Alterações de monitoramento da concentração de cálcio intracelular e eficácia sináptica no Molusco<em&gt; Aplysia</em

Resumo

Demonstramos como alterações na concentração do cálcio intracelular livre e eficácia sináptica podem ser monitorizados simultaneamente num gânglio de preparação Aplysia. Nós imagem de cálcio intracelular utilizando um corante fluorescente, o laranja de cálcio, e induzir e controlar a transmissão sináptica, com cortantes (intracelular) eléctrodos.

Resumo

Tem sido sugerido que alterações no cálcio intracelular mediar a indução de um certo número de importantes formas de plasticidade sináptica (facilitação, por exemplo homossináptica significa) ^1. Estas hipóteses podem ser testadas simultaneamente monitorizar alterações de cálcio intracelular e alterações na eficácia sináptica. Nós demonstrar como este pode ser realizado através da combinação de imagens com as técnicas de gravação de cálcio intracelulares. Nossos experimentos são realizados em um gânglio vestibular do molusco Aplysia californica. Esta preparação tem um número de características vantajosas, experimentalmente: Ganglia pode ser facilmente removido do Aplysia e experimentos usar neurónios adultos que fazem conexões sinápticas normais e têm uma distribuição normal do canal de iões. Devido à baixa taxa metabólica do animal, e as temperaturas relativamente baixas (14-16 ° C) que são naturais para Aplysia, as preparações são estáveis ​​durante longos períodos de tempo. > ent "Para detectar alterações de cálcio intracelular livre, vamos utilizar a versão celular impermeante de cálcio Orange ^2, que é facilmente" carregado "em um neurônio através de iontoforese. Quando este corante fluorescente de comprimento de onda longo liga ao cálcio, aumenta a intensidade de fluorescência. cálcio Orange tem rápidas propriedades cinéticas ³ e, ao contrário de corantes raciométrica (por exemplo, Fura 2), não requer nenhuma roda de filtros para imagens. É bastante foto estável e menos fototóxica do que outros corantes (por exemplo, fluo-3) ^2,4. Assim como todos os não-raciométrica corantes, cálcio Laranja indica alterações relativas na concentração de cálcio. Mas, uma vez que não é possível em conta as variações na concentração de corante, devido às operações de carga e de difusão, que não pode ser calibrado para proporcionar as concentrações de cálcio absolutos.

Uma posição vertical, fixo platina do microscópio composto, foi utilizado para os neurónios de imagem com uma câmara CCD capaz de gravação de cerca de 30 quadros por segundo. Em Aplysia esta resolução temporalé mais do que adequada para detectar mesmo um único pico de alteração induzida na concentração de cálcio intracelular. Eletrodos pontiagudos são simultaneamente usado para induzir e gravar a transmissão sináptica em neurônios identificados pré e pós-sináptica. Na conclusão de cada teste, um script personalizado combina eletrofisiologia e dados de imagem. A fim de assegurar a sincronização adequada usamos um pulso de luz a partir de um diodo emissor de luz montado na porta da câmara do microscópio. Manipulação dos níveis de cálcio pré-sinápticos (por exemplo, através da injeção intracelular EGTA) nos permite testar hipóteses específicas, sobre o papel do cálcio intracelular na mediação de várias formas de plasticidade.

Protocolo

1. Preparação

1. Anestesiar os animais por injecção de 75-100 ml de solução isotónica de cloreto de magnésio. O Aplysia usamos para imagiologia são geralmente 150-200 gramas e são obtidos a partir Marinus Scientific.
2. Pin o animal anestesiado para um prato coberto de cera. Agulhas de seringa funcionam bem para esta finalidade; técnicas estéreis não são necessárias. Utilizando uma pinça e tesouras brutas padrão fazer uma incisão no pé do animal e expor a massa bucal. Localizar o gânglio vestibular. Com uma tesoura de mola e pinça fina, cuidadosamente livre gânglio cortando todos os nervos vestibulares.
3. Remover o gânglio e colocá-lo

Discussão

Nós demonstramos técnicas que podem ser usadas para controlar simultaneamente a concentração de cálcio intracelular e avaliar a eficácia da transmissão sináptica. Estas técnicas são úteis para determinar o modo como diversas formas de plasticidade de curto prazo são mediados.

A formação de imagens é realizada com um microscópio de fluorescência e câmara CCD. Estes requisitos equipamentos são relativamente modestos quando comparados com a maioria funcionais de imagem set-up...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome do reagente	Companhia	Número de Catálogo	Comentário
Cálcio Laranja	Invitrogen	C-3013
EGTA	Sigma	E-4378
Cálcio kit padrão de calibração	Invitrogen	C-3008MP	útil para testar a sensibilidade e a gama dinâmica do sinal
Hexa-hidrato de cloreto de magnésio	Sigma	M0250	utilizado em solução 0,33 M de anestesiar animais

Nome Equipamento	Companhia	Comentário
FN-1 microscópio vertical fluorescência	Nikon Instruments	com Narishige ITS-FN1 etapa
NMN-21 manipuladores	Narishige	montado no palco com ímãs
CoolSNAP HQ 2 câmera CCD	Fotometria
NIS elementos AR (Versão 3.22)	Nikon Instruments	software de imagem usado para adquirir dados de fluorescência
10X/0.3w Plano Fluor objetivo	Nikon Instruments	esta lente de imersão em água tem uma longa distância de trabalho de 3,5 mm
X-Cite 120 lâmpadas de metal haleto PC	EXFO	utilizado para imagiologia de fluorescência
LS-DWL lâmpada halógena	Sumica
ET-CY3 conjunto de filtros	Tecnologia Chroma	;
Poder 1401 conversor A / D	Cambridge Electronic Design	amostragem foi feita em 3 kHz
Ponto II (Versão 7.07)	Cambridge Electronic Design	software usado para adquirir dados de eletrofisiologia
SEC-10 LX amplificador	NPI eletrônica	usado com um andar de entrada 10X
Amplificador modelo 410	Brownlee precisão	utilizado para amplificar e filtrar o sinal
WS-4	menos k Tecnologia	isolamento de vibração para imagens
plataforma de resfriamento	feitos	placa de metal através do qual é bombeada água gelada, a uma taxa variável