Preparação de amostras, Imaging, and Analysis Protocolos para Faca de ponta microscopia de varredura

Resumo

Todo o processo de preparação de amostras de imagens do cérebro para o seccionamento serial usando o microscópio de varredura Knife Edge, para visualização e análise de dados é descrito. Esta técnica é usada atualmente para adquirir dados cérebro do rato, mas é aplicável a outros órgãos, outras espécies.

Resumo

Grandes avanços no alto rendimento, alta resolução, técnicas de microscopia em 3D permitiram a aquisição de grandes volumes de dados neuroanatômicos na resolução submicrometer. Um dos primeiros instrumentos tais produzir todo o cérebro de dados em escala é o microscópio de varredura Knife Edge (KESM) ^{7, 5, 9,} desenvolvido e hospedado no laboratório dos autores. KESM tem sido usado para seção e cérebros imagem inteira do mouse em resolução submicrometer, revelando os detalhes intrincados das redes neuronais (Golgi) ^{1, 4, 8,} as redes vascular (tinta nanquim) ^{1, 4} e distribuição das células do corpo (Nissl) ³ . O uso de KESM não se restringe ao mouse nem o cérebro. Conseguimos imaged o cérebro do polvo ^6, pulmão do rato, e no cérebro de ratos. Estamos atualmente trabalhando em embriões de peixe zebra inteira. Dados como estes podem contribuir enormemente para a pesquisa conectonomia ^10; a microcirculação e pesquisa hemodinâmica; e pesquisar por estereologia providing um. exata chão verdade

Neste artigo, vamos descrever o pipeline, incluindo a preparação de amostras (fixação, coloração, e incorporação), KESM configuração e instalação, de corte e de imagem com o KESM, processamento de imagem, preparação de dados e visualização de dados e análise. A ênfase será sobre a preparação de amostras e visualização / análise de dados obtidos KESM. Esperamos que o protocolo detalhado apresentado neste artigo para ajudar a ampliar o acesso a KESM e aumentar a sua utilização.

Protocolo

1. Preparação de amostras: Golgi-Cox

1. Este protocolo segue de perto o protocolo de Mayerich et al. ^7.
2. O mouse C57BL/6J está profundamente anestesiados com anestesia inalatória com isoflurano e depois decapitado.
3. O cérebro é removido e colocado em uma solução de fixação Golgi-Cox (1% cromato de potássio, dicromato de potássio 1% e 1% de cloreto de mercúrio em água deionizada).
4. O cérebro é deixado na solução de Golgi-Cox no escuro, à temperatura ambiente, por 10 a 16 semanas.
5. Os cérebros são lavados em água deionizada durante a noite no escuro.
6. O cérebro lavado está imerso em solução a 5% de hidróxido de amónio em água deionizada por 7 a 10 dias no escuro à temperatura ambiente. Desta vez foi uma longa preparação para garantir a infiltração de todo o cérebro, para que o precipitado negro teve a chance de forma completamente no tecido.
7. O cérebro é lavado novamente em água deionizada à temperatura ambiente durante 4 horas e tgalinha desidratado através de uma série graduada de álcoois etílico: 50% e 70% na geladeira (4 ° C), e 85%, 95% (3 mudanças), e 100% (4-5 mudanças) em temperatura ambiente. O cérebro é deixado em cada solução por 24 horas.
8. O cérebro desidratado é então colocado em acetona (3 a 4 mudanças, cada um para um dia), seguido por uma mistura de araldite-acetona com araldite-to-acetona proporção de 1:2, 1:1, 2:1, e finalmente em 100% araldite (3 mudanças, cada vez que durante a noite), na geladeira (4 ° C).
9. Finalmente, o cérebro tratada é incorporado em araldite 100% e aquecido a 60 ° C durante 3 dias (cf. protocolo de incorporação, em Abbott e Sotelo ^2).
   Se as amostras são incorporados em LR White então as amostras são transferidas da solução de etanol últimos 100% por três mudanças de LR solução Brancos que estão cada mantido no frigorífico durante a noite, que é um procedimento padrão antes da polimerização. Três mudanças são feitas para garantir a infiltração completa. A amostra é tgalinha transferidos para nova LR Branca que é polimerizado em um recipiente fechado a 60 ° C por 24 horas, que é a quantidade necessária de tempo e temperatura para a polimerização adequada.
10. Fig. 1 mostra um cérebro Golgi-Cox manchada embutido em Araldite.
11. O bloco da amostra curada é, então, montado no anel espécime de metal usando epoxy, e os lados do bloco aparadas, conforme necessário (ver fig. 2).

2. Preparação de amostras: Nissl

1. O mouse está profundamente anestesiados com ketamina e xilazina (1,7 mg de cetamina / xilazina 0,26 mg por cada 20 gramas de peso corporal) por via intraperitoneal e então injetada perfundidos transcardially usando 50 mL de temperatura ambiente tampão fosfato (pH 7,4), seguido por 250 mL de quarto temperatura neutra a 10% tamponado (pH 7,4). e, finalmente, com 3,0 cc de tinta nanquim diluído.
2. Perfusão de corpo inteiro com solução salina e fixador é necessário para limpar o sangue do sistema cardiovascular e para fixar a ti ssues. Perfusão com tinta nanquim é necessário para encher completamente a vasculatura do sistema cardiovascular.
3. O cérebro resultante é então desidratado através de uma série de álcoois graduados etílico (25% -100%) e depois incorporados em plástico araldite seguindo o protocolo em 1,8-1,9 acima. Se LR branco é o meio de incorporação, em seguida, o protocolo em 1.10 acima é seguido.

4. Preparação de amostras: Espécies genéricas, órgãos genéricos

1. Para o caso genérico, a fixação pode ser feito tanto com paraformaldeído% 10% formalina tamponada neutra ou 4.
2. Para volumes pequenos de tecido, a difusão, em vez de perfusão é recomendada para fixação e coloração. No caso de pequenos organismos ou órgãos, coloração também pode ser feito durante o processo de desidratação.
3. O protocolo de incorporação é o mesmo que acima, embora os tempos de infiltração de solução pode ser reduzido para órgãos ou organismos que são muito menores do cérebro do rato inteiro.

jove_title "setup> 5. KESM e imagem

1. Desligue bomba, por sua vez no palco, por sua vez diante das câmeras, ligue iluminador.
2. Aumentar a faca e objetivo.
3. Instale o anel de amostra.
4. Dimensão medida exemplar e criar um arquivo de configuração para a aplicação Stage KESM Controller2.
5. Iniciar Stage KESM Controller2 e inicializar palco.
6. Inferior faca / objetiva, por sua vez na bomba.
7. Foco objetivo e câmera, girando o botão de focalização no trem óptica e ajuste de campo da câmera de vista em relação ao fio da navalha.
8. Pressione em [Continuar] para iniciar a imagem.
9. Ver Figs. 3-8. Veja ^{9, 7} de detalhes técnicos.

6. Processamento de imagem e preparação de dados

1. Copie o executável KESM Processor Stack para a pasta de dados sob a pasta arquivo de configuração (00000, 00001, etc.)
2. Execute o processador KESM Stack para remover artefato de iluminação e normalizar a intensidade de fundo em todas asimagens. Repita o procedimento para todas as subpastas de dados.
3. Prepare telhas multiescala a partir do conjunto de dados e fazer o upload e configurar os arquivos no servidor web KESM Cérebro Atlas.
4. Ver fig. 9.

7. De visualização de dados e análise

1. Visualização utilizando o Atlas Cerebral KESM. Ir para http://kesm.cs.tamu.edu e selecione o atlas apropriado.
   1. Navegar como no Google Maps.
   2. Zoom in e out como em mapas do Google.
   3. Para ir a uma profundidade diferente, selecione o quão profundo para ir a cada passo a partir do menu pull-down, e clique em qualquer [+] ou [-] para aumentar ou diminuir a profundidade z.
   4. Ajustar o número de sobreposição usando o menu suspenso.
   5. Ajustar o intervalo de sobreposição usando o menu suspenso.
   6. Ver fig. 11.
2. Visualização usando MeVisLab.
   1. Lançamento MeVisLab.
   2. Criar um novo projeto.
   3. A seguir, novos módulos podem estar criando por typing no nome do módulo na caixa de comando.
   4. Criar módulo [Compose3Dfrom2DFiles], e vá para a pasta desejada. Entra em seqüência arquivo e clique em [GetFileList]. Verifique se as imagens selecionadas podem caber na memória. Clique em [Create3D] para criar volume.
   5. Criar módulo [SetWorldMatrix], e definir a "escala" em "Elementary transformações" x, y, z para o tamanho apropriado voxel (0,6, 0,7, 1,0 para a objetiva de 10x 0.45NA). Link [Compose3Dfrom2DFiles] para [SetWorldMatrix].
   6. Conjunto de Matrix e transforma em "Composição Matrix" a "Ignore", "Ignorar", "Forward".
   7. Criar módulo [Arithmetic1] e defina o "Function" para "Inverter (Max-Img)".
      Link [SetWorldMatrix] para [Arithmetic1].
   8. Criar módulo [View3D] e ligar [Arithmetic1].
   9. Em View3D, enquanto o botão direito do mouse é pressionado, mova o mouse para ajustar o limite. Você pode cortar as regiões, mudança de orientação (mouse move enquanto o botão esquerdo do mouse é pressionado), iluminação mudança (renderin volume deg ou MIP), ligar / desligar de fundo, etc
   10. Ver fig. 10.

8. Resultados representativos:

Aqui, apresentamos todo o cérebro de dados e detalhes. Figos. 15/12 show inteiro do cérebro India Ink, Golgi, e os dados de Nissl sets ^{1, 4, 3.}

Figura 1. Cérebro de camundongo fixo, manchado, e incorporados

Figura 2. Espécime incorporado cérebro do rato montado no anel de amostra.

Figura 3. Microscópio de varredura The Knife Edge (KESM). Uma foto da KESM é mostrado com seus principais componentes marcados: (1) de montagem faca linha de alta velocidade scan-câmera, (2) objetiva do microscópio (3), diamante e colimador de luz, (4) speCimen tanque (para imagens de imersão em água), (5) três eixos de precisão palco ao ar-rolamento (6), iluminador microscópio de luz branca (7), bomba de água (nas costas) para a remoção do tecido seccionado, (8) servidor PC para controle de estágio e de aquisição de imagem (9), base de granito, e (10) ponte de granito.

Figura 4. Princípios de imagem do KESM. O diretor de operação da KESM é ilustrado. O objetivo ea faca é realizada no local, enquanto a amostra aposta no posicionamento move etapa (seta com linha sólida) na resolução de 20 nm ea velocidade de deslocamento de 1-5, e fica roçando a faca de diamante (5 mm de largura para objetiva de 10X), gerando uma seção fina que flui sobre a faca (seta com linha sólida). Linha-scan de imagens é feito perto da ponta da faca.

Figura 5. Câmera KESM e objetiva controles de foco.

Figura 6. KESM montagem faca e controles.

Figura 7. Foco inicial através da porta de observação.

Figura 8. KESM Controlador de Fase 2 do aplicativo (screenshot).

Figura 9. KESM processador de pilha (screenshot).

Figura 10. MeVisLab aplicação (screenshot).

Figura 11 KESM Cérebro Atlas:. Interface Web (screenshot).

Figura 12. KESM todo o cérebro dados tinta nanquim. Visualizações volume de pilhas de dados KESM são mostradas para o conjunto de dados vascular. (A) Close-up dos dados vascular. Largura ~ 100 um. (Bd) Três vistas padrão de toda a vasculatura cerebral do rato (subsampled de dados de alta resolução). Largura ~ 10mm.

Figura 13. KESM todo o cérebro dados do mouse Golgi.

Figura 14. KESM detalhes Golgi dados.

Figura 15. KESM todo o cérebro dados Nissl. (A) Close-up do Ndados ISSL. ~ Hum 300 ^3. (Bd) Três vistas padrão do conjunto de dados do mouse cérebro Nissl (subsampled de dados de alta resolução). Seção transversal mostrada para uma visão clara das estruturas internas.

Discussão

O KESM permite um levantamento submicrometer nível de grandes volumes de amostra biológica (~ 1 cm ^3). Este tipo de volume é suficiente para manter toda órgãos de animais pequenos, tais como cérebro, pulmões, corações, rins, etc digitalizadas imagens de órgãos como pode fornecer informações quantitativas sem precedentes sobre a organização estrutural destes órgãos, e permitir a modelagem computacional de funcionais diversas aspectos desses órgãos, incluindo circuito e de rede dinâmica, propriedades elétricas, fluida e dinâmica de fluxo de ar, ea dinâmica muscular.

O protocolo de preparação de amostras e análise pós-protocolo detalhado neste artigo são esperados para ajudar grupos de pesquisa de fora para ter acesso mais fácil ao KESM e os dados resultantes. O protocolo de operação KESM ajudará esses pesquisadores externos para apreciar os benefícios e limitações desta modalidade de imagem única.