Análise fenotípica e Isolamento de Células-Tronco Hematopoéticas Murino e Lineage comprometidos Progenitores

Resumo

Um método para analisar a distribuição de células progenitoras hematopoiéticas da medula óssea em citometria de fluxo, bem como para isolar eficazmente altamente purificados de células estaminais hematopoiéticas (HSCs) é descrito. O processo de isolamento é essencialmente baseado no enriquecimento de células magnética c-kit + e classificação celular para purificar HSCs para estudos celulares e moleculares.

Resumo

A medula óssea é o principal local onde HSCs e glóbulos mais maduros progenitores da linhagem residem e se diferenciar em um organismo adulto. HSCs constituem uma população de células minutos de células pluripotentes, capazes de gerar todas as linhagens de células do sangue para um tempo de ^vida-1. A dissecção molecular da homeostase HSCs na medula óssea tem implicações importantes na hematopoiese, oncologia e medicina regenerativa. Nós descrevemos o protocolo marcação com anticorpos fluorescentes e ao processo gating electrónico na citometria de fluxo para marcar subconjuntos progenitoras hematopoiéticas e distribuição HSCs em ratinhos individuais (Fig. 1). Além disso, nós descrevemos um método para enriquecer extensivamente progenitores hematopoiéticos, bem como a longo prazo (LT) e de curto prazo (ST) reconstituindo HSCs a partir do conjunto de osso suspensões de células de medula através de um enriquecimento magnética de células que expressam c-Kit. A preparação de células resultante pode ser usada para classificar os subconjuntos seleccionados para in vitro eOs estudos in vivo funcionais (Fig. 2).

Ambos os osteoblastos trabeculares ^2,3 e ⁴ endotélio sinusoidal constituem nichos funcionais de apoio HSCs na medula óssea. Vários mecanismos no nicho osteoblástico, incluindo um subconjunto de osteoblastos ⁺ N-caderina ³ e interação do receptor tirosina quinase TIE2 expressa em HSCs com sua angiopoietina-1 ligando ^cinco concorrem na determinação quiescência HSCs. "Hibernação" da medula óssea é fundamental para proteger HSCs de replicação e eventual exaustão sobre a atividade de ciclismo excessiva ^6. Estímulos exógenos que actuam sobre as células do sistema imune inato, tais como ligandos de receptores Toll-like ⁷ e interferão-a ⁶ também pode induzir a proliferação e diferenciação de HSCs em linhagem progenitores comprometidos. Recentemente, uma população de HSCs rato latentes dentro do lin ^- c-Kit ⁺ Sca-1 ⁺ CD150 ⁺ CD48 ^- CD34 ^{- A} população tem sido descrito ^8. Triagem de células com base em CD34 expressão a partir da suspensão de células hematopoiéticas progenitoras enriquecido como descrito aqui permite o isolamento de ambos quiescente auto-renovação LT-HSCs e ST-HSCs ^9. Um procedimento semelhante com base na depleção da linhagem de células positivas e triagem de LT-HSC com CD48 e Flk2 anticorpos foi previamente descrita ^10. No presente relatório, nós fornecemos um protocolo para a caracterização fenotípica e ex vivo análise do ciclo celular de células progenitoras hematopoéticas, que pode ser útil para monitorar a hematopoiese em diferentes condições fisiológicas e patológicas. Além disso, descrevem um procedimento para a triagem FACS HSCs, que podem ser utilizados para definir os factores e mecanismos que regulam a sua auto-renovação, expansão e diferenciação em biologia celular e os ensaios de transdução de sinal, bem como para o transplante.

Protocolo

1. Preparação de suspensão de células da medula óssea

1. Euthanize o mouse e colocar o animal em uma panela inoxidável e spray de etanol 70% em seu abdômen e nas costas. Colete fêmur e da tíbia das pernas traseiras e coluna vertebral.
2. Precisão remover todos os resíduos de tecidos moles da coluna vertebral com uma tesoura ponta afiada e das pernas ossos com uma gaze. Ossos loja em um tubo Falcon 50 mL com 30 mL de meio RPMI contendo 10% inactivado pelo calor de soro fetal bovino (FBS), suplementado com 50 mM β-mercaptoetanol, 100 iM MEM não-aminoácidos essenciais, 1 mM de piruvato de sódio MEM, 2 mM de L-glutamina, 100 ug / ml de estreptomicina e 100 U / ml de penicilina.
3. Cobrir o fundo de uma argamassa previamente esterilizado com filtros estéreis.
4. Transfira os ossos na argamassa e cobrir com uma camada de filtros, a fim de montar uma superfície de atrito.
5. Prepara-se uma 50 mL tubo Falcon fornecido com um filtro de Falcon.
6. Esmagar os ossoscom a ajuda de um pilão até a obtenção de uma suspensão de células homogéneas.
7. Transferir a suspensão dentro do tubo.
8. Adicionar ao mL argamassa 5 de meio RPMI fresco completo para lavar e colher as células restantes.
9. Repita os dois últimos pontos até os ossos aparecem homogeneizadas claro.
10. Transferir e filtrar num tubo novo a suspensão de células a fim de eliminar os detritos tecido restante.
11. Centrifugar o tubo a 1.500 rpm durante 5 min e cuidadosamente remover o sobrenadante por aspiração. Certifique-se de não perturbar o pellet celular.

2. Análise fenotípica

1. Ressuspender as células e lava-se de ratinhos individuais em 15 mL de PBS e FBS 2%.
2. Centrifugar o tubo a 1.500 rpm durante 5 min e cuidadosamente remover o sobrenadante por aspiração. Certifique-se de não perturbar o sedimento.
3. Suspender o sedimento em 5 ml de PBS e FBS 2% e contagem de células.
4. Transferência de 1 × 10 ⁶ células / poço em um fundo de poços 96 rodadaplaca.
5. Centrifugar a placa a 1500 rpm durante 5 min.
6. Prepara-se uma mistura de mAbs dirigidos contra os marcadores de superfície que se seguem. Diluir-los, como indicado em PBS e 2% de FBS para corar as células.
   • CD4, CD8, CD3, CD45R, CD19, Gr1, Ter119, NK1.1 conjugado com PE-Cy5 1:200
   • c-Kit conjugado a APC 1:100
   • SCA1 conjugado com biotina 1:50
   • CD34 conjugado com FITC 1:50
   • FcγR conjugado com PE 1:100
   • IL-7R conjugado com PE-Cy7 1:100
7. Descartar o sobrenadante e adicionar 50 uL de mistura de mAbs a cada poço. Dissociar-se em células individuais por pipetagem.
8. Incubar as células durante 20 min no escuro a 4 ° C.
9. Lave as células duas vezes com 150 uL de PBS e 2% de FBS.
10. Centrifugar a placa a 1500 rpm durante 5 min e descartar o sobrenadante invertendo a placa.
11. Diluir estreptavidina em PBS e 2% de FBS como indicado para corar as células.
    • Estreptavidina conjugate para APC-Cy7 1:300
12. Adicionar 50 uL da solução a cada poço. Dissociar-se em suspensão de células individuais por pipetagem.
13. Incubar as células durante 10 min no escuro a 4 ° C.
14. Lave as células duas vezes com 150 uL de PBS e 2% de FBS.
15. Centrifugar a placa a 1500 rpm durante 5 min e descartar o sobrenadante.
16. Ressuspender as células em 100 uL de PBS e FBS 2%.
17. Adquirir amostras em FACS.

3. Enriquecimento magnético de ^Células + c-Kit

1. Preparar uma solução tampão contendo PBS, pH 7,2, 0,5% de albumina de soro bovino (BSA), e 2 mM de EDTA.
2. Ressuspender o sedimento de células de medula óssea derivado de, pelo menos, 10 ratinhos em 1 mL de solução tampão contendo c-Kit mAb conjugado a APC diluído 1:50.
3. Incubar as células durante 20 min no escuro a 4 ° C.
4. Lavar duas vezes as células com 40 mL de solução tampão.
5. Centrifugar o tubo a 1.500 rpm durante 5 min e cuidadosamente remover tele sobrenadante por aspiração. Certifique-se de não perturbar o sedimento.
6. Ressuspender o sedimento de células e adicionar 50 uL de anti-APC micropérolas para cada rato sacrificados directamente para o sedimento.
7. Misturar bem e incubar durante 20 min no escuro a 4 ° C.
8. Lave as células por adição de 40 mL de solução tampão e centrifuga-se a 1.500 rpm durante 5 min. Aspirar completamente o sobrenadante.
9. Ressuspender o sedimento de células em múltiplo de 4 mL de solução tampão de três em três ratinhos sacrificados.
10. Colocar MACS colunas LS no campo magnético de um separador de MACS adequados. Use uma coluna a cada três ratos submetidos à eutanásia.
11. Preparar colunas, por lavagem com 4 mL de solução tampão.
12. Aplicar suspensão de células para as colunas.
13. Recolher células não marcadas que passam através da coluna e lava-se com 4 mL de solução tampão. Realizar passos de lavagem, adicionando 4 ml de solução tampão de três vezes. Adicionar tampão novo quando o reservatório coluna é esvaziada.
14. Remover colunas do separador e place cada um em cima de 15 tubos mL Falcon.
15. Pipetar 4 mL de solução tampão para cada coluna. Imediatamente lavar as células magneticamente marcadas, empurrando o êmbolo para dentro da coluna.
16. Centrifugar os tubos a 1500 rpm durante 5 min e cuidadosamente remover o sobrenadante por aspiração.
17. Ressuspender cada pellet com 1 mL de solução tampão e pelotas de grupo em um único tubo de 15 mL Falcon.

4. Seleção de Células-Tronco Hematopoéticas e Lineage Progenitores comprometidos

1. Prepara-se uma mistura de mAbs dirigidos contra os marcadores de superfície que se seguem. Diluir-los, como indicado em 500 uL de PBS e FBS a 2% para corar as células.
   • CD4, CD8, CD3, CD45R, CD19, Gr1, Ter119, NK1.1 conjugado com PE-Cy5 1:200
   • c-Kit conjugado a APC 1:100
   • Sca-1 conjugada com biotina 1:50
   • CD34 conjugado com FITC 1:50
   • FcγR conjugado com PE 1:100
2. Centrifugar o tubo a partir da previoua secção a 1.500 rpm durante 5 min e cuidadosamente remover o sobrenadante por aspiração.
3. Adicionar a mistura de mAbs para o sedimento. Dissociar-se em suspensão de células individuais por pipetagem.
4. Incubar as células durante 20 min no escuro a 4 ° C.
5. Lavar duas vezes as células com 14 mL de PBS e FBS 2%.
6. Centrifugar o tubo a 1.500 rpm durante 5 min e descartar o sobrenadante.
7. Diluir estreptavidina, como indicado em 500 uL de PBS e 2% de FBS para corar as células.
   • Estreptavidina conjugada com APC-Cy7 1:300
8. Adicionar a solução para o tubo. Dissociar-se em suspensão de células individuais por pipetagem.
9. Incubar as células durante 10 min no escuro a 4 ° C.
10. Lavar duas vezes as células com 14 mL de PBS e 2% de FBS.
11. Centrifugar o tubo a 1.500 rpm durante 5 min e descartar o sobrenadante.
12. Ressuspender as células em 500 uL de PBS e FBS 2%.
13. Transferir e filtrar a suspensão de células em um tubo novo mL 5, a fim de eliminate agregados celulares que podem interferir com o processo de classificação.
14. Adicionar 5 uL de 7-AAD (usá-lo diluído 1:100) à suspensão de células a fim de excluir 7-AAD ⁺ células mortas das populações ordenados.
15. Células de classificação com um FACSAria BD de acordo com os seguintes fenótipos:
    • Células LKS: Lin ^- c-Kit ^{+ Sca-1} +
    • LT-HSCs: LKS CD34 ^-
    • ST-HSCs: LKS CD34 ⁺
    • BPF: lin ^- c-Kit ⁺ Sca-1 FcγR ^{baixa alta} CD34 ⁺
    • Deputados: lin ^- c-Kit ⁺ Sca-1 FcγR ^{baixo baixo} CD34 ^-
    • CMPs: lin ^- c-Kit ⁺ Sca-1 FcγR ^{baixo baixo} CD34 ⁺

5. Os resultados representativos

A Figura 1 mostra e exemplo do procedimento gating electrónico paraA pontuação comuns progenitores linfóides (CLPs) como Lin ^- / c-Kit ^Io / interleucina (IL)-7R ^{+ de} células; Lin ^- / c-kit ⁺ / Sca-1 ⁺ (LKS) e Lin ^- / c-Kit ⁺ / Sca -1 ^{Lo (c-kit} +) células, a partir do c-Kit ⁺ portão, comuns progenitores mielóides (CMPS) são identificadas como FcγR ^Io células ^CD34 +, progenitores de granulócitos / monócitos (BPF) como FcγR ^hi células ^CD34 + e megacariócitos / progenitores de eritrócitos (MPE) como FcγR ^eis CD34 ^- células; a partir do portão LKS, LT-HSC e ST-HSC são identificados como CD34 ^- e células CD34 ^+, respectivamente. Esta suspensão de células de medula óssea pode ser enriquecida para ^células + c-Kit com esferas magnéticas (Fig. 2); LT-HSC e ST-HSC pode então ser classificados de acordo com a expressão de CD34, bem como outras células progenitoras de acordo com o fenótipo descrito acima.

HSCs pode ser ana lisados ​​em microscopia confocal de imagem ao vivo, como mostrado na Figura 4, onde CD34 ^- células foram coradas com o composto de nucleótidos de ligação quinacrina ^11, bem como nuclear vermelho (DRAQ5). Em HSCs, mas não BPF, quinacrina-positivas vesículas são visíveis na ¹² citoplasma. Além disso, HSCs ordenados pode ser utilizado em experiências funcionais, tal como demonstrado na figura 5, que mostra o aumento em Ca ^{2 +} citosólico em LT-HSC pela activação dos receptores purinérgicos P2 após a exposição a adenosina-trifosfato (ATP) e ionomicina ^12.

Figura 1. Representante análise gráfico de pontos de Lin-BM células. Procedimento gating electrónico no citómetro de fluxo para identificar e marcar progenitores hematopoiéticos e HSCs de suspensão de células de medula óssea coradas como descrito no texto de protocolo.

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Figura 2. Um esquema para o enriquecimento selectivo de ^células + c-kit da medula óssea.

Figura 3 análise do ciclo celular de LKS fechados eletronicamente CD34 ^-. HSCs em controles normais e ratos com IBD corados com o anticorpo Ki-67 e DAPI. As células foram fixadas e permeabilizadas com Lyse / Fix e Perm buffers seguida de coloração com conjugado com FITC Ki-67 e DAPI menos 1 ug / ml. Ciclismo células são mal se em tudo detectável no LKS CD34 ^- HSCs compartimento de controles saudáveis ^​​12.

. Figura 4 Viva microscopia confocal da imagem FACS classificadas CD34 ^- HSCs e BPF coradas com a quinacrina composto nucleotide-binding e vermelho nuclear (DRAQ5). Os quadrantes mostram pequenas quinacrina posvesículas tivo detectada no citoplasma das HSCs mas não GMPs.

Figura 5. Citosólica de Ca ^{2 +} elevações na HSCs ordenados carregadas com Fura-2 e estimuladas com ATP e ionomicina. Traços de células individuais são mostrados. Todas as células foram responsivos à ATP extracelular mostrando um aumento proeminente na citosólica de Ca ^{2 +} após a adição de ATP.

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Discussão

O método aqui descrito permite a análise rápida e precisa da hematopoiese em ratinhos individuais (Figura 1). Esta análise em várias configurações experimentais, incluindo modelos murinos de inflamação, auto-imunidade, imunodeficiências, doenças degenerativas, doenças metabólicas e câncer, permite abordar o impacto de condições patológicas na hematopoiese. Figura 3 mostra a análise da atividade de ciclo celular em LKS eletronicamente fechados CD34 ^-

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo
RPMI 1640	Gibco	42401
MEM NEAA 100X	Gibco	11140
Piruvato de sódio	Gibco	11360
PenStrep	Gibco	15070
PBS	Gibco	20012
FBS	Gibco	16000
Célula Filtro 40 mM	BD Falcon	352340
7-AAD Solução de coloração	BD Pharmingen	559925
Lyse / Fix tampão	BD Pharmingen	558049
Perm tampão III	BD Pharmingen	558050
Ki-67	BD Pharmingen	556026
DAPI	Invitrogen	D21490
CD4 (GK1.5)	eBioscience	150041
CD8 (53-6,7)	eBioscience	150081
CD3 (145-2C11)	eBioscience	150031
CD45R (RA3-6B2)	eBioscience	150452
CD19 (6D5)	eBioscience	150193
Gr1 (RB6-8C5)	eBioscience	155931
Tre119 (TER-119)	eBioscience	155921
NK-1.1 (PK136)	eBioscience	455941
c-Kit (2B8)	eBioscience	171171
Sca-1 (D7)	eBioscicia	135981
CD34 (RAM34)	eBioscience	110341
FcγR (2.4G2)	eBioscience	553145
Anti-APC micropérolas	Miltenyi Biotec	130-090-855
Colunas LS	Miltenyi Biotec	130-042-401