcı) ve 2.3 (solenoid)
Sodyum borosilikat camdan kılcal tüpler	Sutter Enstrüman	BF100-58-10	(OD, 1.0 mm; ID 0.58 mm, 10 cm uzunluk)
1X Dulbecco'nun Modifiye Kartalı Medium (DMEM)	Invitrogen	11995073
Dulbecco'nun	Invitrogen	14190250	pH: 7.4
Fosfat Tamponlu Salin (D-PBS) (1X), sıvı
Tripsin, EDTA 4NA% 0,05 (1X), sıvı	Invitrogen	25300054
Fetal sığır serumu	Invitrogen	12483-020	Inaktive Isı
Hemasitometre	Hausser Bilimsel, VWR	15170-090
Santrifüj	Eppendorf modeli 5810R	5811 000.010
İnce nokta forseps	VWR	25607-856
Tygon R-3603 tüp	VWR	63009-983	50 ft (1/32-inch iç çapı, dış çap, 3/32-inch 1/32-inch duvar kalınlığı
Enjeksiyonları 18-gauge iğne için derialtı iğneler	BD	305195	100 Kutu
Enjeksiyon için 1 ml şırınga	BD	309602	100 Kutu
Fiber-optik mikroskop aydınlatıcı	Amscope	HL250-AY	150W
Kimwipes	VWR	10805-905
V. unguiculata tohumları (California siyah-gözü 5)	Burpee	51771A
Kapalı büyüme ışıkları	Sunlite, Gardener'ın Kaynağı
Metil-PEO4 NHS ester	Delmek	PI22341
MPEG-NHS, PEG succinimidyl ester, MW 2000	NANOCS	PEG1-0002
Alexa Fluor 647 karboksilik asit (succinimidyl ester)	Invitrogen	A20006
Oregon Yeşil 488 succinimidyl ester * 6-izomeri *	Invitrogen	O-6149
Dimetil sülfoksit (DMSO)	Sigma	D8418
Dibazik monohydrogen fosfat	Sigma	379980	KH2PO4 (phopshate tampon)
Mono dihidrojen fosfat		P5655	KH2PO4 (phopshate tampon)
Superose 6 boyut-dışlanma sütun	GE sağlık yaşam bilimleri	17-0673-01
Akta Explorer 100 Kromatografi	GE Amersham Pharmacia	WS-AKTA100
Akta yüksek akış kiti	GE sağlık yaşam bilimleri	18-1154-85
Sakaroz	Sigma	S0389
Ultrasantrifüjdeki	Beckman
GB 28 Ti rotor	Beckman	342204	Salıncak kova
50.2 Ti rotor	Beckman	337901	Sabit açılı
Amicon Ultra-15 Santrifüj Filtre Üniteleri	Millipore	UFC910008	100 kDa kesti
Gradient eski	Biorad
dekstran, floresein, 70.000 MW, anyonik	Invitrogen	D1823
İplik disk konfokal floresan mikroskop	Nisabı; Yokogawa CSU, 10, Yokogawa	N / A
Epifloresans geniş alan mikroskobu	Nisabı; Zeiss Axio Examiner, Zeiss	N / A
Hamamatsu ImagEM 9100-12 EM-CCD kamera	Nisabı; Hamamatsu	N / A
Mikroskop için sıcaklık muhafaza ünitesi	Hassas Plastik	N / A
Vakum gres	VWR	59344-055
Dairesel cam yok lamelleri. 1 (18 mm)	VWR	16004-300
Volocity yazılım	Perkin Elmer
Civciv embriyo muhafaza		özel imal
Hassas makas	VWR	25608-203
Formalin	Bioshop	FOR201.500	Fumehood olarak kullanın
Optimal Kesme	Fisher; Doku Tek	1437365
Sıcaklık (OCT)
Plastik kalıpları	Balıkçı	22-038217
VWR VistaVision HistoBond Yapıştırıcı Slaytlar	VWR	16004-406
DAPI ile altın Prolong	Invitrogen	P36931
Kriyostat için tek kanatlı	Balıkçı	12-634-2
Kriyostat	Leica CM 3050 S	14047033518