Cromosoma Preparazione da cellule in coltura

Riepilogo

I cromosomi possono essere isolate da cellule vive come linfociti o fibroblasti cutanei, e da organismi compresi gli esseri umani o topi. Queste preparazioni cromosomiche possono essere ulteriormente utilizzati per routine di G-banding e le procedure di citogenetica molecolare quali la ibridazione in situ fluorescente (FISH), ibridazione genomica comparativa (CGH), e cariotipo spettrale (SKY).

Abstract

Cromosoma (citogenetica) analisi è ampiamente utilizzato per il rilevamento di instabilità cromosomica. Quando seguito da G-banding e le tecniche molecolari come ibridazione in situ fluorescente (FISH), questa analisi ha la potente capacità di analizzare le singole celle per le aberrazioni che coinvolgono gli utili o le perdite di porzioni del genoma e riarrangiamenti che coinvolgono uno o più cromosomi. Negli esseri umani, anomalie cromosomiche si verificano in circa 1 ogni 160 nati vivi ^1,2, il 60-80% di tutti gli aborti spontanei ^3,4, il 10% dei nati morti ^2,5, il 13% degli individui con malattia cardiaca congenita ^6, 3-6% dei casi di infertilità ^2, e in molti pazienti con ritardo dello sviluppo e difetti di nascita ^7. Analisi citogenetica di malignità è abitualmente utilizzato dai ricercatori e clinici, come osservazioni di anomalie cromosomiche clonali hanno dimostrato di avere sia un significato diagnostico e prognostico ^8,9.60; isolamento Cromosoma è prezioso per la terapia genica e la ricerca sulle cellule staminali degli organismi inclusi primati non umani e roditori ^10-13.

I cromosomi possono essere isolate da cellule di tessuti vivi, compresi i linfociti del sangue, fibroblasti cutanei, amniociti, placenta, midollo osseo, e campioni tumorali. I cromosomi sono analizzati nella fase metafase della mitosi, quando sono più condensati e quindi più visibile. Il primo passo della tecnica di isolamento cromosoma comporta la rottura delle fibre del fuso mediante incubazione con Colcemid, per evitare che le cellule di procedere alla fase successiva anafase. Le cellule sono poi trattate con una soluzione ipotonica e conservati nel loro stato gonfio di fissativo di Carnoy. Le cellule vengono poi trascinati nella vetrini e possono quindi essere utilizzati per una varietà di procedure. G-banding comprende il trattamento tripsina seguita da colorazione con Giemsa per creare luce caratteristico e bande scure. Lo stesso procedure isolare cromosomi può essere utilizzato per la preparazione di cellule per procedure quali la ibridazione in situ fluorescente (FISH), ibridazione genomica comparativa (CGH), e cariotipo spettrale (SKY) ^14,15.

Introduzione

Analisi cromosomica è una tecnica tradizionale utilizzata in tutto il mondo per diagnosticare instabilità cromosomica e riarrangiamenti che portano a malattie genetiche e tumori maligni ^1,2,8,9. Inoltre, una risoluzione maggiore per la diagnosi e la ricerca di anomalie genetiche e costituzionali cancro acquisita può essere realizzato con la combinazione delle procedure citogenetiche classiche e metodologie citogenetiche molecolari come ibridazione in situ fluorescente (FISH), ibridazione genomica comparativa (CGH) , e cariotipo spettrale (SKY) ^14,15. Più recentemente, queste tecniche sono state utilizzate per la valutazione di instabilità cromosomica associata ricerca sulle cellule staminali. Anomalie del cariotipo come aneuploidia di cellule in coltura a lungo termine embrionali (ES) e cellule staminali di diversi organismi sono stati riportati da diversi laboratori. Recenti evidenze sostiene che alcune linee cellulari sono intrinsecamente più inclini al cromosoma instabilità indipendentemente dalle condizioni di coltura. Per questo motivo, al momento di stabilire e / o il mantenimento di linee di cellule staminali umane Rhesus, mouse, o, analisi cromosomica è raccomandata come parte del processo di controllo di qualità. Molti rapporti descrivono il crescente interesse per l'uso di routine e citogenetica molecolare per monitorare la stabilità cromosomica di cellule staminali e cellule maligne o vari organismi in coltura ^10-13. Questi protocolli sono sempre più utilizzati dai laboratori non genetici per una rapida valutazione cromosomica delle loro cellule in coltura ^13. Presentiamo nostre procedure di base per la preparazione cromosoma da vari tipi di cellule, che possono essere applicate per entrambi gli scopi e le cellule clinici e di ricerca derivati ​​da vari organismi.

Protocollo

1. Cromosoma raccolta di cellule aderenti

1. Protocollo standard
   1. Crescere le cellule in base alle specifiche condizioni di coltura delle cellule. Quando le cellule hanno raggiunto la fase logaritmica (80% di confluenza), aggiungere 10 microlitri / ml di Colcemid al pallone di coltura cellulare. Si raccomanda un minimo di 2 x 10 ⁶ cellule.
   2. Incubare le cellule a 37 ° C in un incubatore CO ₂ 5% per 45 min. Usando una pipetta sterile, trasferire file multimediali da cellule in una provetta da 15 ml. Mettere da parte.
   3. Lavare delicatamente le cellule aggiungendo 2 ml di HBSS tampone nel pallone. Tampone Swirl e poi rimuovere con una pipetta. Scartare.
   4. Aggiungere 1 ml di tripsina, assicurando che copre l'intera superficie del pallone. Lasciare solo le cellule in tripsina per circa 2 min. Una volta che la maggior parte delle cellule sono distaccato, pipettare i media nel tubo conico indietro sulle cellule.
   5. Trasferire la sospensione cellulare in aliquote da 10 ml in provette da 15 ml coniche.Centrifugare a 200 xg per 10 min. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet.
   6. Aggiungere 10 ml di 0,075 M KCl preriscaldata a 37 ° C al pellet rimasto nel tubo conico. Tubo Vortex a velocità media per mescolare KCl e le cellule.
   7. Incubare le cellule a 37 ° C per 10 min. Centrifugare a 200 xg per 5 min a 25 ° C. Rimuovere il surnatante (fino a circa 0,5 ml resti) e risospendere pellet.
   8. Aggiungere con cautela 5 ml di fissativo fresco di Carnoy (3:1 rapporto di metanolo: acido acetico glaciale) alle cellule, mentre vortex. Aggiungere quindi 5 ml più di fissativo, senza vortex per un totale di 10 ml.
   9. Centrifugare a 200 xg per 5 min. Rimuovere le cellule surnatante e sospendere nuovamente. Aggiungere 5 ml di fissativo ad ogni provetta.
   10. Centrifugare a 200 xg per 5 min. Rimuovere le cellule surnatante e sospendere nuovamente. Aggiungere 5 ml di fissativo ad ogni provetta. Le cellule possono essere conservate a 4 ° C fino ad un anno.
2. Modifica del protocollo: harvesti cromosoming di linee cellulari linfoblastoidi
   1. Crescere le cellule in base alle specifiche condizioni di coltura delle cellule. (Usa pallone appropriato per la quantità di cellule in coltura). Quando le cellule hanno raggiunto la fase logaritmica (circa 2 giorni dopo le cellule sono split), aggiungere 10 microlitri / ml di Colcemid al pallone di coltura cellulare.
3. Modifica del protocollo: Cromosoma raccolta da sangue intero
   Fitoemoagglutinina (PHA), una lectina derivato dal fagiolo rosso, è un potente mitogeno per le cellule T umane ^16. 72 ore dopo l'aggiunta di PHA alla cultura, circa il 45% delle cellule sono in fase S. Questo rappresenta il picco di attività mitotica, ed è il punto ottimale in cui per raccogliere per gli studi cromosomici. Altri mitogeni come pokeweed (1-10 mg / ml) possono essere utilizzati nell'analisi cellule B ^17,18.
   1. Raccogliere almeno 1 ml di sangue intero in una parte superiore del tubo di sodio eparina verde. Usare entro 3 giorni dopo la raccolta. Sangue Conservare a temperatura ambiente delle Nazioni Unitetil pronto all'uso.
   2. Aliquotare 0,25 ml di sangue intero in 10 ml di mezzi RPMI completo contenente L-glutammina (siero fetale bovino 20%, 1% di penicillina / streptomicina, 1% fungizone, e 1% PHA). Coltura a 37 ° C con 5% di CO _2.
4. Modifica del protocollo: Cromosoma raccolta dal midollo osseo
   Analisi citogenetica sul midollo osseo è utile in molti disturbi ematologici maligni come l'osservazione di un clone cromosomicamente anormale può essere diagnostica per un tipo specifico di leucemia. Studi cromosomiche sono utilizzati anche per valutare la progressione della malattia, come l'insorgenza di crisi blastica e risposta al trattamento. Poiché le cellule del midollo osseo sono attivamente dividono, nessuno stimolo mitogeno è necessaria ^9,19. Per le leucemie acute 24 e 48 hr culture sono anche impostati.
   1. Raccogliere almeno 1 ml di midollo osseo in una parte superiore del tubo di sodio eparina verde. Aliquotare 0,25 ml di midollo osseo in 10 ml di mezzi RPMI completo contenente L-glutammina (20% di siero bovino fetale, 1% di penicillina / streptomicina, 1% fungizone). Coltura a 37 ° C con 5% di CO _2.

2. Presentazione Preparazione e colorazione Solid

Una rapida valutazione di una diapositiva rappresentante fornirà informazioni sulla qualità del raccolto prima di procedere ad ulteriori procedure come G-banding, FISH, CGH, o SKY. Alcuni laboratori preferiscono macchia solida alle cellule per la raccolta rapida e la valutazione dei cromosomi. In alternativa, un microscopio a contrasto di fase può essere utilizzata per questa analisi. I vetrini sono meglio preparati quando l'umidità è circa il 50% e la temperatura ambiente (20-25 ° C).

1. Centrifugare le cellule a 200 xg per 5 min a 25 ° C. Rimuovere il surnatante fino a soli 0,3-0,5 ml resti.
2. Dopo aver risospeso delicatamente i pellet, pipette tre gocce della sospensione di cellule da una distanza di circa 2 in su un vetrino che è inclinato di un angolo di circa 45 ° e consentire la sospensionerotolare attraverso la diapositiva. Aggiungere una grossa goccia di fissativo fresco di Carnoy alla diapositiva.
3. Asciugare il retro del vetrino su un tovagliolo di carta e poi sedersi il vetrino ad asciugare per almeno 10 min. La slitta deve essere completamente asciutto.
4. Preparare fresco Giemsa soluzione (rapporto 3:1 di Gurr Buffer e Giemsa). Porre i vetrini in un rack per colorazione. Coprire l'intera diapositiva nella soluzione colorante Giemsa. Lasciare che i vetrini rimangono nella soluzione colorante per 5 min. Sciacquare i vetrini con acqua distillata, drenare, e lasciare asciugare.
5. Aggiungere 4 gocce di Permount e un vetrino alla diapositiva. Assicurarsi che non vi siano bolle sotto il vetrino. L'eccesso Permount può essere rimosso con un tovagliolo di carta.
6. Analizzare le cellule con un microscopio ottico sotto 10X e 100X ingrandimento. Se le cellule in metafase sono abbondanti e ben diffusione, le diapositive rimanenti possono essere utilizzati per altre procedure sperimentali.

3. G-Banding Uso tripsina e Giemsa (GTG)

La tripsina è un enzima proteolitico che denatura istoni eucromatiche nelle regioni del DNA con l'attività trascrizionale maggiore risultante. A seguito di Giemsa, queste regioni appariranno come bande luminose. Cromatina altamente condensato con poca o nessuna attività trascrizionale (eterocromatina) avrà un gran parte delle sue istoni protette dalla tripsina e pertanto macchia scura seguente Giemsa. È essenziale inizialmente G-band una diapositiva a monitorare le condizioni e regolare la temporizzazione tripsina se necessario per le diapositive successive.

1. Aggiungere le seguenti soluzioni a 4 vaschette Coplin.
   Jar # 1 = 30 ml di 1x HBSS e 4 ml di tripsina 10x (0,5%)
   Jar # 2 = 50 ml di 1x HBSS
   Jar ° 3 = 45 ml di 1x HBSS e 5 ml di siero fetale bovino
   Jar # 4 = 50 ml di 1x HBSS
2. Immergere ogni diapositiva in Jar # 1 per 5 secondi, rapido risciacquo in Jar # 2, lasciare ogni diapositiva in Jar # 3 per almeno 30 secondi, rapido risciacquo in Jar # 4 poi permettono vetrini si asciughino.
3. Preparare fresh Giemsa colorazione Solution (rapporto 3:1 di Gurr Buffer e Giemsa). Porre i vetrini in un rack per colorazione. Coprire l'intera diapositiva nella soluzione colorante Giemsa. Lasciare che i vetrini rimangono nella soluzione colorante per 5 min.
4. Sciacquare i vetrini in acqua distillata nello stesso ordine in cui erano macchiate. Lasciare i vetrini ad asciugare per circa 10 min. La slitta deve essere completamente asciutto.
5. Aggiungere 4 gocce di Permount e un vetrino alla diapositiva. Assicurarsi che non vi siano bolle sotto il vetrino. L'eccesso Permount può essere rimosso con un tovagliolo di carta.
6. Analizzare le cellule con un microscopio ottico sotto 10X e 100X ingrandimento. Regolare la temporizzazione tripsina del resto delle diapositive sulla base dei risultati della prima slitta.

Risultati

Spread metafase alta qualità sono essenziali per l'analisi cromosomica. Un test riuscito produce cromosomi che sono ben diffuse e di adeguata morfologia cromosoma. Cromosomi Correttamente G-banda contengono la luce caratteristico e modelli di bande scure.

Figura 1. Una diffusione cromosomico suc...

Discussione

Abbiamo utilizzato il presente procedimento per il cromosoma isolamento da cellule di vari organismi, tra cui vari tipi di cellule ottenute da umano, macachi Rhesus, ratti e topi ^11,20-22. Il protocollo standard è disponibile, ma alcuni passaggi chiave e variabili potrebbe essere necessario regolare per questi diversi tipi di cellule. Diversi passaggi specifici sono cruciali sia nella preparazione cromosomica e G-bande per garantire la migliore qualità dei risultati. Una delle variabili che possono influenz...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
KaryoMAX Colcemid	Gibco	15212-012
HBSS Buffer	Gibco	24020-117
0.5% Trypsin EDTA 10x	Gibco	15400-054
Permount	Fisher Scientific	SP15-100
Buffer Tablets "GURR"	Gibco	10580-013
Geimsa Stain	Ricca Chemical Company	3250-16
Centrifuge 5810	Eppendorf
Methanol	Caledon Laboratory Chemicals	6700130
Glacial Acetic Acid	Krackeler Scientific Inc.	11-9508-05