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요약

염색체는 림프구 나 피부 섬유 아 세포 등 살아있는 세포에서 분리하고, 인간이나 쥐 등의 유기체에서 할 수있다. 이러한 염색체의 준비는 더 일상 G 밴딩과 같은 현장 하이브리드(물고기)의 형광, 비교 게놈 교잡 (CGH) 및 스펙트럼 핵형 분석 (SKY) 등의 분자 세포 유전 학적 과정에 활용 될 수있다.

초록

염색체 (염색체) 분석에 널리 염색체 불안정성의 검출에 사용된다. G-밴딩과 같은 현장 하이브리드(물고기)의 형광 등의 분자 기술에 의해 다음 경우,이 분석은 하나 이상의 염색체를 포함하는 게놈 재 배열 부분의 이익 또는 손실을 포함 수차에 대한 개별 세포를 분석 할 수있는 강력한 기능을 가지고 있습니다. 인간의 염색체 이상이 약 1 160 명당 1, 2, 모든 유산 60 ~ 80 %가 발생하는 3,4, 사산의 10 % 2,5, 선천성 심장 질환 6 3-6 %를 개인의 13 % 불임의 경우 2, 발달 지연과 출생 결함 (7)을 가진 많은 환자에서. 클론 염색체 이상을 관찰 모두 진단 및 예후 중요성 8,9이 표시되었습니다로 악성 종양의 세포 유전 학적 분석은 정기적으로, 연구자와 임상의에 의해 사용된다.60, 염색체 분리는 유전자 치료에 대한 소중하고 인간이 아닌 영장류와 설치류 10-13를 포함하여 생물의 줄기 세포 연구.

염색체는 혈액 림프구, 피부 섬유 아세포, amniocytes, 태반, 골수, 종양 표본을 포함한 살아있는 조직의 세포로부터 단리 할 수​​있다. 그들이 가장 응축 때문에 더 명확하게 볼 수 있습니다 때 염색체는 유사 분열의 중기 단계에서 분석된다. 염색체 분리 기술의 첫번째 단계는 후속 anaphase 단계로 진행하는 세포를 방지하기 Colcemid 함께 인큐베이션 스핀들 섬유의 파괴를 수반한다. 세포는 그 다음 저장성 용액으로 처리하고 Carnoy의 고착성과의 팽윤 상태로 보존된다. 세포는 그 다음 슬라이드에 떨어 된 후 다양한 절차에 이용 될 수있다. G-밴딩이 특징 빛과 어둠 밴드를 만들 지엠 사 (Giemsa)로 염색 한 다음 트립신 처리를 포함한다. 같은 홍보염색체를 분리 ocedure는 원위치 혼성화 (FISH) 형광, 비교 게놈 혼성화 (CGH) 및 스펙트럼 핵형 (SKY) 14,15 같은 절차에 대한 세포의 제조에 사용될 수있다.

서문

염색체 분석은 염색체 불안정성과 유전 질환 및 악성 종양의 1,2,8,9로 이어지는 재 배열을 진단하기 위해 전 세계적으로 이용되는 기존의 기술입니다. 또한, 헌법과 암 획득 유전자 이상을 진단 및 연구에 대한 높은 해상도는 형광 제자리 교잡 (FISH)와 같은 고전적인 세포 유전 학적 절차 및 분자 유전 학적 방법의 조합, 비교 게놈 교잡 (CGH)을 달성 할 수 있습니다 그리고 스펙트럼의 핵형 분석 (SKY) 14, 15. 더 최근에, 이러한 기술은 줄기 세포 연구와 관련된 염색체 불안정성의 평가에 이용되어왔다. 이러한 장기 배양 된 배아 세포 (ES)와 다양한 생물의 성체 줄기 세포의 이수성으로 핵형 이상은 여러 실험실에서보고되었다. 최근의 증거는 어떤 세포주가 본질적으로 염색체 instabi하는 경향 것을 지원에 관계없이 배양 조건의 품 질. 확립 및 / 또는 인간, 마우스 또는 히말라야 줄기 세포주를 유지하면 이러한 이유로, 염색체 분석 품질 관리 프로세스의 일부로서 추천. 많은 보고서 배양 10-13 줄기 세포 및 악성 세포 또는 다양한 유기체의 염색체 안정성을 모니터링 루틴 세포 유전학 및 분자의 사용에 대한 관심의 증가를 설명한다. 이러한 프로토콜은 점점 그 배양 세포 (13)의 급속한 염색체 평가에 비유 전적 연구소에서 사용되고있다. 우리는 다양한 유기체에서 파생 된 임상 및 연구 목적으로 세포 모두에 적용 할 수있는 다양한 종류의 세포에서 염색체 준비를위한 우리의 기본적인 절차를 제시한다.

프로토콜

1. 자기편 세포의 염색체 수확

  1. 표준 프로토콜
    1. 특정 세포 배양 조건에 따라 세포를 성장. 세포가 로그 단계 (80 % 컨 플루)에 도달 한 경우, 세포 배양 플라스크에 Colcemid의 10 μL / ㎖를 추가합니다. 2 × 10 6 세포의 최소 권장합니다.
    2. 45 분 동안 5 % CO 2 배양기에서 37 ° C에서 세포를 품어. 멸균 피펫을 사용하여, 15 ML 원뿔 튜브에 세포에서 미디어를 전송할 수 있습니다. 옆으로 설정합니다.
    3. 조심스럽게 플라스크에 HBSS 버퍼 2 ㎖를 추가하여 세포를 씻으십시오. 소용돌이 버퍼링 한 후 피펫을 사용하여 제거합니다. 폐기하십시오.
    4. 이 플라스크의 전체 표면을 커버 것을 보장, 트립신 1 ML을 추가합니다. 약 2 분 동안 트립신의 세포를 둡니다. 세포의 대다수가 분리 한 후에 다시 셀에 원추형 튜브 미디어 피펫.
    5. 15 ML 원뿔 튜브에 10 ㎖ 분량 씩에 세포 현탁액을 전송합니다.10 분 200 XG에 원심 분리기. 상층 액을 제거하고 펠렛을 재현 탁.
    6. 원뿔 튜브에 남아있는 펠릿에 37 ° C에 데워진 된 0.075 M의 KCl 10 ㎖를 추가합니다. 의 KCl과 세포를 혼합하는 중간 속도의 소용돌이 관.
    7. 10 분 동안 37 ° C에서 세포를 품어. 25 ℃에서 5 분 200 XG에 원심 분리기 과에 resuspend 펠렛 (약 0.5 ml의 유적까지) 뜨는을 제거합니다.
    8. 소용돌이로 교반하면서 세포 : 조심스럽게 신선한 Carnoy의 정착액 5 ㎖ (빙초산, 메탄올의 비율은 3:1)를 추가합니다. 그런 다음 10 ㎖의 총 텍싱없이 정착보다 5 ㎖를 추가합니다.
    9. 5 분 200 XG에 원심 분리기. 뜨는에 resuspend 세포를 제거합니다. 각 튜브에 정착의 5 ML을 추가합니다.
    10. 5 분 200 XG에 원심 분리기. 뜨는에 resuspend 세포를 제거합니다. 각 튜브에 정착의 5 ML을 추가합니다. 세포는 지금까지 1 년에 4 ° C에 저장할 수 있습니다.
  2. 의정서 수정 : 염색체 harvesti임파 세포 라인의 NG
    1. 특정 세포 배양 조건에 따라 세포를 성장. (사용은 세포가 배양되는 금액에 대해 적절한 플라스크). 세포가 로그 단계 (세포가 분할되어 대략 2 일 후)에 도달하면, 세포 배양 플라스크에 Colcemid의 10 μL / ㎖를 추가합니다.
  3. 의정서 수정 : 전체 혈액에서 염색체 수확
    피토 헤 마글 루티 닌 (PHA)는 빨간색 신장 콩에서 유래 된 렉틴은, 인간 T-세포 (16)에 대한 강력한 유사 분열 물질이다. 72 시간 배양에 PHA의 첨가 후, 세포의 약 45 %는 S 단계에있다. 이 피크 유사 분열 활동을 대표하는, 염색체 연구에 수확하는 최적의 지점입니다. B 세포에게 17,18 분석시 등의 pokeweed (1-10 ㎍ / ㎖)와 같은 다른 유사 분열 물질이 사용될 수있다.
    1. 녹색 정상 나트륨 헤파린 튜브에 전체 혈액의 적어도 1 ㎖를 수집합니다. 수집 후 3 일 이내에 사용하십시오. RT UN에서 보관 혈액사용할 준비가 나타나기 전까지는.
    2. 분취 L-글루타민 (20 % 소 태아 혈청, 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신, 1 % fungizone 및 1 % PHA)를 함유하는 완전 RPMI 매체 10ml에 전혈 0.25 밀리리터. 5 % CO 2와 37 ° C에서 문화.
  4. 의정서 수정 : 골수에서 염색체 수확
    염색체 이상 클론의 관찰이 백혈병의 특정 유형에 대한 진단 할 수 있으므로 골수에서 세포 유전 학적 분석은 많은 악성 혈액 질환에 도움이됩니다. 염색체 연구는 또한 폭발의 위기와 치료에 대한 반응의 증상으로 질병의 진행을 평가하는 데 사용됩니다. 골수 세포는 활발하게 분열하고 있기 때문에, 어떠한 미토 겐 자극 9,19 필요 없다. 급성 백혈병의 경우 24, 48 시간 배양도 설정되어 있습니다.
    1. 녹색 정상 나트륨 헤파린 관에서 골수의 최소 1 ㎖를 수집합니다. L-글루타민 (2을 함유하는 완전 RPMI 매체 10ml에 골수의 분취 0.25 밀리리터0 % 소 태아 혈청, 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신, 1 % fungizone). 5 % CO 2와 37 ° C에서 문화.

2. 슬라이드 준비 및 고체 염색

한 대표 슬라이드의 신속한 평가는 G-밴딩, FISH, CGH, 또는 SKY로 추가 절차를 계속하기 전에 수확의 품질에 대한 정보를 제공합니다. 일부 연구소는 고체 얼룩에 빠른 수확 및 염색체 평가를위한 세포를 선호합니다. 대안 적으로, 위상차 현미경은이 분석을 위해 사용될 수있다. 슬라이드는 유용한 습도가 약 50 % 일 때 제조 및 주위 온도 (20-25 ℃)된다.

  1. 25 ℃에서 5 분 200 XG에서 세포를 원심 분리기 만 0.3 ~ 0.5 ㎖의 유적까지 뜨는을 제거합니다.
  2. 야간 부드럽게 약 45 °의 각도로 기울어 및 현탁액이 허용되는 슬라이드에 대해 2의 거리에서 세포 현탁액의 펠릿, 피펫 세 방울을 재현 탁슬라이드 가로 질러. 슬라이드에 신선한 Carnoy의 정착액의 하나의 큰 방울을 추가합니다.
  3. 종이 타월에 슬라이드 뒷면을 건조 후 적어도 10 분 동안 건조 밖으로 슬라이드를 앉아. 슬라이드가 완전히 건조해야한다.
  4. 신선한 지엠 사 (Giemsa) 염색 솔루션 (Gurr 버퍼와 지엠 사 (Giemsa) 얼룩의 비율은 3:1)를 준비합니다. 염색 랙에 슬라이드를 놓습니다. 지엠 사 (Giemsa) 염색 용액에 슬라이드 전체를 커버. 슬라이드가 5 분 동안 염색 용액에 남아 보자. 증류수로 슬라이드를 씻어 흘려 공기 건조 할 수 있습니다.
  5. 4 글라스를 덮고 퍼 마운트로 봉입 방울과 슬라이드 커버 슬립을 추가합니다. 확실히 커버 슬립 아래에 기포가 없는지 확인합니다. 초과 글라스를 덮고 퍼 마운트로 봉입는 종이 타월로 제거 할 수 있습니다.
  6. 10X 및 100X 확대에 따라 광학 현미경으로 세포를 분석 할 수 있습니다. 중기 세포가 풍부하고 잘 확산되는 경우에, 나머지 슬라이드는 다른 실험 절차를 위해 사용될 수있다.

3. G-밴딩 트립신과 지엠 사 (Giemsa) (GTG)를 사용하여

트립신 높은 전사 활동의 결과로 DNA의 지역에서 실 염색질 (euchromatin) 히스톤을 변성 단백질 분해 효소이다. 지엠 사 (Giemsa) 염색 후,이 지역은 빛 밴드로 나타납니다. 거의 또는 전혀 전사 활동 (이질)와 매우 응축 된 염색질은 트립신 보호의 히스톤의 큰 부분이있을 것이다, 따라서 지엠 사 (Giemsa) 염색 다음 어둡게 얼룩 것입니다. 그것은 처음에 G-밴드 하나의 슬라이드에 조건을 모니터링하고 필요한 경우 후속 슬라이드의 트립신의 타이밍을 조절하는 것이 필수적입니다.

  1. 4 코 플린 단지에 다음과 같은 솔루션을 추가합니다.
    항아리 # 1 1X HBSS의 = 30 ㎖ 및 10 배 트립신 4 ㎖ (0.5 %)
    1X HBSS의 항아리 # 2 = 50 ㎖
    항아리 # 3 = 1X HBSS 45 ㎖ 및 소 태아 혈청 5 ㎖
    1X HBSS의 항아리 # 4 = 50 ㎖
  2. 5 초 동안 단지 1 위의 각 슬라이드, 항아리 # 2의 빠른 헹굼을 담가, 적어도 30 초 동안 항아리 # 3 항아리 # 4 빠른 헹굼을 각 슬라이드를 떠나 다음 슬라이드를 건조 할 수 있습니다.
  3. 청정제를 준비H 지엠 사 (Giemsa) 염색 솔루션 (Gurr 버퍼와 지엠 사 (Giemsa) 얼룩의 비율은 3:1). 염색 랙에 슬라이드를 놓습니다. 지엠 사 (Giemsa) 염색 용액에 슬라이드 전체를 커버. 슬라이드가 5 분 동안 염색 용액에 남아 보자.
  4. 그들은 더러워졌다 동일한 순서로 증류수에 슬라이드를 헹군다. 슬라이드를 약 10 분 동안 건조하도록 허용합니다. 슬라이드가 완전히 건조해야한다.
  5. 4 글라스를 덮고 퍼 마운트로 봉입 방울과 슬라이드 커버 슬립을 추가합니다. 확실히 커버 슬립 아래에 기포가 없는지 확인합니다. 초과 글라스를 덮고 퍼 마운트로 봉입는 종이 타월로 제거 할 수 있습니다.
  6. 10X 및 100X 확대에 따라 광학 현미경으로 세포를 분석 할 수 있습니다. 첫 번째 슬라이드의 결과에 기초하여 슬라이드의 나머지의 트립신 타이밍을 조정한다.

결과

고품질 중기 스프레드 염색체 분석을 위해 필수적입니다. 성공적인 분석이 잘 확산 적합한 염색체 형태의있다 염색체를 얻을 수 있습니다. 제대로 G-밴드 염색체는 특성 밝은 부분과 어두운 줄무늬 패턴이 포함되어 있습니다.

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그...

토론

우리는 다양한 인간에서 얻은 세포 유형, 붉은 털 원숭이, 쥐, 생쥐 11,20-22 등 다양한 생물의 세포에서 염색체 분리를위한 본 절차를 이용했다. 표준 프로토콜은 제공되지만, 특정 주요 단계와 변수는 세포의 이러한 다양한 유형의 조정해야 할 수도 있습니다. 몇몇 특정 단계 염색체 제제 및 결과의 최상의 품질을 보장​​하기 위해 G-밴딩 모두에 중요하다. 분석에 영향을 미칠 수있는 변?...

공개

저자가 공개하는 게 없다.

감사의 말

이 논문에서 설명하는 작업은 패트릭 F. 테일러 재단의 자금에 의해 가능하게되었다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
KaryoMAX ColcemidGibco15212-012
HBSS BufferGibco24020-117
0.5% Trypsin EDTA 10xGibco15400-054
PermountFisher ScientificSP15-100
Buffer Tablets "GURR"Gibco10580-013
Geimsa StainRicca Chemical Company3250-16
Centrifuge 5810Eppendorf
MethanolCaledon Laboratory Chemicals6700130
Glacial Acetic AcidKrackeler Scientific Inc.11-9508-05

참고문헌

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