Síntese e Operação de Fluorescente-core microcavidades de Sensoriamento refractométricos

Resumo

Os sensores fluorescentes de núcleo microcavidade empregar um alto índice de revestimento quantum dot-no canal de sílica microcapilares. As mudanças no índice de refracção dos fluidos bombeados para a causa do canal capilar se desloca no espectro de fluorescência microcavidade que pode ser utilizado para analisar o meio do canal.

Resumo

Este artigo discute fluorescentes núcleo microcavidade sensores baseados em que podem operar em uma configuração de análise de microfluídica. Estas estruturas são baseadas na formação de um fluorescente quantum dot-revestimento (QD) sobre a superfície de canal de um microcapilar convencional. QDs silício são especialmente atractivo para esta aplicação, devido em parte à sua toxicidade insignificante comparado com o II-VI e QDs II-VI compostos, os quais são controlados legislativamente substâncias em muitos países. Embora o espectro de emissão conjunto é ampla e sem características, uma película de Si-QD na parede do canal capilar de Características de um conjunto de cortantes, picos estreitos no espectro de fluorescência, que corresponde às ressonâncias electromagnéticas de luz aprisionada dentro do filme. O comprimento de onda de pico de estas ressonâncias é sensível ao meio externo, permitindo assim que o dispositivo funcione como um sensor refractométrico em que nunca os QDs entrar em contacto físico com o analito. O experimentalmétodos associados com a fabricação do microcapilares fluorescente de núcleo são discutidos em detalhe, assim como os métodos de análise. Por fim, é feita uma comparação entre as estruturas e as mais amplamente investigada líquido do núcleo de anéis ópticos ressonadores, em termos de capacidades de detecção microfluidicos.

Introdução

Sistemas de detecção químicos que requerem volumes de amostra apenas pequenas e que podem ser incorporadas em dispositivos portáteis ou campo-operável poderia levar ao desenvolvimento de uma ampla gama de novas tecnologias. Essas tecnologias podem incluir o diagnóstico no campo de doenças e patógenos, contaminantes ambientais ^{1, 2} e segurança alimentar. ³ Várias tecnologias estão sendo ativamente explorada para sensores químicos microfluídicos, com dispositivos baseados na física de ressonâncias de plasmons de superfície (SPR) entre os mais avançados. ⁴ Estes sensores são agora capazes de detectar várias biomoléculas específicas e obtiveram sucesso comercial, embora principalmente em larga escala equipamento de laboratório. ⁵

Em anos recentes, têm aumentado microcavidades ópticas para competir com os sistemas baseados em SPR. Microcavidades pode ser incrivelmente sensível, com a capacidade demonstrada para detectar vírus individuais ⁶ e talvez até biomoléculas individuais 7 (este último continua a ser objecto de algum debate, ⁸ porém, não há dúvida de que os limites de detecção em massa são ⁹ pequeno). Em microcavidades, o mecanismo de detecção baseia-se em alterações nas ressonâncias ópticos devido à presença de um analito no interior do perfil do campo eléctrico da ressonância. Tipicamente, para um dado analito irá causar a ressonância de mudar no em frequência central, a visibilidade, ou a largura de linha. Tal como acontece com os sistemas de SPR, de microcavidades podem actuar como não específicos refractométricos sensores, ou como biossensores funcionalizados para uma análise específica.

Microestruturas dielétricas com uma secção circular (por exemplo, microesferas, discos ou cilindros) são caracterizadas por ressonâncias eletromagnéticas conhecidas como os modos Galeria sussurrando, ou WGMS, um termo que remonta a investigações Senhor Rayleigh de efeitos acústicos análogos. ¹⁰ Essencialmente, um WGM óptica ocorre quando uma onda circumnavigates a circular sexão por reflexão total interna, e retorna para o seu ponto de partida na fase. Um exemplo de uma ressonância electromagnética, para uma microesfera de sílica encontra-se ilustrada na figura 1a. Esta ressonância é caracterizado por um máximo na direcção radial (n = 1), enquanto que um total de 53 comprimentos de onda se ajustar em torno do equador (l = 53), das quais apenas algumas são mostrados. A parte evanescente da intensidade de campo se estende para o meio do lado de fora do limite esfera, assim o WGM microsfera pode sentir o meio externo.

Capilares são um exemplo particularmente interessante de um sensor baseado em WGM. Em um capilar, WGMS cilíndricos podem formar em torno da secção transversal circular, semelhante ao caso de uma esfera. Se a parede do capilar é muito fina, a parte do campo electromagnético prolonga-se para dentro do canal capilar (Figura 1b). Assim, um tubo capilar pode ser um sensor de microfluidos para analitos injectados para dentro do canal. Esta é a basis de funcionamento do anel de núcleo líquido ressoador óptico (LCORR). LCORRs ¹¹ dependem do acoplamento evanescente de luz a partir de uma fonte de laser de alta precisão ajustável para sondar as WGMS. Um aspecto importante da LCORR é que as paredes capilares devem ser finos (~ 1 mm) para assegurar que as amostras de modo a meio do canal. Isto coloca algumas dificuldades no seu fabrico e faz com que sejam mecanicamente frágeis.

No nosso trabalho, nós desenvolvemos uma estrutura alternativa chamamos uma microcavidade núcleo fluorescente (FCM). ^12,13 Para formar uma FCM, que revestir as paredes do canal de um capilar com um fluoróforo elevado índice de refracção (especificamente, uma camada de óxido de silício incorporado pontos quânticos). O índice elevado da película é necessária para limitar a radiação emitida, construindo assim as WGMS (Figura 1c). Em contraste com a LCORR, num dos modos de FCM aparecem como maxima afiado em um espectro de fluorescência emitida. A espessura dapelícula é extremamente importante e, se ele for muito espesso a WGM não experimentar o meio do canal capilar, e se for muito fina o confinamento óptico é perdida e as WGMS tornam-se fracas. Assim, a fabricação de um FCM é um processo difícil, exigindo uma preparação cuidadosa. Este é o tema principal do trabalho atual.

Protocolo

1. Preparação dos Materiais

1. Microcapilares Obter capilares de sílica a partir de um fornecedor comercial. Nós compramos o nosso capilares de Polymicro Technologies. Escolha um diâmetro interno pequeno (~ 25-30 mm) para mais amplamente separados ressonâncias espectrais (ou seja, uma maior gama espectral livre) ou um diâmetro interno maior (~ 100 mm) para ressonâncias mais espaçadas com fatores de maior qualidade. Um grande diâmetro exterior garante os FCMs são duráveis ​​e facilmente manipulados.
   1. Os capilares vêm com um revestimento de poli-imida de cor, o que tem de ser removido primeiro. Cortar pedaços de aproximadamente 10 cm de capilares a partir do rolo, usando diamante fibra cutelo. Cada peça constitui uma única amostra. Aquecer estes em um forno tubular a 650 ° C durante uma hora em oxigénio para queimar o revestimento. Este processo remove o material de revestimento, expondo o capilar de sílica para dentro. Após arrefecimento até à temperatura ambiente, remover o capillaries do barco de aquecimento.
2. Hidrogénio O hidrogénio silsesquioxano soluções silsesquioxano (HSQ) é relatado como consistindo de H ₁₂ O ₁₂ Si ₈ moléculas com uma estrutura tipo gaiola ^14. Este material encontra-se comercialmente disponível a partir de Dow Corning. Adquira o HSQ em uma de suas séries Fox-(óxido de fluido) soluções, tais como raposa-15. Estas soluções são caras e têm uma vida útil limitada, por isso é necessário um planeamento cuidadoso. A evaporação do solvente MIBK proporciona uma concentração HSQ de aproximadamente 18% em peso. Se a concentração for demasiado baixa HSQ, quantum dots não podem formar-se a película. Se for demasiado alta, os filmes podem ser muito espessa e delaminate a partir da superfície do canal capilar. Na nossa experiência, para um tubo capilar com um diâmetro de 25-30 uM interior, uma solução contendo ~ Fox HSQ 25 wt.% É o melhor. Assim, pode ser necessário adicionar solvente evaporar ou mais HSQ (certificando-se de que ele é seco), a fim de ajustar oconcentração. Se uma diluição ou concentração é necessário é difícil de determinar, sem experimentação e erro, isto é fazer algumas amostras e examinar os resultados, como discutido abaixo.

2. Fabricação de Capilares Revestido

1. Enchimento capilar Pegue os pedaços de capilar preparados no passo 1,1 e mergulhe-os na solução de raposa. Quando um capilar é mergulhado na solução, deverá ser capaz de seguir visualmente o menisco se o canal, enquanto a solução é aspirada para dentro da (Figura 2a) em coluna capilar.
   1. Quando o menisco chega ao topo, remover o tubo capilar e coloque-a num cadinho de vidro de recozimento. Ela agora deve ser completamente preenchido com solução raposa. Repita este procedimento para as amostras quanto possível, para aumentar as chances de sucesso. Nós normalmente executado lotes de 20-30 e usar dois diferentes concentrações de soluções HSQ por peso. Nós encher os capilares no ar, mas t mantendoele raposa solução foi arrefecida num glovebox é recomendada, se possível, de forma a minimizar a exposição da solução a vapor de oxigénio e água. Mesmo pequenas exposições pode resultar na gelificação da solução.
2. Recozimento Hibridar os capilares em um processo de duas fases. Recozimento evapora-se o solvente e recolhe a estrutura de gaiola HSQ, formando uma película de SiO _x aderir às paredes do canal. O recozimento a temperaturas mais elevadas disproportionates o filme SiO _x em pontos quânticos Si dispersos em uma matriz de sílica. Os passos de recozimento incluir uma rampa de 30 minutos a partir da temperatura ambiente até 300 ° C, uma temporização de 3 horas para evaporar o solvente, em seguida, uma rampa para 1100 ° C em 45 min, e uma temporização de uma hora para precipitar os QDs.
   1. Deixe os capilares lentamente cool (~ 12 horas) de volta à temperatura ambiente. Isto ajuda a minimizar o stress relacionados fissuração da película depositada sobre a parede capilar. Outros protocolos de recozimento podeprovavelmente ser seguida e pode ser mais fiável, mas uma alta temperatura de recozimento na fase 1,000-1,100 ° C sempre é necessário para formar os QDs. No final desta etapa, deve-se (espera-se) ter 20-30 capilares com uma camada de QDs fluorescentes incorporado em um revestimento de matriz de sílica o canal de paredes.

3. Caracterização

1. Experimente verificar o microscópio de fluorescência em que os capilares são montados deve executar ambos imagem e espectroscopia no intervalo de comprimento de onda de 700-900 nm. Configurações de epifluorescência ou confocal são adequados para esta finalidade. Coloque uma linha do candidato capilares na fase de modo que seja fácil de mover-se entre eles por análise visual rápida (Figura 2b). Excitar o capilar com radiação azul ou UV ou em espaço livre no palco microscópio, ou diretamente através da objectiva usando um filtro dicróico, e observar a imagem de fluorescência usando as ocularesou uma câmera de cor.
   1. Observar a fluorescência capilar. Se a invenção foi bem sucedida, os capilares exibirão uma fluorescência vermelha brilhante. Esta é a primeira indicação de uma amostra favorável. Capilares exibindo fluorescência amarelo-alaranjado (em vez da cor vermelha associada aos QDs), em geral, não têm as características desejadas ópticos. Estas amostras também tendem a formar mais frequentemente em soluções com uma concentração baixa HSQ. Alguns capilares podem mostrar nenhuma fluorescência de todo; neste caso, o filme não QD e formar o tubo capilar pode ser descartado (vidro farelos). Esta é uma indicação de que a solução não pode ter sido arrastado para o tubo capilar, ou pode ter sido deficientes em HSQ. Finalmente, algumas amostras pode mostrar um filme rachado ou texturada, estes também podem ser descartados.
   2. Descartar todas as amostras mencionadas no passo anterior, excepto aqueles que apresentam a característica de fluorescência vermelha brilhante QDs silício.
2. Verificar a presença de WGMS nos espectros de fluorescência Assegurar a imagem é alinhada, conforme desejado na fenda de entrada do espectrómetro e recolher um espectro de fluorescência. Ajustar o tempo de recolha de modo a produzir uma relação de sinal-para-ruído aceitável. Executar calibrações de comprimento de onda e intensidade, conforme necessário. Os espectros QD deve ser intensa na gama de comprimento de onda de 700-900 nm. Spectra retirados da região correspondente à parede do capilar interno deve mostrar fortes oscilações, devido à presença dos modos sussurrando cilíndricas galeria (WGMS), esta é a exigência segundo ao último de um sensor de sucesso refractométrico.
   1. Algumas amostras podem ter uma fluorescência vermelha brilhante, mas QD oscilações WGM falta no espectro. Esta é uma indicação de que o filme QD rachado ou delaminada a partir da parede do capilar, que destrói as ressonâncias ópticas. Descarte capilares sem WGMS. Neste ponto, apenas a (tipicamente small fracção) de amostras que cumpram os requisitos de sensores permanecem. Há um teste final a ser executada.
3. Análise refractométrico Fixe o candidato capilares para o polietileno, tygon, teflon ou outra tubagem quimicamente compatível com as soluções de analito destinados cujo diâmetro interior deve ser ligeiramente maior do que o diâmetro capilar exterior. A escolha de tubos deve ser feita de modo a não reagir com a solução a ser bombeado para o tubo capilar.
   1. Usar um bom adesivo para fixar o capilar de vidro para o tubo, caso contrário, a interface do tubo capilar pode verter. Temos sucesso razoavelmente bom usando Norland NOA-76 ou mascote gel adesivo instantâneo. A escolha da cola depende da sua aderência ao vidro capilar e o tubo, e uma falta de reacção com os fluidos do canal. Usar o cuidado de evitar que o adesivo escorra para dentro do canal capilar, e bloqueando-o.
   2. A interface do tuboatravés de uma seringa para um sistema micropumping. Compostos com índices de refracção bem conhecidos, tais como metanol, etanol, e água pode ser usada para determinar a sensibilidade do dispositivo refractométrico. Este é o teste final de um sensor de sucesso. Bombear cada fluido, um de cada vez, para o capilar, tendo cuidado para não romper a vedação adesiva entre o capilar e o tubo (Figura 2c).
   3. Recolher os espectros com cada um dos líquidos no interior do capilar. Use um analisador no caminho da luz para distinguir entre TE-polarizados (WGMS paralelo analisador capilar eixo) e TM-polarizados WGMS (perpendicular analisador capilar eixo). Deve haver uma mudança no comprimento de onda de ressonância da WGM, ou TE ou TM, com cada solução diferente no capilar. Se não houver um desvio observável, o filme quantum dot-se muito espessa e as WGMS não suficientemente amostrar o meio do canal. Em amostras bem sucedidas observamos sensibilidades tipicamente, entre 5 e 15 nmunidade de índice de refração por solução (RIU). Quase todas as amostras que fazem WGMS mostram demonstram uma sensibilidade mensurável, no entanto, tipicamente, apenas uma pequena fracção dos capilares preparadas mostrará WGMS.

4. Análise de Dados

1. A obtenção dos espectros de fluorescência Tome um espectro de fluorescência de sua amostra. Para aplicações biosensoriamento, a superfície do canal tem de ser primeiro funcionalizada para analitos específicos. A superfície da película de QD é essencialmente sílica, para muitas receitas de modificação de superfície existe. Independentemente da aplicação, o passo final é o processamento de dados e análise.
   1. Alcançar baixos limites de detecção requer medir pequenas mudanças espectrais, idealmente a "resolução mudança" deve ser significativamente menor do que a resolução espectrômetro nominal ou arremesso. Deve ser tomado cuidado no processamento espectral devido a isso. Em particular, no espectrómetro de imagem muitass o espectro pode não ser projetada perfeitamente na horizontal para o CCD, portanto, se, entre as análises, a imagem da amostra flutua verticalmente na fenda, falsas mudanças de espectro pode ser obtido. Usar todos os meios necessários para assegurar que isto não aconteça, por exemplo, usar um padrão de calibração para determinar o ângulo do espectro projectada e corrigir para ele, minimizar o desvio da amostra, e assegurar que as mesmas pixels CCD são usadas para obter todos os espectros .
      Uma imagem espectral exemplo é mostrado na Figura 3, em que os modos de aparecer como fortes oscilações em localizações correspondentes às paredes do canal. Use um Mathematica código de computador (ou o que o seu grupo prefere) para importar as imagens espectrais, a saída dos dados espectrais, 1D e realizar ajuste de curva e análise de Fourier das mudanças WGM, conforme descrito abaixo.
2. Ajuste de curva Determinar o comprimento de onda de pico WGM para medir pequenas mudanças de espectro devido a analitos in o canal FCM. Montar um único modo para uma função que descreve a forma espectral - esta é uma maneira comum de obter a posição de pico. No caso ideal, esta será uma função Lorentziana (com conversão apropriada do comprimento de onda para as unidades de frequência através δλ = │ cδf-/ f ² │ em que c é a velocidade da luz):
   
   Na equação. 1, A é ​​um parâmetro de escalonamento e f ₀ é a frequência central. Infelizmente, não FCMs são um caso ideal.
   1. Em cavidades cilíndricas são os WGMS desviada para frequências mais elevadas, devido provavelmente ao desenvolvimento de ressonâncias em espiral (WGMS com um componente diferente de zero axial do wavevector) ^15. Lorentziana cabe, por conseguinte, um mau desempenho para a determinação da posição do pico. Infelizmente, não existe qualquer função thvai caber em uma distribuição de Lorentzians sobreposição das WGMS em espiral. Em trabalhos anteriores ¹⁶ sugerimos que uma Lorentziana enviesada ¹⁷ daria um melhor ajuste:
      
      Aqui, a e B são parâmetros inclinar. Como pode ser visto na Figura 4, a equação. 2 dá um melhor ajuste aos dados do que a equação. 1, mas, infelizmente, não tem base física na teoria do WGMS.
3. A análise de Fourier mudança Alternativamente, os dados podem ser processados ​​usando uma transformada discreta de Fourier, e a fase correspondente desvios medidos a partir do espectro de Fourier. Este método tira vantagem da periodicidade de todo o espectro, em vez de usar uma única WGM arbitrária. Não mede a posição comprimento de onda, mas em vez mede uma mudança geralde um espectro WGM dada com respeito a um espectro de referência arbitrário.
   1. Utilizar a diferença de fase Δφ para o componente de Fourier de alta potência, que corresponde à oscilação WGM principal espectral para obter o deslocamento espectral. Isto corresponde a uma verdadeira mudança WGM frequência de:
      Af = Δφ (f _max - f _min) / (2πk),
      onde f e f _{min max} são os valores mínimo e máximo de frequência nos espectros. No entanto, muita informação pode ser descartada se apenas o componente principal é usado, além disso, problemas de truncamento pode tornar difícil determinar qual componente é o principal. Muitas vezes, os melhores resultados exigem alguma tentativa e erro como a que componentes de Fourier para selecionar.
   2. O teorema de mudança ao invés usa todos os componentes de Fourier. Assim, para uma mudança pura, cada componente individual é deslocado proporcional ao k (com ksendo o número de componentes). Em outras palavras, δφ _k = mk, onde a m proporcionalidade é uma medida do deslocamento real. O desvio de frequência total é, assim, dada pela fórmula:
      Af = m (f _max - f _min) / (2π).
      Isto requer m de ser obtida a partir de um ajuste linear para as diferenças de fase ΔΦ _k para alguns ou todos os componentes de Fourier.
   3. Para os dados reais, a relação linear ΔΦ _k = mk terá incerteza devido ao ruído e sinal de fundo, o que pode ter um efeito significativo nos componentes de baixa potência de Fourier. Assim, recomendamos um ajuste linear ponderada, em que o peso de cada componente é proporcional à sua potência, de modo a obter a inclinação da ΔΦ _k vs grafo k. O espectro pode ser filtrado em volta do componente principal antes da montagem, para remover ambas as frequências altas (nOise) e baixa freqüência (desacoplado fluorescência de fundo). A freqüência muda de EQ. 4 são então convertidos em unidades de comprimento de onda.
   4. Ao contrário do processo de ajuste de curva, um WGM "comprimento de onda" nunca é obtido, mas em vez disso uma mudança de comprimento de onda é medida ao longo de todo o espectro com respeito a um espectro de referência arbitrário. O procedimento é então repetido para cada espectro a ser analisado. Os passos para este processo são os seguintes:
      1. Converter o espectro em unidades de freqüência para garantir uma faixa livre espectral constante.
      2. Escolher o conjunto de dados de referência (isto é, o primeiro WGM espectro de fluorescência) a partir do qual todos os turnos será medido.
      3. Interpolar o espectro de frequência para se obter o espaçamento uniforme ^18.
      4. Realizar uma transformada discreta de Fourier para se obter os componentes de alimentação e de fase de cada espectro.
      5. Descubra as diferenças de fase para todos os k componentes de uma dada WGMespectro para a qual o valor de deslocamento for desejado, em relação ao espectro de referência.
      6. Procurar o deslocamento de fase utilizando a diferença de fase de cada um dos componentes de Fourier a principal apenas, ou um ajuste linear ponderada para os componentes seleccionados. Isto vai dar o Af deslocamento de fase ou δλ entre o espectro WGM e o espectro de referência.
      7. Os erros das mudanças de espectro (o limite de detecção) podem ser medidos por recolha de espectros repetida para o mesmo analito. Um grau de incerteza na sensibilidade pode ser obtido a partir do erro nos ajustes lineares ponderadas, se forem utilizados vários componentes.

Repita os passos 1-7 para cada análise. Embora este processo parece complicado, após a aplicação inicial, o procedimento é simples para automatizar, de modo que os conjuntos de dados grandes podem ser processados ​​em lote para encontrar os turnos. Nós usamos um código escrito especificamente Mathematica for este procedimento, para que conjuntos completos de dados podem ser processados ​​em lote "com o pressionar de um botão". Em princípio, as mudanças espectrais pode até mesmo calculado "ao vivo", apesar de não ter feito isso ainda.

Resultados

Pequenos desvios no processo de fabricação capilar pode conduzir a alterações significativas na taxa de sucesso de amostra. Na Figura 5 (anúncio), mostramos exemplos representativos de capilares falhou, assim como um sucesso. Geralmente, a indicação visual de uma amostra de sucesso é uma fluorescência vermelha combinada com uma intensidade elevada para as paredes capilares e um interior featureless. O espectro de fluorescência também indica claramente a diferença entre o sucesso eo fracasso ...

Discussão

Fluorescent-core microcavidades podem ser usados ​​como sensores de refractométricos. Embora haja exemplos isolados de "enroladas" microtubos que possam agir como sensores microfluídicos, em comparação com ²² microtubos, capilares, será mais fácil de integrar em configurações microfluidicos e têm consideráveis ​​vantagens práticas, uma vez que são facilmente manuseadas e simples para fazer a interface com uma análise configuração. Utilizando métodos de análise convencionais ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tabela de Materiais	Companhia	Catalogo	Comentários
sílica microcapilares
tubulação flexível microbore			tygon, polietileno, etc
adesivo	Mascote, Norland NOA
HSQ dissolvido em MIBK			por exemplo., Fox-15
metanol
etanol
água destilada