Cromossomo Preparação a partir de células cultivadas

Resumo

Os cromossomas podem ser isolados a partir de células vivas, tais como linfócitos ou fibroblastos de pele, e a partir de organismos, incluindo seres humanos ou ratinhos. Estas preparações cromossômicas pode ser ainda utilizado para a rotina de bandamento G e procedimentos de citogenética molecular, como a hibridização fluorescente in situ (FISH), hibridização genômica comparativa (CGH), e cariotipagem espectral (SKY).

Resumo

Análise cromossómica (citogenética) é amplamente utilizado para a detecção de instabilidade cromossoma. Quando seguido por G-faixas e técnicas moleculares como a hibridização fluorescente in situ (FISH), este ensaio tem a poderosa capacidade de analisar células individuais para as aberrações que envolvem ganhos ou perdas de partes do genoma e rearranjos envolvendo um ou mais cromossomos. Nos seres humanos, anormalidades cromossômicas ocorrem em cerca de 1 a cada 160 nascidos vivos ^1,2, 60-80% de todos os abortos espontâneos ^3,4, 10% dos natimortos ^2,5, 13% dos indivíduos com doença cardíaca congênita ^6, 3-6% dos casos de infertilidade ^2, e em muitos pacientes com atraso no desenvolvimento e defeitos de nascimento ^7. A análise citogenética de malignidade é rotineiramente utilizado por pesquisadores e clínicos, como observações de anormalidades cromossômicas clonais foram mostrados para ter tanto significado diagnóstico e prognóstico ^8,9.60; isolamento cromossomo é de valor inestimável para a terapia gênica e células-tronco de organismos, incluindo primatas não-humanos e roedores ^10-13.

Os cromossomas podem ser isolados a partir de células de tecidos vivos, incluindo os linfócitos, fibroblastos da pele, amniócitos, placenta, da medula óssea e espécimes de tumor. Os cromossomas são analisados ​​na fase metafase da mitose, quando elas são mais condensada e, por conseguinte, mais claramente visíveis. O primeiro passo da técnica de isolamento cromossoma envolve o rompimento das fibras do fuso por incubação com Colcemida, para evitar que as células de prosseguir para a fase subsequente anafase. As células são, então, tratada com uma solução hipotónica e conservados no seu estado inchado com fixador de Carnoy. As células são, então, deixada cair sobre as lâminas e pode então ser utilizado para uma variedade de procedimentos. G-bandas envolve o tratamento de tripsina seguida de coloração com Giemsa para criar luz característica e faixas escuras. O mesmo procedure para isolar os cromossomas podem ser utilizados para a preparação de células para os procedimentos, tais como hibridação in situ fluorescente (FISH), a hibridação genómica comparativa (CGH) e cariotipagem espectral (CÉU) ^14,15.

Introdução

Análise cromossômica é uma técnica convencional utilizada em todo o mundo para diagnosticar instabilidade cromossômica e rearranjos que levam a desordens genéticas e malignidade ^1,2,8,9. Além disso, uma maior resolução para o diagnóstico e pesquisa de anormalidades genéticas e adquiridas constitucionais-cancro pode ser conseguido com a combinação dos procedimentos citogenéticas clássicas e metodologias citogenética molecular, tais como hibridação in situ fluorescente (FISH), a hibridação genómica comparativa (CGH) e cariotipagem espectral (SKY) ^14,15. Mais recentemente, estas técnicas têm sido utilizadas para a avaliação de instabilidade cromossoma associado com células estaminais. Anormalidades cariotípico tais como aneuploidia de células de longo prazo cultivadas embrionárias (ES) e células estaminais adultas de vários organismos têm sido relatados por vários laboratórios. Evidências recentes comprovam que algumas linhas de células são inerentemente mais inclinados ao cromossomo instabidade, independentemente das condições de cultivo. Por esta razão, ao estabelecer e / ou manutenção de linhas de células estaminais Rhesus humano, rato, ou, análise cromossômica é recomendado como parte do processo de controle de qualidade. Muitos relatórios descrevem o aumento do interesse na utilização de rotina e citogenética molecular para monitorar a estabilidade cromossómico de células estaminais e células malignas ou vários organismos em cultura ^10-13. Estes protocolos são cada vez mais utilizados por laboratórios não genéticos para avaliação cromossômica rápida de suas células cultivadas ^13. Nós apresentamos os procedimentos básicos para a preparação do cromossoma a partir de vários tipos de células, as quais podem ser aplicadas para ambos os fins e as células clínicos e de pesquisa provenientes de vários organismos.

Protocolo

1. Cromossomo colheita de células aderentes

1. Protocolo padrão
   1. Cultivar células de acordo com as condições específicas de cultivo celular. Quando as células atingiram fase logarítmica (80% de confluência), adicionar 10 ul / ml de Colcemid com o frasco de cultura de célula. Recomenda-se um período mínimo de 2 x 10 ⁶ células.
   2. Incubar as células a 37 ° C numa atmosfera de 5% de _CO2 durante 45 min. Usando uma pipeta estéril, transferir mídia a partir de células em um tubo de 15 ml. Ponha de lado.
   3. Lavar suavemente as células por adição de 2 ml de tampão de HBSS para o balão. Tampão do redemoinho e, em seguida, retire com uma pipeta. Descarte.
   4. Adicionar 1 ml de tripsina, assegurando que cobre toda a superfície do frasco. Apenas deixar as células em tripsina durante cerca de 2 min. Uma vez que a maioria das células têm destacado, pipetar os meios de comunicação do tubo cônico de volta para as células.
   5. Transferência da suspensão de células em 10 ml de partes alíquotas em tubos de 15 mL cónicos.Centrifugar a 200 xg durante 10 min. Remover o sobrenadante e ressuspender o pellet.
   6. Adicionar 10 ml de 0,075 M de KCl, que foi pré-aquecido a 37 ° C e a pelete remanescente no tubo cónico. Tubo Vortex em velocidade média de misturar KCl e células.
   7. Incubar as células a 37 ° C durante 10 min. Centrifugar a 200 xg durante 5 min a 25 ° C. Remover o sobrenadante (até cerca de 0,5 ml restos) e ressuspender pellet.
   8. Adiciona-se cuidadosamente 5 ml de fixador de Carnoy fresco (proporção de 3:1 de metanol: ácido acético glacial) para as células, enquanto a vórtex. Em seguida, adicionar 5 ml de fixador mais sem vortex para um total de 10 ml.
   9. Centrifugar a 200 xg durante 5 min. Remover as células sobrenadante e ressuspender. Adicionar 5 ml de fixador para cada tubo.
   10. Centrifugar a 200 xg durante 5 min. Remover as células sobrenadante e ressuspender. Adicionar 5 ml de fixador para cada tubo. As células podem agora ser armazenados em 4 ° C, durante até um ano.
2. Modificação de Protocolo: harvesti cromossômicasng de linhas de células linfoblastóides
   1. Cultivar células de acordo com as condições específicas de cultivo celular. (Use o frasco adequado para a quantidade de células em cultura). Quando as células atingiram fase logarítmica (cerca de 2 dias após as células são de divisão), adicionar 10 ul / ml de Colcemid com o frasco de cultura de célula.
3. Modificação de Protocolo: colheita cromossomo do sangue total
   Fito-hemaglutinina (PHA), uma lectina a partir de derivados do feijão vermelho, é um mitogénio potente para as células T humanas ^16. 72 horas após a adição da PHA para a cultura, a cerca de 45% das células estão em fase S. Isto representa o pico de atividade mitótica, e é o ponto ideal em que a colheita para os estudos cromossômicos. Outros mitogenos como pokeweed (1-10 ug / ml) pode ser usado na análise de células B ^17,18.
   1. Coletar pelo menos 1 ml de sangue total em um tubo de heparina de sódio topo verde. Use dentro de 3 dias após a colheita. Guarde-o em sangue RT until pronto para usar.
   2. Aliquota de 0,25 mL de sangue total em 10 ml de meio RPMI completo contendo L-glutamina (20% de soro fetal bovino, 1% de penicilina / estreptomicina, 1% de fungizona, e 1% de PHA). Cultura a 37 ° C com 5% de CO _2.
4. Modificação de Protocolo: colheita cromossomo da medula óssea
   A análise citogenética de medula óssea é útil para muitas doenças hematológicas malignas como a observação de um clone cromossomicamente anormal podem constituir um diagnóstico para um tipo específico de leucemia. Estudos cromossómicas também são utilizados para avaliar a progressão da doença, tais como o aparecimento de crise explosão e resposta ao tratamento. Como as células da medula óssea estão dividindo ativamente, nenhum estímulo mitógeno é necessário ^9,19. Para leucemias agudas 24 e 48 culturas de RH também são criados.
   1. Coletar pelo menos 1 ml de medula óssea em um tubo de heparina de sódio topo verde. Aliquota de 0,25 ml de medula óssea em 10 ml de meio RPMI completo contendo L-glutamina (20% de soro fetal bovino, 1% de penicilina / estreptomicina, 1% de fungizona). Cultura a 37 ° C com 5% de CO _2.

2. Deslize Preparação e coloração sólida

Uma avaliação rápida de um slide representante irá fornecer informações sobre a qualidade da colheita, antes de continuar a novos procedimentos, tais como G-bandas, FISH, CGH, ou SKY. Alguns laboratórios preferem mancha sólida das células para a colheita rápida e avaliação cromossômica. Alternativamente, um microscópio de contraste de fase pode ser usado para esta análise. Os slides são mais bem preparados quando a umidade é de aproximadamente 50% ea temperatura ambiente (20-25 ° C).

1. Centrifugar as células a 200 xg durante 5 min a 25 ° C. Remover o sobrenadante até que apenas 0,3-0,5 ml restos mortais.
2. Após ressuspensão da pelota, suavemente as pipetas três gotas da suspensão de células a partir de uma distância de cerca de 2 em sobre uma lâmina que é inclinada num ângulo de cerca de 45 ° e permite que a suspensãorolar em todo o slide. Adicione uma grande queda de Fixação fresco de Carnoy ao slide.
3. Seque a parte de trás do slide em uma toalha de papel e, em seguida, sentar-se a deslizar para fora para secar por pelo menos 10 min. O slide deve estar completamente seca.
4. Prepare fresco Giemsa solução corante (3:1 relação de Gurr buffer e Giemsa). Colocar as lâminas em um rack de coloração. Cubra todo o slide na solução de Giemsa. Deixe as lâminas permanecem na solução de coloração, durante 5 min. Lavar as lâminas com água destilada, escorra e deixe secar ao ar.
5. Adicionar 4 gotas de Permount e uma lamela para o slide. Certifique-se de que não há bolhas sob a lamela. O excesso Permount pode ser removida com uma toalha de papel.
6. Analise as células com um microscópio de luz em 10X e 100X de ampliação. Se as células em metafase são abundantes e bem distribuídos, os restantes lâminas pode ser utilizado para outros procedimentos experimentais.

3. G-Banding Usando tripsina e Giemsa (GTG)

A tripsina é uma enzima proteolítica que desnatura histonas eucromáticos em regiões de ADN com actividade de transcrição mais elevado resultante. Após a coloração de Giemsa, estas regiões aparece como bandas claras. Cromatina altamente condensada com atividade transcricional pouca ou nenhuma (heterocromatina) terá uma grande parte de seus histonas protegidos da tripsina e, portanto, vai manchar sombriamente após coloração Giemsa. É essencial inicialmente G-banda de um slide para monitorar as condições e ajustar o tempo de tripsina se necessário, para os slides seguintes.

1. Adicionar as seguintes soluções para 4 frascos Coplin.
   Frasco # 1 = 30 mL de 1x de HBSS e 4 ml de 10x de tripsina (0,5%)
   Jar # 2 = 50 ml de HBSS 1x
   Frasco # 3 = 45 mL de HBSS e 1x 5 ml de soro fetal bovino
   Jar # 4 = 50 ml de HBSS 1x
2. Mergulhe cada slide no frasco n º 1 por 5 segundos, lavagem rápida no frasco n º 2, deixe cada slide no frasco n º 3, durante pelo menos 30 segundos, lavagem rápida no frasco n º 4, em seguida, deixar as lâminas secar.
3. Prepare fresh Giemsa solução corante (3:1 relação de Gurr buffer e Giemsa). Colocar as lâminas em um rack de coloração. Cubra todo o slide na solução de Giemsa. Deixe as lâminas permanecem na solução de coloração, durante 5 min.
4. Lavar as lâminas em água destilada na mesma ordem em que foram coradas. Permitir que as lâminas para secar por cerca de 10 min. O slide deve estar completamente seca.
5. Adicionar 4 gotas de Permount e uma lamela para o slide. Certifique-se de que não há bolhas sob a lamela. O excesso Permount pode ser removida com uma toalha de papel.
6. Analise as células com um microscópio de luz em 10X e 100X de ampliação. Ajustar tripsina temporização do resto das lâminas, com base nos resultados da primeira lâmina.

Resultados

Metáfase alta qualidade são essenciais para a análise cromossômica. Um ensaio bem sucedido produz cromossomos, que são bem espalhados e da morfologia cromossômica adequado. Cromossomos corretamente G-unido conter a luz característica e padrões de bandas escuras.

Figura 1. Uma propagação cro...

Discussão

Utilizámos o presente procedimento para o isolamento do cromossoma a partir de células de vários organismos, incluindo diferentes tipos de células obtidas a partir de humanos, macacos Rhesus, ratinhos e ratos, ^11,20-22. O protocolo padrão é fornecida, mas certas etapas principais variáveis ​​e podem ter de ser ajustados para estes diversos tipos de células. Vários passos específicos são cruciais tanto na preparação cromossômica e G-faixas para garantir a melhor qualidade possível dos result...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
KaryoMAX Colcemid	Gibco	15212-012
HBSS Buffer	Gibco	24020-117
0.5% Trypsin EDTA 10x	Gibco	15400-054
Permount	Fisher Scientific	SP15-100
Buffer Tablets "GURR"	Gibco	10580-013
Geimsa Stain	Ricca Chemical Company	3250-16
Centrifuge 5810	Eppendorf
Methanol	Caledon Laboratory Chemicals	6700130
Glacial Acetic Acid	Krackeler Scientific Inc.	11-9508-05